禽坦布蘇病毒及其蛋白功能研究進(jìn)展

陳 珍 沈意興 陳翠騰 朱春華 劉斌瓊 蔡國(guó)漳 黃 瑜＊

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 福州 350013；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所動(dòng)物生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室 福州 350013；3.福建省禽病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 福州 350013；4.清流縣龍津鎮(zhèn)鄉(xiāng)村振興綜合服務(wù)中心 福建三明 365300）

禽坦布蘇病毒病是由禽坦布蘇病毒（Avian tembusu virus，ATMUV）引起的、造成多種蛋禽產(chǎn)蛋下降的一種新發(fā)疫病。近年來，在我國(guó)、馬來西亞、泰國(guó)等多地的蛋鴨場(chǎng)、種鴨場(chǎng)、肉鴨場(chǎng)暴發(fā)流行[1-3]，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

1 禽坦布蘇病毒的的分類與基因組結(jié)構(gòu)

ATMUV屬于黃病毒科（Flaviviridae）黃病毒屬（Flavivirus）恩塔亞病毒群（Ntaya virus group）中的一員[1,4-6]。病毒呈球形，直徑約50 nm，病毒顆粒外覆含有脂質(zhì)雙分子層的囊膜，鑲嵌有糖蛋白突起，內(nèi)含有二十面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)核衣殼蛋白[7-8]。ATMUV基因組結(jié)構(gòu)具有典型的黃病毒特征，均為不分節(jié)段單股正鏈RNA，基因組具有感染性?；蚪M大小約為11 kb，基因組5′端和3′端均含有高度保守的非編碼區(qū)（Untranslated regions，UTR），5′-UTR長(zhǎng)為94 nt，包含一個(gè)帽狀“m7GpppAmpN2”結(jié)構(gòu)，3′-UTR長(zhǎng)為618 nt，不含多聚腺苷酸尾[7,9-12]。5′-UTR和3′-UTR之間含有一個(gè)大的開放閱讀框（Open reading frame，ORF），編碼一個(gè)約3400 aa的多聚蛋白分子，被絲氨酸蛋白酶、弗林蛋白酶等酶解成10個(gè)蛋白，包含3種結(jié)構(gòu)蛋白（Structural proteins）和7種非結(jié)構(gòu)蛋白（Nonstructural proteins）。結(jié)構(gòu)蛋白參與病毒感染時(shí)病毒粒子的吸附、膜融、病毒粒子組裝和出芽，非結(jié)構(gòu)蛋白參與病毒的轉(zhuǎn)錄復(fù)制，同時(shí)調(diào)控宿主的抗病毒天然免疫[13-15]。

2 坦布蘇病毒結(jié)構(gòu)蛋白與功能

衣殼蛋白C（Capsid protein，C）在蛋白翻譯過程中首先被合成，大小約為12 kDa，是多聚蛋白前體經(jīng)氨肽酶酶解其第一個(gè)Met殘基而成的，是病毒組裝過程中的重要元件，含有較多帶正電的堿性氨基酸，與病毒基因組RNA結(jié)合組裝成核衣殼，避免基因組RNA遭受酶解；同時(shí)C蛋白還可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)[16]。試驗(yàn)證明，C蛋白對(duì)病毒復(fù)制和成熟組裝同樣也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[17-20]。

前膜蛋白prM（Premembrane protein，prM）是成熟病毒顆粒中外膜蛋白（Membrance protein，M）的前體蛋白，分子量大小約為19 kDa。在病毒感染后期，病毒顆粒出芽釋放前通過弗林蛋白酶將prM糖蛋白切割成pr蛋白和成熟的M蛋白兩部分[21-22]，pr部分分泌到胞外，而M部分鑲嵌在細(xì)胞外膜磷酸脂質(zhì)層中，同時(shí)與C蛋白和E蛋白緊密結(jié)合，參與病毒囊膜的組成，在ATMUV病毒粒子的成熟裝配和釋放過程中發(fā)揮作用[23]。

