桃ＮＨＸ基因家族的全基因組鑒定與表達分析

李淼 李桂祥 劉偉 高曉蘭 王孝友 張安寧

摘要：本研究利用生物信息學方法從桃全基因組數據庫篩選出7個NHX反向轉運體，并對其序列特征、基因結構、進化關系、亞細胞定位、組織表達譜和鹽脅迫響應性進行綜合分析。結果表明，7個桃NHX具有清晰的親緣遠近關系;5個桃NHX（NHX1，NHX4～NHX7）基因在結構等方面具有相似性，親緣關系較近，而與NHX2和NHX3親緣關系較遠。7個桃NHX蛋白在N端具有明顯的跨膜結構區(qū)域。順式元件分析表明，桃NHX基因家族上游啟動子區(qū)域包含與光信號、激素、逆境脅迫及分生組織表達相關的順式作用元件。qRTPCR分析結果顯示，大多數桃NHX家族成員在莖中表達較多;所有桃NHX成員對外源鹽處理具有響應性。

關鍵詞：桃;NHX基因家族;全基因組;基因表達

中圖分類號：S662.1：Q781文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2021）12-0008-09

Na+/H+反向轉運體（Na+/H+ transporters，NHX）在植物耐鹽性方面發(fā)揮著重要作用[1]。NHX能將Na+（K+）區(qū)域化或排出細胞外以保持植物細胞內較低水平的Na+（K+）濃度，避免細胞受到傷害，維持其正常生理功能。NHX具有調節(jié)細胞膨壓、維持細胞Na+（K+）濃度、調節(jié)細胞內pH 值的功能，是植物耐鹽途徑的重要因子[2-5]。

擬南芥基因SOS1和NHX1是植物中最早被克隆的NHX類基因，這兩個基因分別定位于細胞的質膜和液泡膜上，分別在細胞質中Na+（K+）向胞外運輸和Na+（K+）向液泡的區(qū)域化運輸發(fā)揮著重要作用[6，7]。經研究，在多種植物中如水稻（OryzasativaLinanaeus）[8]、棉花（Gossypiumherbaceum Linanaeus）[9]、堿蓬（Suaeda glaucaBunge）[10]、柑桔（CitrusreticulataBlanco）[11]等均克隆到相應的同源基因。目前，數據庫中發(fā)現(xiàn)的植物NHX類蛋白60多個。擬南芥中NHX基因家族成員共8個（AtNHX1～AtNHX8），均參與擬南芥耐鹽代謝途徑。在鹽脅迫條件下，AtNHX1～AtNHX4定位于液泡膜上，能將Na+區(qū)隔化至液泡中[12-15];AtNHX5與AtNHX6定位在內膜體上，在調控細胞Na+（K+）、pH平衡和鉀營養(yǎng)等方面起重要作用[5，16，17];AtNHX7和AtNHX8定位于細胞膜上，參與細胞質Na+的外排代謝，是植物抵抗鹽離子毒害的首個屏障[18，19]。綜上，研究NHX基因家族的亞細胞定位情況是分析NHX基因功能的重要環(huán)節(jié)。

我國鹽堿化土地主要分布于北方及沿海地區(qū)，占全國可利用土地面積的4.88%[20]。日益嚴重的土壤鹽堿化問題嚴重影響農業(yè)生產和生態(tài)環(huán)境，如何充分利用鹽堿地資源成為農業(yè)生產發(fā)展亟需解決的問題。桃樹抗逆性強，干旱、輕度鹽堿條件下均可正常生長，解析桃樹的耐鹽分子機理和代謝途徑、培育耐鹽新品種可為桃樹在鹽堿地種植提供一條新途徑。

本研究基于桃（Amygdalusdavidiana）全基因組測序結果，對桃與耐鹽相關的Na+/H+反向轉運體NHX基因家族進行鑒定，利用生物信息學軟件對其進行分類及功能預測，并測定這些基因在植物組織的表達及受到鹽脅迫轉錄水平的變化情況，為深入揭示NHX基因家族的生物學功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料與處理

供試材料為山東省果樹研究所金牛山試驗基地5年生山桃（Amygdalusdavidiana）的各組織（根、莖、葉、花和果實）。根、莖、葉和花采樣時間是2020年3月30日，果實采樣時間是2020年7月28日。樣品于液氮中速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

