人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞旁分泌對(duì)成骨細(xì)胞的影響

王貴玲，洪 滔，淦 岷，仇麗鴻

腫瘤或炎癥等骨破壞性疾病可能引起牙槽骨較大面積骨缺損，往往需要外界干預(yù)。缺損區(qū)成骨細(xì)胞對(duì)微環(huán)境的改變很敏感，又是直接調(diào)節(jié)骨形成的重要細(xì)胞，所以它的生物活性在骨組織修復(fù)中具有重要作用[1]。如何充分調(diào)動(dòng)缺損區(qū)成骨細(xì)胞生物活性對(duì)骨缺損的修復(fù)再生具有重要意義。

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是具有高度自我更新能力和多向分化潛能的多能干細(xì)胞，在骨缺損修復(fù)治療中療效顯著[2-3]。早期人們認(rèn)為MSCs主要作為組織修復(fù)中的種子細(xì)胞，利用其成骨分化能力發(fā)揮作用，但近年來(lái)研究結(jié)果顯示MSCs并非直接參與組織修復(fù)的主要細(xì)胞，而是主要通過(guò)分泌相關(guān)生物活性因子，改變機(jī)體局部微環(huán)境，即通過(guò)旁分泌機(jī)制誘導(dǎo)機(jī)體自身細(xì)胞歸巢并調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)骨組織的修復(fù)作用[4-5]。人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(human amniotic mesenchymal stem cells, hAMSCs)因取材方便，且無(wú)倫理限制，成為MSCs理想的細(xì)胞來(lái)源[6-7]。本研究通過(guò)收集人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基(condition medium，hAMSCs-CM)并作用于人成骨樣細(xì)胞系MG63，進(jìn)而研究hAMSCs對(duì)成骨細(xì)胞的旁分泌作用，為hAMSCs在牙槽骨再生修復(fù)中的進(jìn)一步應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco，美國(guó))，低糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)(Hyclone，美國(guó))，膠原蛋白酶Ⅳ、pNPP試劑盒(Sigma，美國(guó))，胰蛋白酶(Sangon，中國(guó))，MTT試劑盒(Invitrogen，美國(guó))，CD29、CD105、CD44、CD45、CD31、CD49d、SSEA3、SSEA4、CD34、HLADR抗體(BD Pharmingen，美國(guó))，BCA試劑盒(碧云天，中國(guó))。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人成骨樣細(xì)胞系MG63細(xì)胞(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù))，用含10% FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。細(xì)胞融合度達(dá)90%后按4×104個(gè)/cm2傳代。

1.3 hAMSCs原代提取

羊膜樣本由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院產(chǎn)科提供，產(chǎn)前檢測(cè)無(wú)傳染性疾病，并經(jīng)產(chǎn)婦知情同意。在胎盤娩出10 min內(nèi)，從胎盤上鈍性分離羊膜，用磷酸鹽緩沖液(PBS)反復(fù)漂洗后，浸泡于含1 000 U/mL慶大霉素和2.5 μg/mL 二性霉素B的PBS中，冰盒2 h內(nèi)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。剪取面積約5 cm×5 cm大小羊膜，刮凈表面的絨毛膜及殘留血塊，放入離心管中，加入約20 mL的0.25%胰蛋白酶，37 ℃水浴消化20 min兩次，后剪碎放入離心管中，加入10 mL 1 g/L的膠原蛋白酶Ⅳ，37 ℃水浴約60 mim，200目不銹鋼網(wǎng)過(guò)濾，1 000 r/min離心5 min，可觀察到細(xì)胞沉淀即為hAMSCs。用含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液將細(xì)胞沉淀重懸并接種，第二天可觀察細(xì)胞貼附情況，1～2 d后換液，長(zhǎng)滿后傳代,之后換用含10% FBS的低糖DMEM培養(yǎng)。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3～5代hAMSCs進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 流式鑒定原代hAMSCs細(xì)胞表面標(biāo)記物表達(dá)

取第4代hAMSCs，消化離心后冷PBS清洗2次，加100 μL冷PBS重懸細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)不少于5×105個(gè)/管，每管各加5 μL細(xì)胞表面標(biāo)記物抗體，分別為CD29、CD105、CD44、CD49d、SSEA3、SSEA4、CD34、HLADR，另設(shè)空白對(duì)照，冰上避光孵育30 min，洗滌2次后300 μL PBS重懸細(xì)胞沉淀，換用流式管，流式檢測(cè)儀檢測(cè)。