囊膜糖蛋白E（Envelope protein，E）是ATMUV最大的結(jié)構(gòu)蛋白和主要膜蛋白，鑲嵌在病毒粒子囊膜表面，分子量約為54 kDa。作為宿主的重要保護(hù)性抗原，E蛋白能夠誘導(dǎo)動(dòng)物發(fā)生特異性免疫應(yīng)答，激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體。同時(shí)在病毒復(fù)制過程中，E蛋白對(duì)病毒吸附、膜融合以及受體結(jié)合等方面同樣也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，決定著病毒的細(xì)胞嗜性[24-25]。E蛋白屬于I型膜蛋白，包含三個(gè)結(jié)構(gòu)域（Domain），根據(jù)其X射線晶體結(jié)構(gòu)分析可分為DomainⅠ/Ⅱ/Ⅲ[26-28]，依次從氨基端到羧基端排列。DomainⅠ是位于E蛋白的中央結(jié)構(gòu)域，含3個(gè)不連續(xù)的片段，呈β折疊桶狀結(jié)構(gòu)，起到連接DomainⅡ和DomainⅢ的作用[29-30]。Domain I與ATMUV的細(xì)胞嗜性相關(guān)，同時(shí)也決定著病毒的毒力。DomainⅡ較為保守，形成延伸的指狀結(jié)構(gòu)，參與E蛋白二聚體的形成，同時(shí)含有病毒融合肽，在病毒融合過程中，介導(dǎo)靶細(xì)胞的細(xì)胞膜與病毒囊膜的融合。Domain III是位于E蛋白的羧基端，結(jié)構(gòu)上呈免疫球蛋白IgG結(jié)構(gòu)，是重要的受體結(jié)合區(qū)域。大部分抗體可識(shí)別DomainⅢ上的抗原決定簇，其功能介導(dǎo)病毒與細(xì)胞膜表面受體結(jié)合過程，促進(jìn)病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞[29,31-32]。邵周伍林等以pcDNA-E通過轉(zhuǎn)染DEF細(xì)胞后可導(dǎo)致受侵染的細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞皺縮、崩解，核質(zhì)濃縮、崩解等現(xiàn)象，提示E蛋白在誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著重要的作用[33]。劉德建[34]研究表明，E蛋白糖基化對(duì)吸附、侵入和復(fù)制能力有一定的影響，消除E蛋白糖基化可降低病毒的裝配和釋放的效率，降低病毒致病性和神經(jīng)毒性。趙冬敏等[35]利用免疫共沉淀試驗(yàn)、病毒輔覆蛋白結(jié)合分析（VOPBA）以及LC-MSMS質(zhì)譜分析鑒定等技術(shù)從鴨胚成纖維細(xì)胞膜蛋白中篩選出ATMUV受體結(jié)合蛋白HSP70，為抗ATMUV藥物設(shè)計(jì)提供思路。李晨曦[36]以純化的三株抗ATMUV E蛋白單克隆抗體1F3、3B6和1A5為固相篩選分子，按照結(jié)合、洗脫、擴(kuò)增的順序篩選噬菌體隨機(jī)12肽庫(kù)，成功鑒定出DTMUV E蛋白的三個(gè)最小線性抗原表位221LNLPW226、374EVEPPFG380和87YAEYI91。通過對(duì)DTMUV E蛋白三維結(jié)構(gòu)模擬分析發(fā)現(xiàn)，表位LNLPW和YAEYI位于E蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅱ，表位EVEPPFG位于E蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅲ，為黃病毒共享型的抗原表位。張琳等[37]篩選出ATMUV一個(gè)B細(xì)胞線性表位385LVGSGKGQI393（EP385），該表位具有良好的免疫原性，可為ATMUV疫苗的研制及診斷方法的建立提供基礎(chǔ)。凡玉芳[38]通過單克隆抗體精確鑒定出一個(gè)ATMUV B細(xì)胞線性表位1FSCLGMQ7，位于E蛋白Domain I結(jié)構(gòu)域內(nèi)。李小康等[39]應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)，篩選出與E蛋白特異性結(jié)合的多肽：HWSTRQGSTRWN（P3-12）和THRSWQGNSWYM（P8-12）。程冰花[40]通過酵母雙雜交從鴨胚成纖維細(xì)胞cDNA文庫(kù)中篩選出PRDX1、PRS7、MORC3、ANTX1等蛋白，為ATMUV受體研究豐富資料。劉龍[41]研究發(fā)現(xiàn)ATMUV E蛋白388位作S→R突變后神經(jīng)毒力和神經(jīng)侵襲力都明顯弱于野生親本株，表明E388是ATMUV E蛋白關(guān)鍵毒力位點(diǎn)。

3 坦布蘇病毒非結(jié)構(gòu)蛋白與功能

NS1是一種高度保守的非結(jié)構(gòu)蛋白，是胞外分泌的分泌型蛋白，其分子量大小為40 kDa，可粘附于感染的細(xì)胞外表面表達(dá)，并常以二聚體的形式分泌于胞外，利用NS1建立的ELISA檢測(cè)方法可適用于早期感染的診斷[42]。NS1是一種多效應(yīng)蛋白，不僅在病毒感染過程中的早期復(fù)制發(fā)揮著重要的作用，而且也可以與其它非結(jié)構(gòu)蛋白相互協(xié)作發(fā)揮效應(yīng)[43]。該蛋白是病毒復(fù)制過程中所產(chǎn)生的重要抗原，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫和非中和性保護(hù)力。由于NS1蛋白不是病毒粒子的成分，同時(shí)具有可溶性補(bǔ)體結(jié)合活性，可誘導(dǎo)產(chǎn)生非中和性保護(hù)效應(yīng)[44-45]。近年來，有關(guān)TMUV-NS1研究發(fā)現(xiàn)，NS1蛋白可與RLRs信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白MAVS特異性結(jié)合，進(jìn)而抑制I型干擾素產(chǎn)生以拮抗天然免疫應(yīng)答[46]。王振忠[12]研究表明，NS1蛋白的表達(dá)能夠下調(diào)RPS7和MDM2的轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)而導(dǎo)致P53 mRNA的表達(dá)水平升高，可能引起相應(yīng)蛋白表達(dá)水平升高，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