鹽處理試驗離體枝條采自5年生山桃，采樣時間是2020年7月28日。取長勢一致、健康一年生枝條分為兩組：一組放入300mmol/L的NaCl鹽溶液;另一組放入清水（對照）。置于人工氣候箱中進行培養(yǎng)，設定溫度25℃，相對濕度60%左右，光照強度40μmol/（m2·s）。處理0、0.5、1.0、1.5h后取樣，每次每組隨機選取3根枝條，每根枝條取成熟葉3片立即放入液氮中冷凍，-80℃保存，用于提取RNA進行基因表達分析。

1.2 桃NHX轉錄因子的鑒定與表達分析

1.2.1 桃NHX基因家族成員的檢索 已報道文獻顯示擬南芥（ArabidopsisthalialaHeynh.）有8個AtNHXs基因成員、水稻有5個OsNHXs基因成員、胡楊（PopuluseuphraticaOliver）有6個PeNHXs基因成員。利用美國國立生物技術信息中心數據庫（NationalCenterforBiotechnologyInformation，NCBI，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）搜索上述基因的蛋白序列，利用桃基因組數據庫GDR（https：//www.rosaceae.org/）中BLASTP選項搜索比對。下載比對出的蛋白序列和對應的基因序列。將候選基因提交至InterProScan（http：//www.ebi.ac.uk/interpro/）進行結構域驗證，最終確定桃基因組NHX家族成員共7個。依據家族成員在染色體上的位置依次命名為PpNHX1～PpNHX7。

利用網站ExPASy（https：//web.expasy.org/protparam/）預測家族成員對應的等電點（pI）、不穩(wěn)定指數以及親水指數;使用在線網站TMHMMServer（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）和軟件IBS（http：//ibs.biocuckoo.org/）預測并繪制PpNHXs蛋白的跨膜結構模型;使用在線網站Softberry（http：//www.softberry.com）進行亞細胞定位預測。

1.2.2 系統(tǒng)進化關系分析和基因結構分析 使用MEGA5軟件（https：//www.megasoftware.net）將擬南芥、水稻、胡楊和桃NHX家族全部成員蛋白序列采用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）在默認參數下構建進化樹。

利用桃基因組數據庫GDR獲取家族成員的基因序列和對應編碼區(qū)（CDS）序列，運用在線軟件GSDS（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）進行PpNHXs家族成員外顯子和內含子的結構分析。

1.2.3 桃NHX家族成員啟動子順式作用元件分析 在桃基因組數據庫GDR下載各成員基因翻譯起始位點ATG上游2000bp的序列，使用在線網站Plantcare（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）進行作用元件預測分析。

1.2.4 桃NHX基因家族的組織表達分析 對桃7個NHX家族成員進行組織（根、莖、葉、花和果實）表達譜分析，并對NaCl處理下離體枝條上葉片的表達量進行實時熒光定量PCR檢測。用植物總RNA提取試劑盒HiPureHPPlantRNAMiniKit（MagenR4165-02）提取總RNA。以總RNA為模板，采用試劑盒SUM OnetubeRTMixtureⅢ（gDNAremovel）（SUMMERSUM7806a）合成cDNA。采用熒光定量試劑盒qPCRmastermixSybrGreen100Reaction（DBI-2043）配制qRT-PCR體系，以稀釋10倍的cDNA為模板，具體反應體系為（20μL）：2×SYBRqPCRMix10μL，正反向引物（10μmol/L）各0.4μL（表1），DNA模板1μL、ddH2O8.2μL;熒光定量PCR儀器為美國DBI7500fast熒光定量系統(tǒng)。qRT-PCR反應程序為：94℃ 10min;94℃ 15s，50℃ 30s，72℃30s，40個循環(huán);95℃ 1min，55℃ 30s，95℃ 30s。內參基因為桃基因Translationelongationfactor2（TEF2），每個樣品重復3次。采用2-△△Ct法計算基因相對表達量。

2 結果與分析

2.1 桃PpNHXs基因的鑒定和理化性質分析

利用桃基因組數據庫共鑒定出7個PpNHXs基因，根據其在染色體上的定位依次命名為PpNHX1～PpNHX7（表2）。PpNHXs家族7個成員CDS長度在1590～3507bp之間，其中PpNHX4最短，PpNHX2最長。PpNHXs蛋白氨基酸長度在529～1168之間，相對分子質量介于58.6～130.2kD。PpNHXs蛋白等電點介于5.53～8.83，其中蛋白PpNHX2～PpNHX5呈酸性，其他呈堿性。PpNHXs蛋白不穩(wěn)定指數介于34.62～45.61，僅有PpNHX1和PpNHX3的不穩(wěn)定指數大于40，說明桃PpNHXs蛋白家族中不穩(wěn)定蛋白居多。PpNHXs蛋白的親水指數在0.058～0.593之間，說明桃PpNHXs家族的蛋白均為疏水蛋白。

