高糖對人牙髓細(xì)胞增殖及氧化應(yīng)激的影響

凌曉旭，王家鳳，沙 青，程博群，張志民

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一種高發(fā)病率、嚴(yán)重危害人類健康的代謝性疾病[1]。糖尿病的慢性高血糖癥會造成多種器官的損傷，發(fā)生多種并發(fā)癥如心血管疾病、慢性腎病、糖尿病眼病和糖尿病足等[2]。糖尿病患者口腔問題的發(fā)生率也很高，如齲齒、口干、牙周病、唾液腺功能障礙和口腔感染[3]。牙髓是一種疏松結(jié)締組織，在組織穩(wěn)態(tài)、損傷和衰老過程中，牙髓的活力取決于牙髓細(xì)胞的活性。牙髓細(xì)胞活性的降低可導(dǎo)致炎癥在內(nèi)的多種病理狀態(tài)產(chǎn)生[4]。糖尿病患者的牙髓可能病變近年來引起口腔學(xué)者的重視。糖尿病可能是牙髓感染的調(diào)節(jié)因素。由糖尿病引起的血管病變可能干擾組織營養(yǎng)和牙髓修復(fù)，并可能為厭氧微生物的發(fā)育創(chuàng)造微需氧狀態(tài)[5]。糖尿病影響牙髓的愈合能力，病理性鈣化增加[6]。

氧化應(yīng)激為糖尿病并發(fā)癥的一個重要致病因素，是高糖誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的主要因素。已有研究高糖對牙周膜干細(xì)胞、心肌細(xì)胞、足細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)細(xì)胞等氧化應(yīng)激的影響。高糖是否誘導(dǎo)牙髓細(xì)胞的氧化應(yīng)激，目前還缺乏相關(guān)資料。因此，為闡明高糖環(huán)境下牙髓活力改變的相關(guān)機(jī)制，本研究主要研究了不同濃度葡萄糖對人牙髓細(xì)胞(human dental pulp cells，HDPCs)增殖和氧化應(yīng)激的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

HDMEM培養(yǎng)基、PBS、青/鏈霉素、0.25%胰酶(Hyclone，美國)；胎牛血清(FBS)(BI，美國)；Ⅰ型膠原酶(Sigma，美國)；線粒體膜電位試劑盒(JC-1)、CCK-8(碧云天公司，中國)；Anti-Cytokeratin8、Anti-Vimentin、HRP標(biāo)記兔抗鼠二抗(萬類生物公司，中國)；丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、活性氧(reactive oxygen species，ROS)試劑盒(南京建成公司，中國)；倒置相差顯微鏡(Olympus，日本)；5%CO2恒溫培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific，美國)；流式細(xì)胞儀(BD AccuriTMC6，美國)。

1.2 人牙髓細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定

收集吉林大學(xué)口腔醫(yī)院口腔頜面外科門診18～25歲健康、完整無齲的第三磨牙，均經(jīng)患者(或家屬)知情同意。將拔出的牙齒在無菌條件下取出牙髓消化離心后移至培養(yǎng)瓶，37 ℃、5%CO2細(xì)胞孵箱培養(yǎng)，3 d換液1次，爬出細(xì)胞密度達(dá)80%～90%時進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取處于對數(shù)期生長穩(wěn)定的牙髓細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，以5×103個/孔接種于24孔板中，行細(xì)胞波形蛋白及角蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色，于倒置顯微鏡下觀察。

1.3 實驗分組

含葡萄糖濃度為25 mmol/L為正常組，葡萄糖5.5 mmol/L的培養(yǎng)液設(shè)為低糖組，50 mmol/L為高糖組，與50 mmol/L組滲透壓相等并與5.5 mmol/L組葡萄糖濃度相等為高滲組，每組設(shè)4個復(fù)孔。實驗重復(fù)3次。

1.4 CCK-8檢測細(xì)胞增殖

將生長對數(shù)期的細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，不同葡萄糖濃度分別培養(yǎng)1、3、5 d，每天同一時間，每孔加入100 μL不含血清的DMEM 培養(yǎng)基，再加10 μL CCK-8，混勻后避光置于37 ℃CO2孵育箱培養(yǎng)1 h，以空白孔為調(diào)零孔，酶標(biāo)儀測定在450 nm處吸光度值。

