Prx1+骨骼干細胞的研究進展

曾毓璐，唐國華

顱頜面創(chuàng)傷或發(fā)育畸形嚴重損害患者的身心健康，基于干細胞的再生治療技術(shù)為其臨床治療帶來了新的希望。但無論是外源性的組織工程技術(shù)或驅(qū)動內(nèi)源性干細胞的活化，都要求明確干細胞類型及相關(guān)分子生物學(xué)機制。間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是指在體外具有克隆性，能貼壁生長；強表達CD90、CD73、CD105、CD44；造血系標志物陰性；具備三系分化能力(成骨、成軟骨、成脂)的一群細胞[1]。但體外條件存在改變細胞特性的可能，不同組織來源的MSCs在體內(nèi)表現(xiàn)出了極大的異質(zhì)性。因此Bianco等[2]在2015年明確了骨骼干細胞的概念，強調(diào)其在體內(nèi)能分化為非造血系的骨組織相關(guān)細胞(包括骨、軟骨、脂肪和基質(zhì)細胞)，并具有自我更新能力。因其強調(diào)了體內(nèi)成骨特性，在描述骨組織來源的多能干細胞時比MSCs更為準確，但目前尚缺乏明確一致的骨骼干細胞(skeletal stem cells，SSCs)標志物[3]。長骨中的Prx1+、Gremlin1+、PTHrP+細胞，顱面骨中的Gli1+、Prx1+、Axin2+細胞分別被證實具有SSCs的特征[4-5]。目前顱頜骨SSCs的研究剛剛起步，而對長骨SSCs的研究則相對較多[6]。長骨和顱面骨的Prx1+細胞表現(xiàn)出相似的特征，且長骨中Prx1+細胞也參與介導(dǎo)膜內(nèi)成骨，因此Prx1+在長骨中的表現(xiàn)可以在一定程度上為顱面部SSCs的研究提供思路。本文回顧了Prx1基因在骨發(fā)育、改建、再生中的作用，以及Prx1+SSCs的研究進展，希望能為顱面部SSCs的深入研究提供參考。

1 Prx1基因

Prx1是編碼轉(zhuǎn)錄因子的同源盒基因，在胚胎肢芽形成和顱面發(fā)育階段高表達，其缺失會造成嚴重的發(fā)育畸形。以往的研究表明Prx1與間充質(zhì)細胞未分化狀態(tài)的維持相關(guān)，并通過間質(zhì)凝集而參與骨的發(fā)育。

1.1 Prx1基因與胚胎發(fā)育

脊椎動物的骨組織起源于成骨前的間質(zhì)凝集，Prx1可能在間質(zhì)凝集早期介導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化而參與骨的形成[7]。Prx1功能失活的突變體在顱骨、肢芽、脊柱中出現(xiàn)了骨性缺損[8]。并且，Prx1協(xié)同與其功能相似的Prx2基因一起維持顱面部間充質(zhì)細胞的未分化狀態(tài)，Prx1-/-Prx2-/-的小鼠表現(xiàn)出了嚴重的畸形，包括外耳、中耳和內(nèi)耳的缺損，顱骨質(zhì)量減輕，腭裂，下頜骨缺損，下中切牙缺失，磨牙形態(tài)異常，并在出生后24 h內(nèi)死去[9-11]。與小鼠類似，人Prx1基因的突變會造成無下頜合并耳畸形[12]。

1.2 Prx1基因參與維持干細胞特征

Prx1只在未分化的間充質(zhì)細胞中表達，并隨著分化而逐漸停止表達，提示Prx1具有抑制間充質(zhì)細胞分化的作用[9]。非編碼RNAgga-mir-133a-3p可通過抑制Prx1的表達來促進成肌細胞的分化[13]。Prx1的敲除可通過抑制轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)通路促進MSCs成脂，提示Prx1可能抑制MSCs的成脂分化[14]。在腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α)作用下，Prx1表達增加，且Prx1的過表達能下調(diào)MSCs中的成骨分化相關(guān)基因Osx和RUNX2，提示Prx1是TNF-α抑制MSCs成骨分化的中間媒介[15]。此外，Prx1使少突膠質(zhì)祖細胞的基因表達呈現(xiàn)靜止期特征[16]，還參與維持了神經(jīng)干細胞的自我更新能力[17]。Prx1對分化的抑制和對干細胞特征的維持使其具備了成為干細胞標志物的條件。