2.2 桃PpNHXs基因結構分析

利用桃基因組數據庫GDR提供的PpNHXs蛋白序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1），結果顯示，PpNHXs具有清晰的親緣遠近關系，PpNHX1、PpNHX4～PpNHX7親緣關系較近，其與PpNHX2和PpNHX3親緣關系較遠。根據提供的PpNHXs家族gDNA和cDNA序列繪制每個成員的基因結構，結果（圖2）顯示，7個PpNHXs基因的外顯子數在13～23之間不等，外顯子數目較多。其中，PpNHX1、PpNHX4～PpNHX7外顯子數目相近，基因長度差異較小。

2.3 桃PpNHXs蛋白跨膜結構分析

使用在線網站TMHMM Server分析桃PpNHXs蛋白跨膜結構域，并利用軟件IBS繪制PpNHXs蛋白的跨膜結構模型（圖3）。結果顯示，PpNHX1～PpNHX7均具有跨膜結構域，符合NHX家族跨膜蛋白的特征。PpNHX1、PpNHX4和PpNHX7具有11個跨膜區(qū)域;PpNHX3、PpNHX5和PpNHX6具有10個跨膜區(qū)域;PpNHX2具有12個跨膜區(qū)域，為跨膜區(qū)域個數最多的成員。

PpNHXs家族成員的N端、C端在膜兩端的分布存在差異，PpNHX1、PpNHX4和PpNHX7的N端和C端分布于跨膜兩側;PpNHX2、PpNHX3、PpNHX5和PpNHX6的N端和C端分布于跨膜同側。根據20種氨基酸的疏水性和親水性，對7個桃PpNHXs氨基酸序列進行分析，發(fā)現(xiàn)7個桃PpNHXs跨膜結構域（N端）均有較大比例的疏水氨基酸異亮氨酸（I）、亮氨酸（L）、苯丙氨酸（F）、纈氨酸（V）和丙氨酸（A）（表3）。

2.4 桃PpNHXs基因家族成員啟動子分析

利用Plantcare軟件對桃PpNHXs基因家族上游啟動子元件進行預測，分析統(tǒng)計與光信號、激素、逆境脅迫及分生組織表達相關的順式作用元件（圖4）。在7個桃PpNHXs基因家族的啟動子區(qū)域，均具有與光信號相關的元件;其中，PpNHX2的光信號元件最少，為4個;PpNHX5具有的光信號元件最多，為21個。與激素相關的作用元件有生長素、脫落酸、赤霉素、水楊酸、茉莉酸甲酯;PpNHX2具有5種與激素相關的作用元件，PpNHX4具有與赤霉素和生長素相關的作用元件，PpNHX5具有與脫落酸和水楊酸相關的作用元件，PpNHX4和PpNHX5為家族中具有激素元件最少的成員。與逆境相關的作用元件有厭氧誘導、干旱誘導、低溫、防御和應激反應;PpNHX3和PpNHX5均具有4種逆境相關元件;PpNHX6只具有厭氧誘導相關元件，為家族中具有逆境相關元件最少的成員。PpNHX4、PpNHX5和PpNHX7基因的啟動子上含有與分生組織表達相關的順式作用元件;PpNHX6和PpNHX7的啟動子上含有與胚乳表達相關的順式作用元件。

通過分析桃PpNHXs基因家族上游啟動子元件，發(fā)現(xiàn)PpNHXs家族與光信號、激素、逆境脅迫及分生組織表達有密切關系，說明PpNHXs基因家族在生長發(fā)育、激素調控、抵抗逆境脅迫方面發(fā)揮重要調控作用。

2.5 桃PpNHXs基因家族成員的表達分析

2.5.1 組織特異性 對7個桃PpNHXs基因家族成員進行qRT-PCR分析，結果表明（圖5），PpNHX1～PpNHX7在山桃根、莖、葉、花和果實均有表達;PpNHX1在莖中相對表達量較高，PpNHX2在根和莖中相對表達量較高，PpNHX3在各組織表達量相對均勻;PpNHX4、PpNHX5和PpNHX7主要在莖中表達，其次在花中;PpNHX6在果實中相對表達量最高。