1.5 不同濃度葡萄糖對牙髓細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

1.5.1 不同濃度葡萄糖對ROS的影響 ①熒光顯微鏡檢測細(xì)胞內(nèi)ROS含量：將細(xì)胞以1×105個/孔接種于6孔培養(yǎng)板，分組培養(yǎng)，達(dá)到干預(yù)時間72 h后，棄原培養(yǎng)基，加入含終濃度為10 μmol/L的熒光染料DCFH-DA的無血清培養(yǎng)基在37 ℃條件下避光孵育30 min，預(yù)溫PBS洗3次，清洗結(jié)束后，孔板內(nèi)可剩余少量PBS，熒光顯微鏡下觀察并采集圖片。 ②熒光酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞內(nèi)ROS含量：將細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，72 h后加入DCFH-DA熒光酶標(biāo)儀分析，激發(fā)波長480 nm，發(fā)射波長530 nm。

1.5.2 不同濃度葡萄糖對MDA、SOD的影響 將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，不同條件處理后72 h，PBS清洗兩遍后棄盡液體，加入0.1%細(xì)胞裂解液400 μL，采用MDA、SOD試劑盒測定細(xì)胞中MDA、SOD的含量。

1.6 線粒體膜電位檢測

采用JC-1熒光探針在細(xì)胞內(nèi)的紅/綠熒光強(qiáng)度比例來衡量線粒體去極化程度。細(xì)胞于培養(yǎng)瓶內(nèi)不同條件培養(yǎng)72 h后，制備細(xì)胞懸液，加入JC-1在37 ℃孵育30 min，流式細(xì)胞術(shù)檢測線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential, MMP)的變化情況。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 牙髓細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒定

利用組織塊酶消化法獲得的人牙髓組織順利貼壁，培養(yǎng)3～5 d后，顯微鏡下觀察可見組織塊周圍有細(xì)胞游出，細(xì)胞呈長梭形。約20 d左右細(xì)胞密度達(dá)80%時，用胰酶進(jìn)行消化按1∶2傳代培養(yǎng)，細(xì)胞呈放射狀或旋渦狀排列。體外培養(yǎng)的HDPCs抗波形蛋白染色陽性，胞質(zhì)內(nèi)可見棕黃色顆粒附著，抗角蛋白染色陰性，胞質(zhì)內(nèi)未見棕黃色顆粒，胞質(zhì)呈粉色，胞核呈藍(lán)色(圖1)。

2.2 不同濃度葡萄糖對牙髓細(xì)胞增殖活性的影響

高糖對體外HDPCs增殖的影響結(jié)果如下：①不同濃度的葡萄糖刺激HDPCs 1 d及3 d，低糖組和高糖組的OD值呈時間依賴性增高，增殖的峰值均出現(xiàn)在25 mmol/L葡萄糖濃度的正常組(與低糖組及高糖組比較，P<0.05)。②不同葡萄糖刺激HDPCs 5 d，低糖組與高糖組均有所下降，峰值出現(xiàn)在正常組(與低糖組及高糖組比較，P<0.05)。③高滲透壓刺激HDPCs,細(xì)胞增殖較正常組下降。

1a：原代人牙髓細(xì)胞培養(yǎng)第6天形態(tài)( ×40)；1b：人牙髓細(xì)胞第三代形態(tài)( ×40)；1c：波形蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽性( ×100)；1d：角蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色陰性( ×100)圖1 人牙髓細(xì)胞的形態(tài)Fig.1 Morphology of HDPCs

圖2 不同濃度的葡萄糖對HDPCs增殖的影響Fig.2 Proliferation effect of various concentrations of glucose on HDPCs

2.3 不同濃度葡萄糖對ROS的影響

熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)各實驗組均出現(xiàn)綠色熒光，但強(qiáng)度不同，在正常組及低糖組的熒光強(qiáng)度較弱，而高糖組的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，如圖3。采用多功能酶標(biāo)儀對96孔板進(jìn)行ROS定量測定，結(jié)果表明：各實驗組熒光強(qiáng)度存在明顯差異，高糖組OD值明顯高于其他3組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，如圖4。

2.4 不同濃度葡萄糖對MDA、SOD的影響

4組細(xì)胞中抗氧化應(yīng)激物質(zhì)的分析如下：MDA含量高糖組OD值(2.44±0.30)，明顯高于正常組(1.39±0.12)，而SOD正常組(43.51±0.33)明顯高于高糖組(23.52±0.38)，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明高糖環(huán)境中SOD的活力降低，抗氧化能力下降。高滲組中MDA(1.49±0.35)、SOD(34.65±0.53)均與高糖組存在明顯差異，說明高糖對于牙髓細(xì)胞的影響并非由滲透壓引起，而是因改變了細(xì)胞內(nèi)代謝物質(zhì)引起。見圖5。