1.3 Prx1-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠模型

Cre-loxP系統(tǒng)是一種基因編輯技術(shù)，Cre重組酶可靶向切除loxP位點錨定的序列。Logan等[18]利用Prx1基因的增強子構(gòu)建了Prx1-Cre小鼠，在Prx1調(diào)控元件的作用下，細胞條件性地表達Cre重組酶。當Prx1-Cre小鼠與帶有l(wèi)oxP錨定目標基因的小鼠雜交時，其后代的Prx1+細胞發(fā)生由Cre介導(dǎo)的基因重組，可表達標記基因(如熒光蛋白或β-半乳糖苷酶)從而對Prx1+細胞進行譜系示蹤，也可以特異性地刪除某些基因構(gòu)建條件敲除模型[19-20]，因此被廣泛用于骨發(fā)育相關(guān)的研究。Cre酶與雌激素受體(estrogen receptor，ER)融合后，在他莫昔芬(tamoxifen)誘導(dǎo)下表達，使重組具有了時間上的可控性，Prx1-CreER小鼠可用于觀察出生后Prx1+細胞在成體小鼠中發(fā)揮的作用。比如，將Prx1-CreER小鼠與條件表達白喉毒素的小鼠Rosa26LoxP-STOP-loxP-DTA雜交，可得到Prx1譜系刪失的小鼠，從而觀察成體中Prx1譜系刪失對個體的影響。Prx1-Cre工具鼠的構(gòu)建極大地推動了Prx1+細胞的分離、鑒定，并允許研究人員觀察其在組織的分布情況、追蹤其體內(nèi)去向、觀察其對個體發(fā)育或穩(wěn)態(tài)維持的影響，是研究Prx1+細胞最常用的手段之一。

2 長骨中Prx1+ SSCs

長骨中的Prx1+細胞在體外高表達MSCs的標志物，在體內(nèi)能發(fā)生擴增并分化為成骨細胞或軟骨細胞，表現(xiàn)出SSCs樣特征。近期Prx1+SSCs作為機械應(yīng)力響應(yīng)細胞受到關(guān)注。

2.1 分布和鑒定

Greenbaum等[21]和Ducharmp等[22]使用Prx1-Cre衍生小鼠，持續(xù)標記包括胚胎期在內(nèi)的Prx1+細胞，分別鑒定了骨髓和骨膜中的Prx1+細胞，二者均表現(xiàn)出MSCs的部分特征。骨髓中的Prx1+細胞群能對造血干細胞起到支持作用，部分與PDGFRα+Sca1+細胞群交疊，具有成纖維細胞克隆形成單位(colony-forming unit-fibroblast，CFU-F)活性，在體外具有成骨和成脂分化能力，但基因圖譜分析表明它們并不表達Nestin、CD146、LepR等MSCs的標志物[21, 23]。骨膜Prx1+細胞在體外具有三系分化能力，共表達PDGFRα、Gremlin 1、Cxcl12、Nestin等MSCs標志物，但不表達LepR[22]。與以上報道不同，Kawanami等[24]和Ouyang等[25]使用Prx1-CreER衍生小鼠，僅標記了成體小鼠中的Prx1+細胞，發(fā)現(xiàn)Prx1+主要分布于靠近皮質(zhì)骨的骨膜中，其在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)下具有成骨和成軟骨分化潛能。這與Moore等[26]的實驗結(jié)果一致，即成體小鼠的Prx1+定位于骨膜生發(fā)層和軟骨膜，未見于皮質(zhì)骨、小梁骨、骨髓和肌肉中。這些報道提示，Prx1+SSCs在胚胎期分布在骨髓和骨膜中，而出生后Prx1+細胞較為局限，僅表達于骨膜中。

2.2 Prx1+細胞參與長骨創(chuàng)傷修復(fù)

在長骨骨折的愈合過程中，凝血塊逐漸機化并形成骨痂連接斷端。Ducharmp de Lageneste等[22]和Murao等[27]發(fā)現(xiàn)骨痂中的細胞幾乎全部來自于局部招募的骨膜Prx1+細胞，并排除了參與骨折修復(fù)的Prx1+細胞為循環(huán)來源的可能性。Wang等[28]則發(fā)現(xiàn)在骨折后10 d，Prx1+的后代骨細胞嵌入了斷端靠近骨膜的皮質(zhì)骨內(nèi)，Prx1+細胞及其子代細胞也分布于連接斷端的軟骨內(nèi)，但并未出現(xiàn)在骨內(nèi)膜及骨髓側(cè)，作者因此得出了Prx1+細胞通過骨表面的膜內(nèi)成骨和骨痂中的軟骨內(nèi)成骨參與骨折修復(fù)的結(jié)論。這些實驗提示，骨膜Prx1+SSCs可能通過被招募到創(chuàng)傷位點，為創(chuàng)傷修復(fù)提供成骨或成軟骨細胞的方式參與長骨創(chuàng)傷的修復(fù)。