2.5.2 桃PpNHXs響應鹽脅迫的表達分析 由圖6可知，離體枝條葉片經過NaCl溶液處理后，7個PpNHXs基因均出現(xiàn)不同變化。鹽處理下的PpNHX1和PpNHX2基因在0～1.5h變化趨勢是一致的，均為先升高后降低然后趨于平穩(wěn);PpNHX5、PpNHX6和PpNHX7的相對表達量與對照組相比均明顯降低;PpNHX3的相對表達量高于對照組;PpNHX4的相對表達量0～0.5h高于對照，1h后低于對照。

3 討論與結論

本研究共鑒定出7個PpNHXs基因家族成員，與擬南芥（8個）、水稻（5個）和葡萄（8個）的NHX家族成員數量相近[21-23]。通過對擬南芥、水稻、胡楊和桃基因組NHX家族成員親緣關系進行分析，發(fā)現(xiàn)每種植物的NHX家族成員在系統(tǒng)進化樹中分布均勻，相同植物的NHX基因家族成員聚在同一個分支的現(xiàn)象較少，說明不同植物間NHX家族成員多為直系同源基因，如PpNHX1和PeNHX4、PpNHX4和AtNHX3;相比于其他基因家族如MYB、SAUR、NAC等擁有50～100個家族成員，不同植物基因組NHX家族成員個數較少，主要是NHX家族發(fā)生復制事件較少，即旁系同源基因（如AtNHX7和AtNHX8）對數較少。

通過系統(tǒng)發(fā)育樹分析發(fā)現(xiàn)，PpNHX2、PpNHX3與其他5個PpNHXs成員親緣關系較遠;通過分析基因外顯子數目、基因長度，發(fā)現(xiàn)PpNHX2、PpNHX3與其他5個PpNHXs成員在基因結構上差異較大。PpNHX2、PpNHX3在桃基因組上具有結構和序列特異性，這種特異性預示著基因功能的特異性，為后續(xù)的基因功能分析奠定了基礎。

NHX基因家族最明顯的結構特征為跨膜結構域[18]。NHX跨膜結構集中分布在疏水性較強的N端，而親水性較強的長序列C端分布在不同細胞器中，具有感知信號、調控蛋白等功能[24]。在擬南芥AtNHXs基因家族中共鑒定出8個AtNHXs成員;根據在亞細胞器的定位可以分為3類，液泡膜NHX（AtNHX1～AtNHX4）、內膜NHX（AtNHX5和AtNHX6）和質膜NHX（AtNHX7和AtNHX8）[25]。PpNHX2定位在質膜上，這與系統(tǒng)發(fā)育樹中親緣關系較近的AtNHX7、AtNHX8蛋白定位一致;系統(tǒng)進化樹中唯一與AtNHX5、AtNHX6親緣關系近的PpNHX3定位在高爾基體上，這與AtNHX5、AtNHX6蛋白定位一致;PpNHX1、PpNHX4～PpNHX7與AtNHX1～AtNHX4具有較近的親緣關系，但PpNHX1、PpNHX4～PpNHX7蛋白定位均未在液泡膜上，與AtNHX1～AtNHX4的蛋白定位不一致。本研究認為至少存在1～2個PpNHX在液泡膜上，調節(jié)細胞液泡Na+的平衡和滲透壓，但該結論需后續(xù)試驗進行驗證。

在桃PpNHXs組織表達分析中，7個PpNHXs表達具有特異性，表明7個PpNHXs在不同組織具有各自功能特點;但PpNHXs普遍在根和莖組織表達較高，因根和莖是植物抵御外界有害物質進入和運輸至體內各部的重要關口，較多的PpNHXs分布在根和莖組織內對提高桃抗逆性具有重要作用。通過分析桃PpNHXs啟動子順式作用元件，發(fā)現(xiàn)大量與激素、抵抗逆境相關的元件。通過鹽脅迫處理，發(fā)現(xiàn)每個PpNHX的表達出現(xiàn)明顯變化，說明7個PpNHXs均參與體內耐鹽代謝;PpNHX1～PpNHX3的表達量高于對照，說明其可能正向調控耐鹽代謝途徑;PpNHX4的表達量先高于對照，1h后低于對照，說明其可能正向參與體內耐鹽代謝，只是基因表達的持續(xù)性不如基因PpNHX1～PpNHX3。PpNHX5～PpNHX7表達出現(xiàn)降低的現(xiàn)象，說明其可能負向調控體內耐鹽代謝。

綜上，本研究對桃PpNHXs基因家族進行全基因鑒定、生物信息分析、跨膜結構分析和表達分析，發(fā)現(xiàn)該基因家族結構特點明顯、功能多樣，尤其與抵抗逆境聯(lián)系密切。本研究結果可為進一步研究和利用桃PpNHXs基因家族奠定基礎。