1.5 收取hAMSC-CM

取第3～5代hAMSCs，待其細(xì)胞融合度達(dá)90%左右時(shí)，換用新鮮培養(yǎng)液，24 h后收取培養(yǎng)上清，1 500 r/min離心5 min去沉淀后分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆茫c新鮮培養(yǎng)液1∶1混合后作為hAMSC-CM用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，并以新鮮培養(yǎng)液作為陰性對(duì)照組。

1.6 MTT檢測(cè)hAMSC-CM對(duì)MG63增殖的影響

MG63按2×103個(gè)/孔接種于96孔板中，第2天換用hAMSC-CM，之后1～4 d內(nèi)每隔24 h MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力。按試劑說(shuō)明書(shū)操作，1.5 h后酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)光密度(OD值)。

1.7 Transwell檢測(cè)hAMSC-CM對(duì)MG63遷移的影響

MG63消化離心后按1×106個(gè)/mL重懸于不含血清培養(yǎng)基中，選用24孔板Transwell小室，下室加入600 μL hAMSC-CM，取100 μL細(xì)胞懸液(約1×105個(gè))置于上室，觀察無(wú)氣泡后放回細(xì)胞培養(yǎng)箱。2.5 h后甲醇固定1 min，蘇木精-伊紅染色，棉花棒擦去小室上層細(xì)胞，晾干后顯微鏡下隨機(jī)取7個(gè)視野拍照并計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.8 pNPP法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ALP表達(dá)活性

MG63融合度達(dá)90%后，換用hAMSC-CM，5 d后，pNPP法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ALP表達(dá)[8]。每孔加40 μL RIPA(加蛋白酶抑制劑PMSF)裂解細(xì)胞提取細(xì)胞質(zhì)蛋白。取10 μL蛋白裂解液于96孔微板中，另加90 μL pNPP溶液，迅速酶標(biāo)儀405 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔OD值作為Ainitial。37 ℃溫箱中孵育tx=30 min后再次檢測(cè)405 nm波長(zhǎng)下OD值作為Afinal。按公式計(jì)算ALP活性：ALP 活性=10×((Afinal-Ainitial)/tx) ×R/18.45(其中10代表稀釋倍數(shù)；R為路徑長(zhǎng)度，在96孔板、100 μL反應(yīng)體系中約為0.31 cm；18.45代表消光系數(shù))。

同時(shí)取1 μL蛋白裂解液，按BCA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)蛋白濃度(mg/mL)，最后將計(jì)算得到的ALP活性除以蛋白量后得到標(biāo)準(zhǔn)化的ALP活性(U/g)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 hAMSCs表面標(biāo)志物鑒定

hAMSCs呈典型的成纖維樣細(xì)胞形態(tài)，漩渦狀生長(zhǎng)(圖1A)。流式結(jié)果(圖1B)顯示，人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)CD29、CD105、CD49d、CD44；陰性表達(dá)CD34、CD45、CD31和HLADR，表明hAMSCs具有間充質(zhì)干細(xì)胞一般特性。

A:hAMSCs形態(tài)觀察( ×100)；B: 流式細(xì)胞儀檢測(cè)hAMSCs表面標(biāo)志物表達(dá)圖1 hAMSCs細(xì)胞鑒定Fig.1 Identification of hAMSCs

2.2 hAMSC-CM對(duì)MG63增殖能力的影響

hAMSC-CM作用于MG63后，與陰性對(duì)照組相比，連續(xù)3 d均可顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖(P<0.05)，第4天時(shí)，細(xì)胞增殖增加無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖2)。

2.3 hAMSC-CM對(duì)MG63遷移能力的影響

Transwell遷移模型2.5 h后，hAMSC-CM組MG63遷移細(xì)胞計(jì)數(shù)為117.60±14.54，顯著高于對(duì)照組的20.20±10.38，表明hAMSC-CM可顯著增強(qiáng)MG63遷移能力(P<0.05)(圖3)。

2.4 hAMSCs-CM對(duì)MG63細(xì)胞ALP活性的影響

hAMSCs-CM連續(xù)培養(yǎng)MG63細(xì)胞5 d后，細(xì)胞內(nèi)ALP表達(dá)明顯強(qiáng)于對(duì)照組(P<0.05)(圖4)，提示hAMSCs-CM可顯著促進(jìn)MG63細(xì)胞成骨分化。

