竹鼠體內(nèi)馬爾尼菲籃狀菌的分離鑒定及小鼠致病力試驗

熊 飆 李英姣 陳盤余 黎壽生 唐作順

（1.廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學院 南寧市 530007；2.廣西陸生野生動物救護研究與疫源疫病監(jiān)測中心 南寧 530007）

馬爾尼菲籃狀菌（Talaromyces marneffei，TM）原名馬爾尼菲青霉菌（Penicillium marneffei，PM）是籃狀菌屬中的一種溫度依賴性雙相真菌[1]。該菌為高致病性的條件性真菌病原，可在免疫力低下的人群中引起散發(fā)性深部真菌病---馬爾尼菲籃狀菌病[2]。1956年Capponi等首先從越南野生中華竹鼠的病變肝臟分離出馬爾尼菲籃狀菌[3]，1985年鄧卓霖在國內(nèi)報道從廣西竹鼠體內(nèi)分離出該菌[4]。2020年，為探討竹鼠與人類馬爾尼菲籃狀菌感染的流行病學關(guān)系，筆者收集了廣西壯族自治區(qū)11個地區(qū)的21只竹鼠進行真菌分離及小白鼠致病力試驗。

1 材料與方法

1.1 動物來源 從廣西壯族自治區(qū)11個地區(qū)分別收集21只竹鼠，其中南寧市5只、河池市4只、貴港市3只、防城港市2只、梧州市1只、桂林市1只、玉林市1只、來賓市1只、賀州市1只、崇左市1只、欽州市1只。21只竹鼠外觀健康，采食正常。

1.2 試劑 沙堡弱瓊脂培養(yǎng)基，由廣東環(huán)凱微生物科技有限公司提供。

1.3 方法 將竹鼠處死后用5%來蘇爾浸泡10～20 min[5]，于無菌操作下解剖，觀察竹鼠的體表、皮下組織、心、肝、脾、肺、腎、膀胱、胃、腸道、胰腺等組織與內(nèi)臟器官，均未發(fā)現(xiàn)肉眼可見的病變。隨機取肺門組織、肝、腎、脾、腸系膜淋巴結(jié)約米粒至黃豆大的組織碎片，接種于沙堡弱瓊脂培養(yǎng)基上，分別置于25℃及37℃條件下培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 竹鼠各種組織培養(yǎng)馬爾尼菲籃狀菌結(jié)果21只竹鼠中有20只內(nèi)臟組織分離出馬爾尼菲籃狀菌，個體陽性率高達95.238%。竹鼠各組織器官分離出馬爾尼菲籃狀菌的陽性率分別為：肺85.714%，肝52.381%，腎14.286%，脾47.619%，腸系膜淋巴結(jié)52.381%。見表1。

表1 竹鼠各種組織馬爾尼菲籃狀菌分離培養(yǎng)結(jié)果

2.2 不同溫度下菌落培養(yǎng)特征 在沙堡弱瓊脂培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)第3 d可見淡灰色膜樣或淡黃白色絨樣較小菌落，無色素產(chǎn)生，第7 d菌落較大并呈現(xiàn)淡黃間白色絨狀或粉紅色絨狀，可見菌落周圍培養(yǎng)基呈棕紅色或玫瑰紅色（見圖1A），第15 d整個培養(yǎng)基均呈棕紅色，菌落有腦回樣皺褶，部分呈現(xiàn)白色絨狀、粉紅色絨狀或淡褐色絨樣；37℃培養(yǎng)于第5 d可見較小的乳白色或淡灰褐色膜樣小菌落（見圖1B），第10 d較成熟菌落顏色無變化，有腦回樣皺褶，無色素產(chǎn)生，第15 d腦回樣皺褶菌落增大，仍無色素產(chǎn)生。以上均符合馬爾尼菲籃狀菌在25℃與37℃下培養(yǎng)的菌落特征。