2.3 骨膜Prx1+應(yīng)答機械應(yīng)力

骨膜Prx1+SSCs是應(yīng)力敏感細胞，能在應(yīng)力作用下發(fā)生增殖、分化。近期的研究提示，纖毛介導(dǎo)了骨膜Prx1+SSCs對應(yīng)力的應(yīng)答作用，且骨增齡性變化與Prx1+SSCs密切相關(guān)。

首先，Prx1+細胞刪失的小鼠個體在未受力和受到軸向壓力的條件下均表現(xiàn)出了礦化沉積率的下降和骨形成速度的減緩，提示Prx1+細胞不但在靜息狀態(tài)參與骨的維持，也介導(dǎo)了機械誘導(dǎo)成骨反應(yīng)[26]。在軸向壓力的作用下，骨膜中Prx1+細胞的總數(shù)和處于增殖狀態(tài)(Ki67+)的Prx1+細胞數(shù)均增加[29]，代表了Prx1+在應(yīng)力作用下出現(xiàn)的增殖反應(yīng)。在長骨缺損模型中，與有創(chuàng)傷未加力的對照組相比，壓力在術(shù)后2～5 d和5～8 d分別使處于增殖狀態(tài)的Prx1+Sca1+SSCs數(shù)目增加了116%和114%[30]，則進一步說明了Prx1+細胞能在創(chuàng)傷條件下響應(yīng)應(yīng)力增殖，有利于缺損修復(fù)。體外培養(yǎng)的Prx1+細胞在振蕩流體流動中1 h后即表現(xiàn)出COX-2和OPN的mRNA上調(diào)[26]，代表了Prx1+細胞群在應(yīng)力下快速產(chǎn)生了細胞反應(yīng)，并表現(xiàn)出成骨分化趨勢[26]。軸向壓力施加數(shù)日后，Prx1+子代骨細胞出現(xiàn)在了皮質(zhì)骨中，為Prx1+響應(yīng)應(yīng)力成骨提供了體內(nèi)證據(jù)[31]。

初級纖毛是能將外界刺激轉(zhuǎn)化為細胞內(nèi)信號級聯(lián)的感覺細胞器，在深入探討Prx1+響應(yīng)應(yīng)力的具體機制時，研究人員發(fā)現(xiàn)初級纖毛的作用至關(guān)重要。首先，初級纖毛在Prx1+細胞內(nèi)的條件敲除顯著減少了軸向壓力誘導(dǎo)成骨的量[31]，表明初級纖毛對Prx1+響應(yīng)機械力成骨的過程是必須的。在初級纖毛完整時，流體剪切力可使Prx1+SSCs的OPN，RUNX2表達上調(diào)，條件敲除Prx1+SSCs中的纖毛后則不再有這種改變，提示初級纖毛可能參與了Prx1+細胞感知流體剪切力的過程[26]。此外，纖毛還介導(dǎo)了Prx1+細胞對旁分泌信號的響應(yīng)，受到機械刺激的骨細胞的條件培養(yǎng)基用于培養(yǎng)Prx1+細胞時，能夠促進Prx1+的成骨分化，但當Prx1+細胞的纖毛被敲除時，這種效應(yīng)便消失了[26]。

Prx1+細胞的增齡性變化可能是老年個體骨質(zhì)疏松的機制之一。首先，在老年小鼠的骨膜中，應(yīng)力響應(yīng)的Prx1+細胞數(shù)量在靜息狀態(tài)下少于成年小鼠。在軸向壓力作用下，老年鼠增殖的Prx1+細胞數(shù)量較少，增殖狀態(tài)維持的時間也短于成年小鼠，代表其機械響應(yīng)能力的下降[29]。Prx1+在應(yīng)力下的分化狀態(tài)是否會隨年齡改變有待研究。