3a：正常組；3b：低糖組；3c：高糖組；3d：高滲組圖3 不同濃度葡萄糖HDPCs細(xì)胞ROS水平( ×100)Fig.3 The level of ROS in HDPCs under different concentrations of glucose( ×100)

**：P<0.01，***：P<0.001圖4 不同濃度葡萄糖牙髓細(xì)胞ROS的含量 Fig.4 The content of ROS in HDPCs under different concentrations of glucose

*：P<0.05，***：P<0.001圖5 不同濃度葡萄糖牙髓細(xì)胞 MDA、SOD水平Fig.5 The levels of MDA and SOD in HDPCs under different concentrations of glucose

2.5 不同濃度葡萄糖對線粒體膜電位的影響

JC-1試劑檢測結(jié)果如圖6所示，右上象限(Q2) 表示JC-1在細(xì)胞線粒體基質(zhì)內(nèi)，以聚合物的形式存在，產(chǎn)生紅色熒光，說明細(xì)胞正常，MMP較高，右下象限(Q4) 表示 JC-1在細(xì)胞內(nèi)以單體形式存在，不能聚集在線粒體中，發(fā)出綠色熒光，細(xì)胞處于凋亡早期，MMP較低。高糖組(16.5%) 與正常組(7.8%) 相比，綠色熒光明顯增強(qiáng)，表示JC-1單體形態(tài)增多，提示高糖處理后的細(xì)胞線粒體膜電位降低。

6a：正常組；6b：低糖組；6c：高糖組；6d：高滲組圖6 不同濃度葡萄糖對HDPCs細(xì)胞線粒體膜電位的影響Fig.6 Effects of different glucose concentrations on mitochondrial membrane potential in HDPCs

3 討 論

口腔健康與糖尿病的關(guān)系已在文獻(xiàn)中被廣泛報道。在牙髓根尖周病方面，高糖水平增加大鼠牙髓組織骨橋蛋白的產(chǎn)生和病理鈣化[6]。高血糖刺激骨吸收，抑制成骨細(xì)胞分化，骨修復(fù)能力降低[7]，根尖周病變的發(fā)生率提高。有研究發(fā)現(xiàn)暴露于DM患者口腔菌斑的牙髓干細(xì)胞的克隆數(shù)量明顯減少[8]。一篇最近的綜述納入了10項研究以探討DM對牙髓及根尖周病變演變的影響，分析表明DM作為牙髓病理進(jìn)展的危險因素，影響疾病的易感性、流行、發(fā)展和組織愈合能力[9]。而對高糖環(huán)境中牙髓細(xì)胞變化的研究較少，因此研究高濃度葡萄糖對牙髓細(xì)胞的影響對探明糖尿病患者牙髓組織結(jié)構(gòu)變化及其作用機(jī)制具有重要意義。

越來越多的證據(jù)表明，高濃度葡萄糖會對不同的器官、組織和細(xì)胞類型產(chǎn)生不同的影響。高糖環(huán)境可能通過下調(diào)cyclin D1和上調(diào)p21抑制牙周膜細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程[10]。另有研究表明，與其他類型的細(xì)胞相比，成纖維細(xì)胞更能抵抗高葡萄糖水平，只有當(dāng)葡萄糖濃度達(dá)到33.3 mmol/L以上時，細(xì)胞凋亡才會顯著增加[11]。本實驗采用高濃度葡萄糖干預(yù)體外培養(yǎng)的牙髓細(xì)胞以模擬體內(nèi)高糖環(huán)境，發(fā)現(xiàn)25 mmol/L葡萄糖作用于牙髓細(xì)胞1、3、5 d后，牙髓細(xì)胞形態(tài)良好，細(xì)胞增殖活性最強(qiáng)，提示25 mmol/L是細(xì)胞生長的最適濃度。因此，將該葡萄糖濃度作為正常培養(yǎng)葡萄糖濃度組。我們選擇了體外濃度為50 mmol/L作為高糖組，這個劑量也得到了實驗中毒性試驗的支持，但是在該實驗中25 mmol/L高糖也明顯抑制HDPCs增殖[12]，我們的實驗中發(fā)現(xiàn)25 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)牙髓細(xì)胞1、3 d后，細(xì)胞增殖活性強(qiáng)，高濃度50 mmol/L葡萄糖作用后，細(xì)胞增殖活性顯著降低(P<0.05)。隨著培養(yǎng)時間的延長，5 d后各實驗組牙髓細(xì)胞的增殖受到抑制，細(xì)胞整體活性均較低，原因可能是隨著細(xì)胞增多，生長空間不足以及有害代謝產(chǎn)物的累積等。

