基于高通量測(cè)序分析玉米浸泡副產(chǎn)物中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性

張守梅 郭玉秋 張娜娜 李克文 孫桂蓮 龔魁杰 王興亞 劉開昌

摘要：為了更加全面了解玉米浸泡副產(chǎn)物中微生物多樣性，比較其中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，利用高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)玉米浸泡液、玉米漿及玉米噴漿粉中細(xì)菌16SrRNAV4區(qū)進(jìn)行測(cè)序，進(jìn)而分析細(xì)菌多樣性和群落組成結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明：共獲得190069條有效數(shù)據(jù)，通過聚類獲得352個(gè)OTUs，隸屬于12門、68綱、183屬。α多樣性分析結(jié)果表明，玉米噴漿粉中Shannon指數(shù)明顯高于玉米浸泡液和玉米漿。微生物群落組成分析發(fā)現(xiàn)，在門水平上，厚壁菌門（Firmicutes）是玉米浸泡液、玉米漿及玉米噴漿粉的共同優(yōu)勢(shì)菌門;在屬水平上，乳桿菌屬（Lactobacillus）為玉米浸泡液、玉米漿及玉米噴漿粉的優(yōu)勢(shì)屬;在種水平上，玉米浸泡液中優(yōu)勢(shì)菌為耐酸乳桿菌（L.acetotolerans），玉米漿及玉米噴漿粉中優(yōu)勢(shì)菌為解淀粉乳桿菌（L.amylolyticus）。

關(guān)鍵詞：玉米浸泡副產(chǎn)物;高通量測(cè)序;細(xì)菌;群落結(jié)構(gòu);多樣性

中圖分類號(hào)：S513：Q939.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2021）12-0143-06

玉米是我國主要糧食和飼料作物，隨著玉米工業(yè)化用途的增加，出現(xiàn)了更多的加工副產(chǎn)品，副產(chǎn)品以廢水的形式直接排放，降低了附加值，并且加劇了環(huán)境的污染。近年來，玉米深加工副產(chǎn)品的綜合利用引起了人們廣泛關(guān)注[1]。玉米浸泡液是濕法生產(chǎn)淀粉的副產(chǎn)物之一，玉米經(jīng)亞硫酸浸泡后，顏色為黃色透明，pH值為3.0左右，其中含有大量的蛋白質(zhì)、糖類、維生素等物質(zhì)。浸泡液濃縮即制成玉米漿[2-4]。玉米漿噴到玉米皮上，干燥后制成玉米噴漿粉，可以作為飼料原料出售[1]，或者用于微生物發(fā)酵行業(yè)[5-10]。另外，可以直接從玉米浸泡液中提取蛋白肽、黃色素等物質(zhì)[11-13]。

玉米浸泡液會(huì)造成某些特定微生物群體的大量繁殖，主要包括乳桿菌、短粗桿菌、芽孢桿菌、酵母菌等[14]，這些微生物與人和動(dòng)物的健康密切相關(guān)。在玉米浸泡過程中若有乳酸菌和酵母菌大量生長，則可以提高玉米漿的質(zhì)量;若有腐敗性細(xì)菌則降低玉米漿的質(zhì)量。過去對(duì)微生物的研究主要采用直接鏡檢和傳統(tǒng)分離培養(yǎng)技術(shù)，直接鏡檢優(yōu)點(diǎn)是快速得到結(jié)果，缺點(diǎn)是無法確定具體的種類，同時(shí)對(duì)檢驗(yàn)者知識(shí)儲(chǔ)備要求較高。利用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法操作簡(jiǎn)單且直接，還可以獲得具有利用價(jià)值的菌株，是分析微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性最基本的方法。但是，該方法工作量大，且僅能培養(yǎng)出極少量微生物，具有很大的局限性，許多微生物在普通培養(yǎng)基上不能生長，不能準(zhǔn)確反映環(huán)境中總體微生物群落結(jié)構(gòu)特征。隨著現(xiàn)代分子技術(shù)的發(fā)展，人們開始利用非培養(yǎng)技術(shù)研究復(fù)雜環(huán)境中的微生物群落。高通量測(cè)序技術(shù)作為新一代全新的測(cè)序技術(shù)，能夠快速、全面分析不同樣本的群落結(jié)構(gòu)，已被廣泛應(yīng)用到傳統(tǒng)發(fā)酵食品、釀酒、土壤、糞便、腸道、水體中等微生物多樣性的研究[15-23]。