與對(duì)照組比較，*：P<0.05圖2 hAMSC-CM對(duì)MG63增殖能力的影響Fig.2 Effect of hAMSC-CM on MG63 cell proliferation

A：對(duì)照組MG63遷移細(xì)胞情況；B：hAMSC-CM細(xì)胞遷移情況( ×100)；C：不同組遷移細(xì)胞數(shù)比較，與CON組比較，*：P<0.05圖3 hAMSC-CM對(duì)MG63遷移能力的影響Fig.3 Effect of hAMSC-CM on MG63 cell migration

與CON組比較，*：P<0.05圖4 hAMSCs-CM對(duì)MG63中ALP活性的影響Fig.4 Effect of hAMSC-CM on ALP activity in MG63

3 討 論

MSCs廣泛存在于全身多種組織中，最早是由骨髓中提取出來(lái)[9]。然而骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源有限，且提取方法具有侵入性，而羊膜取材方便，無(wú)倫理限制，且hAMSCs增殖及成骨分化能力比BMSCs更強(qiáng)[6-7,10]。本研究及既往研究均表明，hAMSCs不表達(dá)免疫因子HLA-DR、CD14，也不表達(dá)協(xié)同刺激分子CD80、CD83、CD86、CD40L等，具有低免疫原性和免疫調(diào)節(jié)作用[11-12]，可以作為間充質(zhì)干細(xì)胞臨床應(yīng)用的理想細(xì)胞來(lái)源。

近年來(lái)人們研究證實(shí)，在骨組織工程中植入的MSCs主要通過(guò)旁分泌作用促進(jìn)骨組織修復(fù)再生，且MSC-CM與MSCs具有相似的骨誘導(dǎo)作用[13-14]，這為MSC-CM在臨床應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。研究表明，MSCs可通過(guò)分泌血小板生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子beta、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等可溶性生長(zhǎng)因子，或通過(guò)胞外囊泡攜帶并傳遞遺傳信息等多種可能的途徑改變組織細(xì)胞所處的微環(huán)境，發(fā)揮旁分泌作用[15-17]。

本研究通過(guò)提取hAMSC-CM作用于人成骨樣細(xì)胞系MG63，檢測(cè)其對(duì)成骨細(xì)胞增殖、遷移及分化功能的影響。本研究證實(shí)hAMSC-CM對(duì)成骨細(xì)胞增殖和遷移具有顯著促進(jìn)作用，ALP是成骨細(xì)胞分化早期的標(biāo)志物，本研究通過(guò)pNPP法檢測(cè)hAMSC-CM培養(yǎng)5 d后成骨細(xì)胞內(nèi)ALP活性，在蛋白水平上驗(yàn)證了hAMSC-CM對(duì)成骨細(xì)胞分化的顯著促進(jìn)作用。由此提示hAMSCs可通過(guò)旁分泌作用增強(qiáng)成骨細(xì)胞生物活性，但具體作用的生長(zhǎng)因子及其相關(guān)機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

目前對(duì)于hAMSCs的研究主要把它作為骨組織工程的種子細(xì)胞，研究其自身成骨分化或?qū)撬栝g充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響[18-19]。有研究提示hAMSCs與成骨細(xì)胞共培養(yǎng)后，可促進(jìn)成骨細(xì)胞分化指標(biāo)表達(dá)，但文中并未明確標(biāo)明實(shí)驗(yàn)所用成骨細(xì)胞系的種類，且僅涉及hAMSCs對(duì)成骨細(xì)胞分化功能的影響[20]，同時(shí)培養(yǎng)兩種細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)操作難度大。有體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)植入的MSCs在體內(nèi)存活時(shí)間短、分化活性差[13-14]，且MSCs在儲(chǔ)存、培養(yǎng)和應(yīng)用操作中相對(duì)復(fù)雜，而MSC-CM可更方便臨床應(yīng)用，且不用擔(dān)心體內(nèi)成瘤的風(fēng)險(xiǎn)[21]，所以在組織修復(fù)的體內(nèi)應(yīng)用中，MSC-CM有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

綜上所述，本研究通過(guò)提取并鑒定hAMSCs，收取hAMSC-CM作用于成骨細(xì)胞，可顯著增強(qiáng)成骨細(xì)胞生物活性，為hAMSCs在骨組織修復(fù)領(lǐng)域的進(jìn)一步研究提供了理論基礎(chǔ)。