牙髓作為牙本質(zhì)-牙髓復(fù)合體的一部分，是一種高度血管化的組織，長期的血糖水平失衡導(dǎo)致牙本質(zhì)AGE(糖基化終產(chǎn)物)的積累[13]。RAGE(AGE受體)分配在牙髓細(xì)胞表面，可能導(dǎo)致ROS水平劑量依賴性的增加[14]，高濃度的ROS激活免疫反應(yīng)，細(xì)胞因子的產(chǎn)生增加，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞反應(yīng)[15]。糖尿病時，牙髓內(nèi)ROS代謝增強(qiáng)，氧化應(yīng)激增強(qiáng)[16]。本研究結(jié)果與其一致。氧化應(yīng)激為糖尿病并發(fā)癥的一個重要致病因素。MDA是ROS與多不飽和脂肪酸反應(yīng)的產(chǎn)物，檢測細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度以反映氧化應(yīng)激水平。而SOD是一種重要的、普遍存在的酶，具有中和超氧自由基的重要作用，是體現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)還原力水平的指標(biāo)。本研究檢測了不同濃度葡萄糖干預(yù)后牙髓細(xì)胞中ROS水平、MDA及SOD活力。結(jié)果顯示，高糖組細(xì)胞內(nèi)ROS和MDA含量均增加，而SOD活力降低，提示高濃度葡萄糖促進(jìn)ROS生成，使MDA含量增高，降低牙髓細(xì)胞中抗氧化酶SOD的活力，從而誘導(dǎo)牙髓細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致牙髓細(xì)胞損傷，這可能是高糖微環(huán)境引發(fā)牙髓病變的機(jī)制之一。Leite[17]的研究結(jié)果顯示糖尿病改變了牙髓的抗氧化系統(tǒng)，而動物實驗中，糖尿病大鼠牙髓組織SOD活性降低[18]。

線粒體作為細(xì)胞的能量代謝中心，在維持細(xì)胞的功能和代謝方面發(fā)揮了重要作用，線粒體功能障礙則可能導(dǎo)致細(xì)胞損傷。氧化應(yīng)激被認(rèn)為是糖尿病及其相關(guān)并發(fā)癥發(fā)病和進(jìn)展的一個因素，線粒體和細(xì)胞核是氧化應(yīng)激的兩個主要靶點(diǎn)。線粒體是ROS的主要來源，特別是受損傷的線粒體可以釋放出大量ROS，同時線粒體也容易受到ROS攻擊而損傷，高水平的線粒體ROS損害線粒體膜，并與線粒體膜滲透性增加有關(guān)，后者導(dǎo)致ROS向細(xì)胞質(zhì)中滲漏，并損害其他細(xì)胞器[19]。線粒體膜電位的變化能反映氧化應(yīng)激的水平[20]。最近，Rizwan等[21]的實驗研究了高糖環(huán)境對皮膚角化細(xì)胞影響，隨葡萄糖水平升高，細(xì)胞中ROS不斷積累，通過應(yīng)激信號通路觸發(fā)細(xì)胞線粒體功能障礙、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡。而高糖環(huán)境誘導(dǎo)的HDPCs氧化應(yīng)激、線粒體損傷及機(jī)制有待深入研究，本實驗檢測葡萄糖水平升高后牙髓細(xì)胞MMP降低，說明細(xì)胞處于凋亡早期，高糖可誘導(dǎo)牙髓細(xì)胞的凋亡，為后續(xù)實驗奠定基礎(chǔ)。

綜上所述，高糖濃度抑制牙髓細(xì)胞的增殖，導(dǎo)致HDPCs線粒體膜電位下降，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激產(chǎn)生，高血糖環(huán)境降低了牙髓細(xì)胞的活力，也可能是糖尿病患者牙髓組織發(fā)生改變的一個潛在因素。本實驗仍存在不足，未探討高糖對牙髓病狀態(tài)下牙髓細(xì)胞的影響，進(jìn)一步解釋糖尿病與牙髓病的關(guān)系。關(guān)于高糖誘導(dǎo)牙髓細(xì)胞凋亡的深層次機(jī)制、高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激介導(dǎo)線粒體功能障礙和應(yīng)激信號級聯(lián)反應(yīng)的改變、信號通路等，尚需要進(jìn)一步研究。