本研究從玉米浸泡液、玉米漿及玉米噴漿粉中提取細(xì)菌基因組DNA，對(duì)16SrRNAV4區(qū)進(jìn)行高通量測(cè)序，獲得不同處理階段微生物組成和多樣性，為玉米副產(chǎn)物進(jìn)一步開發(fā)利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米浸泡液副產(chǎn)物（玉米浸泡液、玉米漿及玉米噴漿粉）來源于西王集團(tuán)。

DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（德國Qiagen公司）;TruSeq DNAPCRFreeSamplePreparationKit建庫試劑盒（美國Illumina公司）;PhusionDNA聚合酶（美國NewEnglandBiolabs公司）

1.2 儀器設(shè)備

PCR儀（力康生物醫(yī)療科技有限公司）;臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（美國ThermoFisherScientific公司）;恒溫金屬?。ê贾菝讱W儀器有限公司）;NUGenius凝膠成像系統(tǒng)（GeneCompanyLimited）;XW-80A旋渦混合儀（寧波新芝生物科技有限公司）;水平電泳儀（Bio-Rad公司）;分析天平（德國賽多利斯公司）;IlluminaNovaSeq6000（美國Illumina公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品采集 玉米浸泡液、玉米漿：將采集樣品的玻璃瓶經(jīng)121℃高壓滅菌，裝入無菌自封袋。取樣時(shí)，佩戴一次性無菌手套，靠近出樣口時(shí)打開瓶蓋接黃漿水，之后擰緊瓶蓋，裝入自封袋中帶回實(shí)驗(yàn)室，一部分于4℃冰箱暫存，一部分于-20℃冰箱保存。

玉米噴漿粉：利用無菌鏟取出，放于無菌塑料袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室后一部分于4℃冰箱暫存，一部分于-20℃冰箱保存。

1.3.2 樣品總DNA的提取及PCR擴(kuò)增 按照試劑盒說明書對(duì)樣品基因組DNA進(jìn)行提取，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA純度，取適量樣品DNA于離心管中，使用無菌水稀釋至100ng/μL。

以稀釋后的基因組DNA 為模板，選擇細(xì)菌16srRNAV4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并利用凝膠回收試劑盒回收。

PCR 擴(kuò)增引物：515F（5′GTGYCAGCMGCCGCGGTAA3′）和806R（5′GGACTACNVGGGTWTCTAA3′）;PCR體系：10×Buffer2μL，dNTP2μL，正反引物各0.8μL，PhusionDNA聚合酶0.2μL，模板DNA1μL，ddH2O補(bǔ)足至20μL。PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5min;95℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán);72℃延伸10min;4℃保存。

1.3.3 高通量測(cè)序 使用TruSeq DNAPCRFreeSamplePreparationKit建庫試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)Qubit和qPCR定量，文庫合格后，使用NovaSeq6000進(jìn)行上機(jī)測(cè)序（北京諾禾致源科技股份有限公司）。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理 根據(jù)Barcode序列和PCR擴(kuò)增引物序列從下機(jī)數(shù)據(jù)中拆分出各樣本數(shù)據(jù)，截去Barcode和引物序列后使用FLASH（V1.2.7，http：//ccb.jhu.edu/software/FLASH/）對(duì)每個(gè)樣本的Reads進(jìn)行拼接，得到的拼接序列為原始Tags數(shù)據(jù)（RawTags）;拼接得到的RawTags經(jīng)過嚴(yán)格的過濾處理[19]得到高質(zhì)量的Tags數(shù)據(jù)（CleanTags）。參照Qiime（V1.9.1，http：//qiime.org/scripts/split_libraries_fastq.html）Tags質(zhì)量控制流程，得到最終的有效數(shù)據(jù)（EffectiveTags）。利用Uparse軟件對(duì)所有樣本的有效數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類，默認(rèn)以97%的一致性將序列聚類成為OTUs（OperationalTaxonomicUnit）的代表序列。

對(duì)OTUs序列進(jìn)行物種注釋，用Mothur方法比對(duì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋分析，同時(shí)計(jì)算該OTUs在各樣本中的相對(duì)含量。使用Qiime軟件對(duì)樣品的多樣性指數(shù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌多樣性分析

樣品高通量測(cè)序后共獲得序列312240條，經(jīng)過對(duì)原始數(shù)據(jù)拼接、過濾，共得到190069條有效數(shù)據(jù)，通過聚類獲得352個(gè)OTUs。為了直觀表現(xiàn)出玉米浸泡液（N1）、玉米漿（N2）、玉米噴漿粉（N3）共有OTUs和特有OTUs，對(duì)獲得的OTUs進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)和比較分析。由圖1可知，玉米浸泡液、玉米漿、玉米噴漿粉共有OTUs數(shù)量為50個(gè)，玉米浸泡液中特有OTUs為52個(gè)，玉米漿中特有OTUs為33個(gè)，玉米噴漿粉中特有OTUs為128個(gè)，表明玉米噴漿粉中微生物群落較玉米浸泡液和玉米漿豐富。