圖1 沙堡弱培養(yǎng)基上培養(yǎng)的PM

2.3 顯微鏡下菌體形態(tài) 培養(yǎng)物用姬姆薩染液、瑞氏染液或過碘酸雪夫染液染色[6]。沙堡弱瓊脂培養(yǎng)基25℃條件下培養(yǎng)，成熟菌落顯微結(jié)構(gòu)呈霉菌相，菌體有典型的帚狀枝、雙輪生；在37℃培養(yǎng)時顯微結(jié)構(gòu)呈酵母相，見混有少量短菌絲的橢圓形、圓形及長形且表面光滑的酵母樣菌體。符合馬爾尼菲籃狀菌在25℃及37℃條件下培養(yǎng)的顯微結(jié)構(gòu)特征。

2.4 動物試驗 以3號竹鼠肺、4號竹鼠脾、8號竹鼠肺、9號竹鼠肝分離出的馬爾尼菲籃狀菌用生理鹽水將其調(diào)成1個麥氏單位的菌懸液，分別向Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ號小白鼠腹腔注射0.1 mL菌懸液。注射后第7 d，4只小白鼠全部死亡。5%來蘇爾浸泡死亡小白鼠10～20 min后，于無菌操作下解剖，見4只小鼠肝葉有針尖大白色膿腫，1只輸尿管旁有直徑約3 mm膿腫（見圖2），1只腎臟旁見直徑約2 mm膿腫（見圖3）。

圖2 輸尿管旁膿腫

圖3 腎臟旁膿腫

在沙堡弱瓊脂培養(yǎng)基上接種小鼠肝、腎等相應病變組織，置于25℃及37℃分別培養(yǎng)15 d，均分離出與原接種菌一致的馬爾尼菲籃狀菌。試驗小白鼠膿腫組織病理學檢查[7]（蘇木精-伊紅染色和碘酸雪夫染色），可見巨噬細胞胞質(zhì)內(nèi)有淡藍色顆粒（馬爾尼菲籃狀菌的核），染色結(jié)果判定為陽性。動物試驗說明，竹鼠體內(nèi)分離出的馬爾尼菲籃狀菌可致試驗小白鼠發(fā)生多發(fā)性膿腫，具有致病性。

3 小結(jié)與討論

本研究從廣西11個地級市收集21只竹鼠，除南寧市橫縣1例幼齡竹鼠外，其余全部分離出馬爾尼菲籃狀菌，地區(qū)陽性率高達100%，個體陽性率為95.238%。可見廣西地區(qū)竹鼠個體馬爾尼菲籃狀菌帶菌率極高。20只體內(nèi)攜帶馬爾尼菲籃狀菌的竹鼠，臨床觀察無異常，解剖臟器組織無肉眼可見病變，組織病理學檢查反應極弱或無，結(jié)合前人對竹鼠馬爾尼菲籃狀菌健康帶菌的報道，故馬爾尼 菲籃狀菌的自然宿主可能是竹鼠，其健康帶菌，不 致病。

21只試驗竹鼠中有18只的肺組織分離出馬爾尼菲籃狀菌，個體陽性率高達85.714%；11只的肝臟分離出馬爾尼菲籃狀菌，個體陽性率52.381%；3只的腎臟分離出馬爾尼菲籃狀菌，個體陽性率14.285%；10只的脾臟分離出馬爾尼菲籃狀菌，個體陽性率47.619%；11只的腸系膜淋巴結(jié)分離出馬爾尼菲籃狀菌，個體陽性率52.381%。結(jié)合在肺組織中該菌檢出率最高，肝臟與腸系膜淋巴結(jié)其次，可見呼吸系統(tǒng)是馬爾尼菲籃狀菌進入竹鼠體內(nèi)的主要途徑，其次是消化系統(tǒng)。脾臟的高檢出率，說明馬爾尼菲籃狀菌進入竹鼠體內(nèi)后，網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)是主要受侵犯的臟器組織之一。