3 顱面Prx1+ SSCs

近期的研究同樣證實了Prx1+SSCs在顱面部中的存在，顱縫和牙周膜中的Prx1+細胞參與了組織缺損的修復(fù)。

3.1 顱縫SSCs的鑒定、分布、功能

Wilk等[32]檢測了8～32周小鼠中Prx1+細胞的分布，發(fā)現(xiàn)顱面骨中的Prx1+細胞主要存在于顱縫中，但是限于后額縫、冠狀縫、矢狀縫和人字縫，并且隨年齡的增加而不斷減少，其他顱面縫、骨膜、硬腦膜和骨髓中均無表達。顱骨中分離出的Prx1+細胞可以體外形成克隆單位，在基因分析上表現(xiàn)出兩個特點：首先是MSCs樣的特征：包括高表達Pdgfrα和Mcam/Cd146；其次是典型靜止期細胞的特征：低表達與細胞周期、染色體分裂和DNA復(fù)制相關(guān)的基因如Ccne2、Mcm4、Pcna；高表達與干細胞歸巢相關(guān)的Itga2、Itga3、Itga6；高表達Wnt通路抑制基因Dkk1和Sost，有助于其維持未分化狀態(tài)[32]。

細胞譜系追蹤實驗顯示Prx1+細胞在生理情況下參與形成顱縫周圍的骨膜和骨組織。在顱骨受到創(chuàng)傷時，可以直接觀察到帶有標記的Prx1+細胞進入創(chuàng)傷區(qū)，衍生為成骨細胞和骨細胞，并嵌入到新生骨中，Prx1+譜系刪失和顱縫切除均會引起愈合障礙，表明Prx1+SSCs參與顱骨缺損的修復(fù)[32]。

Chang等[33]通過Prx1-Wnt-GFP報道小鼠觀察了骨損傷模型中Prx1+細胞內(nèi)的經(jīng)典Wnt信號活動，結(jié)果顯示Prx1+細胞參與由Wnt通路介導(dǎo)的膜內(nèi)骨修復(fù)。 Yeh等[34]使用轉(zhuǎn)基因鼠模型對Prx1+細胞展開譜系追蹤，并用不同顏色熒光標記了Prx1+細胞及其子代細胞，發(fā)現(xiàn)使用經(jīng)典Wnt通路激動劑Wnt3a處理后的顱縫在體積并未增加情況下，顱縫兩側(cè)均有新生骨的沉積，Prx1+細胞數(shù)量未明顯增多，但其子代骨細胞明顯增多， 并嵌入到新生骨中，提示經(jīng)典Wnt可能促進了Prx1+細胞的分化。

3.2 牙周組織中的Prx1+細胞

Bassir等[35]近期確認了Prx1+細胞存在于小鼠切牙和磨牙的牙周膜韌帶中，并且切牙中的表達明顯高于磨牙，鑒于小鼠的切牙是終生不斷萌出的，Prx1+細胞很可能參與了牙周膜的持續(xù)改建和再生。使用DTA對小鼠Prx1+細胞進行譜系刪失會導(dǎo)致發(fā)育中的小鼠牙周膜間隙的明顯增大，提示Prx1+參與了牙周組織的發(fā)育和維持，Prx1+譜系刪失的小鼠同樣表現(xiàn)出牙槽骨缺損修復(fù)障礙，表明Prx1+細胞參與了牙周組織修復(fù)再生的過程。

牙周組織來源的Prx1+細胞在體外基因分析上與顱縫Prx1+SSCs十分相似，并且Prx1基因在人類牙周膜干細胞中高表達[35]。因此探明Prx1+細胞在牙周組織再生中的作用，有助于激活內(nèi)源性牙周膜干細胞的再生潛能，不僅有望為牙周治療重建牙周組織提供希望，也有望加快正畸牙槽骨改建，提高正畸治療的效率和成功率。

4 展 望

Prx1+細胞具有自我更新能力，可以為骨組織的發(fā)育、改建、創(chuàng)傷再生提供成骨和成軟骨細胞，有望用于干細胞治療去解決骨缺損或骨代謝類的問題。此外，Prx1+細胞與應(yīng)力的關(guān)系非常值得關(guān)注。力是調(diào)控顱面部骨改建的重要控制因素，Prx1+細胞主要分布在骨膜、牙周膜、顱縫等應(yīng)力豐富的區(qū)域，因此Prx1+細胞很可能是機械力調(diào)控骨改建的細胞靶點之一。目前顱面部SSCs與應(yīng)力相關(guān)的研究相對缺乏，明確機械力對骨縫或牙周膜中Prx1+細胞的作用，有望為臨床調(diào)控顱面骨生長、促進牙槽骨再生提供新的治療策略。