α多樣性分析反映了單個(gè)樣品內(nèi)物種的豐富度和多樣性。樣本的覆蓋率表明測(cè)序的數(shù)據(jù)能夠覆蓋目前狀態(tài)下樣品中細(xì)菌的種類，由表1可知，樣品中覆蓋率均為1，說明樣本中被測(cè)出的概率較高，能真實(shí)反映樣本中細(xì)菌物種豐度及多樣性[24]。OTUs數(shù)可以代表樣品物種的豐度[16]，ACE指數(shù)是用來估計(jì)群落中OTUs數(shù)目的指數(shù)，玉米噴漿粉的OTUs數(shù)量最多，ACE指數(shù)最高，其次是玉米浸泡液，因此玉米浸泡液副產(chǎn)物由濃縮到制粉過程中，微生物豐度發(fā)生了先降低后增加的變化。Chao1指數(shù)可估計(jì)樣品群落中包含的物種總數(shù)，值越大表明物種總數(shù)越多，由浸泡液到制成噴漿粉的過程物種總數(shù)發(fā)生了先降低后增加的變化。Shannon指數(shù)表示樣品中群落多樣性，指數(shù)越大群落多樣性越高，多樣性由高到低依次為玉米噴漿粉、玉米漿、玉米浸泡液。Simpson指數(shù)反映了樣品群落中物種均勻度，玉米噴漿粉中的均勻度最高。

2.2 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異分析

2.2.1 門水平下玉米浸泡液副產(chǎn)物中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析 在門水平下共鑒定出12個(gè)門類細(xì)菌，圖2顯示了玉米浸泡液（N1）、玉米漿（N2）、玉米噴漿粉（N3）中豐富度前10的物種，其余的合并為others。優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門是厚壁菌門（Firmicutes），從濃縮到制粉的過程中，厚壁菌門的相對(duì)豐度逐漸減少，變形菌門（Proteobacteria）和藍(lán)菌門（Cyanobacteria）的相對(duì)豐度增加。變形菌門在玉米浸泡液、玉米漿、玉米噴漿粉中相對(duì)豐度分別為1.1%、14.2%和28.0%，呈逐漸上升趨勢(shì)，原因可能為變形菌門中的細(xì)菌為好氧型，不能適應(yīng)玉米浸泡液高溫、高酸、缺氧的極端環(huán)境;玉米噴漿粉中營養(yǎng)物質(zhì)豐富，有氧的環(huán)境促進(jìn)了變形菌門的生長。

2.2.2 屬水平下玉米浸泡液副產(chǎn)物中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析 在屬水平下共檢測(cè)出183個(gè)屬的細(xì)菌，圖3顯示屬級(jí)豐富度前30的細(xì)菌，其他的合并為others，圖4顯示豐富度前100屬的細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育分析。由圖3、圖4可知，玉米浸泡液、玉米漿、玉米噴漿粉的微生物主要為厚壁菌門（Firmicutes）下的乳桿菌屬（Lactobacillus），其相對(duì)豐度分別為97%、83%、23%。由浸泡液到噴漿粉的過程中許多好氧型細(xì)菌增加，如假單胞菌屬（Pseudomonas）、沙雷氏菌屬（Serratia）等。玉米浸泡液中微生物群落結(jié)構(gòu)是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過程，初期乳桿菌大量繁殖，產(chǎn)生乳酸，抑制了異種微生物生長，后期乳酸對(duì)自身起到了限制作用;在玉米漿中，除乳桿菌外的其他細(xì)菌生長，相對(duì)豐度增加;由玉米漿到噴漿粉，許多好氧菌迅速增加，微生物豐富度增加。