非結(jié)構(gòu)蛋白NS2以兩種均為疏水性蛋白NS2A和NS2B的形式出現(xiàn)。NS2A和NS2B是在病毒復(fù)制過程中被進(jìn)一步切割而成的，二者均表現(xiàn)為疏水性，其分子量較小，分別為17 kDa和13 kDa。其中NS2A在病毒組裝方面起重要的作用[47-49]，并且NS2A還可與NS3和NS2B相互作用[48,50]。陳舜等[51]以IFN預(yù)處理DEF可有效控制后續(xù)ATMUV的增殖，但對(duì)已經(jīng)感染ATMUV的DEF細(xì)胞添加IFN則無法控制ATMUV的增殖。同時(shí)，經(jīng)體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ATMUV可顯著促進(jìn)混合感染的鴨瘟病毒增殖。提示ATMUV能干擾IFN的抗病毒效果，明確NS2A經(jīng)由阻止STAT磷酸化而抑制抗病毒IFN信號(hào)通路，從而發(fā)揮免疫逃逸功能而促進(jìn)自身持續(xù)增殖。NS2B蛋白的羧基端含有與NS3互作的結(jié)構(gòu)，相互作用而構(gòu)成NS2B/NS3蛋白酶復(fù)合體，對(duì)非結(jié)構(gòu)蛋白前體的切割加工過程中起重要作用，其作用位點(diǎn)位于NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A和NS5等非結(jié)構(gòu)蛋白之間的連接處。另外，NS2B還介導(dǎo)NS3的膜固定，并通過NS3富集NS5到膜上，形成病毒RNA復(fù)制體[52]。

NS3是一個(gè)具有多種功能的蛋白，分子量為69 kDa。其N端為絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域，C端為RNA解旋酶/核苷三磷酸酶/RNA 5′三磷酸酶結(jié)構(gòu)域，具有絲氨酸蛋白酶、核苷酸三磷酸酶和RNA解旋酶等活性[53]。NS3蛋白不僅可獨(dú)立調(diào)控病毒RNA復(fù)制、合成以及蛋白加工，也可與NS5蛋白形成復(fù)合物協(xié)同參與這一過程[54]。

NS4以NS4A和NS4B兩種蛋白形式存在，其分子質(zhì)量分別約為28 kDa和14 kDa。NS4A蛋白的作用較為廣泛，在蛋白翻譯后的加工過程中，NS4A與NS3蛋白酶常膠合在一起，借此能穩(wěn)定NS3絲氨酸蛋白酶與其它非結(jié)構(gòu)蛋白間的相互作用，提高了NS3絲氨酸蛋白酶的切割效能[12]。同時(shí)，NS4A可通過誘導(dǎo)自噬以防止細(xì)胞的死亡，進(jìn)而對(duì)病毒的復(fù)制起到促進(jìn)作用[55]；此外，NS4A還可與波形蛋白相互作用，參與病毒復(fù)制復(fù)合體的構(gòu)成[56]。NS4B存在3個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，在功能上與NS4A相似，都可抑制干擾素信號(hào)通路以拮抗宿主免疫應(yīng)答[57]。

NS5蛋白是ATMUV基因組編碼最保守的蛋白，也是最大的非結(jié)構(gòu)蛋白，分子量為100 kDa。常利用其編碼基因3′端核苷酸對(duì)黃病毒科病毒成員進(jìn)行分類[58]。NS5蛋白的C端存在RNA依賴性RNA聚合酶結(jié)構(gòu)域，參與黃病毒基因組的復(fù)制；N端存在甲基轉(zhuǎn)移酶（Methyltransferase，MTase）結(jié)構(gòu)域。同時(shí)，NS5蛋白還具有RNA加帽活性、鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶（Guanylyltransferase，GTase）和核定位功能。此外，NS5蛋白能夠協(xié)同參與宿主內(nèi)多種反應(yīng)機(jī)制，拮抗宿主的天然免疫反應(yīng)。張吉[59]研究表明，NS5蛋白發(fā)揮關(guān)鍵抑制作用，ATMUV-NS5通過阻礙STATs核移位過程，進(jìn)而拮抗IFN-I信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而阻礙下游JAK-STAT信號(hào)通路拮抗IFN-I信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。