2.2.3 種水平下玉米浸泡液副產(chǎn)物中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析 鑒定到種的細(xì)菌有101個(gè)，隸屬于乳桿菌屬的細(xì)菌有耐酸乳桿菌（L.acetotolerans）、解淀粉乳桿菌（L.amylolyticus），還包括少量的嗜淀粉乳桿菌（L.amylovorus）、開菲爾基質(zhì)乳桿菌（L.kefiranofacie，圖5）。玉米浸泡液的優(yōu)勢(shì)菌為耐酸乳桿菌，相對(duì)豐度為80.6%。玉米漿和玉米噴漿粉優(yōu)勢(shì)菌為解淀粉乳桿菌，相對(duì)豐度分別為82.5%、17.0%。玉米噴漿粉中還存在粘質(zhì)沙雷氏桿菌（Serratiamarcescens）、莓實(shí)假單胞菌（P.fragi）、耐熱芽孢桿菌（Bacillussporothermodurans），這些有害細(xì)菌不僅具有食物致腐能力，還是條件致病菌，在機(jī)體免疫力下降的情況下引起肺部、尿路感染甚至敗血癥。芽孢桿菌革蘭氏染色陽性，需氧或兼性厭氧，具有抵御不良環(huán)境的能力。許多芽孢桿菌具有解磷、固氮、廣譜性抗菌、高產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶等功能，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、食品加工、工業(yè)生產(chǎn)、醫(yī)療等方面起到了重要作用。但是也有一些芽孢桿菌具有致病性，產(chǎn)生耐熱毒素，引起食物中毒;因其獨(dú)特的耐高溫特性，普通的熱處理很難將其消滅，給食品質(zhì)量安全造成隱患。芽孢桿菌在玉米浸泡液和玉米漿中主要以芽孢的形式存在，常規(guī)的提取方法很難獲得高質(zhì)量的DNA用于PCR反應(yīng)，因此，高通量測(cè)序顯示玉米浸泡液和玉米漿中芽孢桿菌數(shù)量極少。

在玉米浸泡液和玉米漿中的細(xì)菌主要為耐酸乳桿菌和解淀粉乳桿菌，其他微生物相對(duì)豐度較低。分析原因：其一是因?yàn)橄鄬?duì)缺氧的、酸性較高的液體環(huán)境適合耐酸乳桿菌的生長;其二，許多研究發(fā)現(xiàn)乳桿菌可以產(chǎn)生細(xì)菌素等拮抗物質(zhì)，還可以通過與其它微生物競(jìng)爭(zhēng)底物等途徑影響其它微生物的生長[25-28]。

3 討論與結(jié)論

玉米浸泡液是微生物生長、繁殖代謝的場(chǎng)所，本研究通過高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)玉米浸泡液、玉米漿和玉米噴漿粉的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性進(jìn)行分析，揭示了玉米副產(chǎn)物在不同加工過程中微生物群落結(jié)構(gòu)變化。由于浸泡液含豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，酸性環(huán)境較強(qiáng)，因此乳桿菌豐富，生長旺盛。濃縮成玉米漿后，隨著時(shí)間的增加，乳桿菌的生長受到抑制，其他種類的細(xì)菌相對(duì)增多。α多樣性分析表明，玉米噴漿粉中OUTs數(shù)量最多，群落結(jié)構(gòu)中豐富度、多樣性、均勻度最高。該研究結(jié)果可為玉米副產(chǎn)物的保存、開發(fā)利用提供借鑒和參考。

本研究表明：玉米浸泡液、玉米漿和玉米噴漿粉的優(yōu)勢(shì)菌門是厚壁菌門，且厚壁菌門的相對(duì)豐度依次減少。變形菌門在玉米浸泡液、玉米漿、玉米噴漿粉中逐漸增多。在屬水平上，乳桿菌屬為玉米浸泡液、玉米漿、玉米噴漿粉的優(yōu)勢(shì)菌屬，且其相對(duì)豐度依次減少。劉慶艾等[29]研究了H2O2玉米浸泡工藝及其浸泡液中菌群結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)果表明，浸泡初期細(xì)菌結(jié)構(gòu)組成較為豐富，一段時(shí)間后，Lactobacillaceae生長繁殖成為優(yōu)勢(shì)菌種并伴隨OTUs水平的降低，浸泡末期Lactobacillaceae進(jìn)入衰亡期，其他細(xì)菌數(shù)量明顯增加。金渭武等[30]分析了逆流浸泡過程中微生物的變化，發(fā)現(xiàn)整個(gè)浸泡過程中，Lactobacillaceae占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)并在浸泡前期發(fā)酵產(chǎn)生大量乳酸。乳桿菌作為環(huán)境中的優(yōu)勢(shì)菌種，能夠消耗有限的營養(yǎng)物質(zhì)，與病原菌競(jìng)爭(zhēng)生存空間從而抑制病原菌的生長繁殖[31];另外，在生長過程中分泌的抗菌素物質(zhì)可抑制其他病原菌生長，產(chǎn)生的乳酸降低了環(huán)境中的pH值也能抑制其他病原菌的生長繁殖[32]。因此玉米浸泡液和玉米漿更有利于玉米浸泡液副產(chǎn)物的儲(chǔ)存和質(zhì)量保證。