10-MDP-鈣鹽形成對(duì)牙本質(zhì)粘接成績(jī)影響的評(píng)價(jià)

王 琦，沈佳娣，吳欣祎，謝海峰，陳 晨

樹(shù)脂與牙本質(zhì)的粘接都依賴于“混合層(HL)”的形成，它是決定粘接強(qiáng)度的主要因素[1]。在牙科粘接劑體系中摻入功能性單體被發(fā)現(xiàn)可以防止HL層的降解[2]，10-甲基丙烯酰氧基癸基磷酸二氫鹽(10-MDP)是一種使用最廣泛、最穩(wěn)定的酸性功能單體，已有研究證明10-MDP可與羥基磷灰石建立穩(wěn)定的化學(xué)相互作用并耐水解，從而延長(zhǎng)HL的保存時(shí)間[3-4]。HL內(nèi)暴露的膠原纖維水解是HL降解的主要因素之一，而暴露的膠原纖維極易受到人牙本質(zhì)中內(nèi)源性基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的影響，從而導(dǎo)致混合層水解，降低粘接強(qiáng)度[5]。既然10-MDP與羥基磷灰石能夠形成鈣鹽，而這一化學(xué)結(jié)合是否有助于保護(hù)牙本質(zhì)膠原纖維抵抗MMPs的降解尚值得研究。當(dāng)前研究即通過(guò)微拉伸粘接強(qiáng)度、原位酶譜及X射線衍射分析評(píng)價(jià)10-MDP-鈣鹽的形成對(duì)牙本質(zhì)粘接成績(jī)的影響。

1 材料與方法

1.1 牙本質(zhì)/樹(shù)脂粘接樣本制備

經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，收集20顆新鮮拔除無(wú)齲人類第三磨牙，去除牙齒表面的雜質(zhì)及軟組織。在流水狀態(tài)下使用低速金剛砂切割機(jī)(Isomet 1000, Buehler Ltd., Lake Bluff, IL, 美國(guó))垂直于牙體長(zhǎng)軸切割出16個(gè)3 mm厚的和4個(gè)1 mm厚的牙本質(zhì)片，去除表面牙釉質(zhì)，牙本質(zhì)片表面依次使用400目和600目碳化硅砂紙濕拋光1 min，以制備玷污層。使用牙科顯微鏡(OMS2350牙科顯微鏡，Zumax，中國(guó))仔細(xì)檢查所有的牙本質(zhì)表面，以確保沒(méi)有殘留的牙釉質(zhì)或牙髓暴露。然后，將牙本質(zhì)儲(chǔ)存在4 ℃ Hanks平衡鹽溶液中，用于制備牙本質(zhì)粘接試件。

本實(shí)驗(yàn)所用的含10-MDP的底涂劑參照以下配方制備[6]：10%的10-MDP(DM Healthcare Products，美國(guó))； 88.8%的無(wú)水乙醇(上海滬試，中國(guó)); 0.3%樟腦醌(CQ，阿拉丁，中國(guó));0.9%的4-二甲基氨基苯甲酸乙酯(4EDMAB，阿拉丁，中國(guó))。所有牙本質(zhì)表面均用35%磷酸酸蝕劑(Gluma Etch 35 Gel，德國(guó))酸蝕15 s，然后用水徹底沖洗30 s，牙本質(zhì)表面用吸水紙輕拭去除多余水分。然后將16個(gè)3 mm厚的牙本質(zhì)片隨機(jī)分為4組(n=4)，按照表1分組進(jìn)行處理。

表1 各組牙本質(zhì)試件的表面處理Tab.1 Surface treatment of dentin specimens in each group

使用含10-MDP的底涂劑涂布于10-MDP組酸蝕后的牙本質(zhì)表面20 s，并用光固化燈(EliparTMS10，3M ESPE，美國(guó))光固化20 s；將CHX(維真園，中國(guó))涂布于CHX組酸蝕后的牙本質(zhì)表面60 s，牙本質(zhì)表面用吸水紙輕拭去除多余水分。隨后每組將各自使用的粘接劑涂布于牙本質(zhì)表面，光固化20 s。然后，將復(fù)合樹(shù)脂(Filtek Z250，3M ESPE，美國(guó))分兩層堆置到涂布粘接劑的牙本質(zhì)表面上，每層2 mm，牢固壓實(shí)并光固化40 s。將每組的牙本質(zhì)/樹(shù)脂粘接樣本在37 ℃的蒸餾水中保存24 h和6個(gè)月。

1.2 微拉伸粘接強(qiáng)度測(cè)試

水儲(chǔ)24 h或6個(gè)月后，用低速切割機(jī)將每個(gè)牙本質(zhì)粘接的樣本垂直牙體長(zhǎng)軸切成約1 mm×1 mm的柱狀試件，每個(gè)粘接樣本中取最靠近中心的4～5根柱狀試件，用電子游標(biāo)卡尺(MNT-150，Meinaite，中國(guó))測(cè)量并記錄每根試件的橫截面積，精確至0.01 mm。將每個(gè)柱狀試件用氰基丙烯酸粘接劑粘接到微拉伸裝置(micro tensile tester，BISCO，美國(guó))的夾具上，并以1 mm/min的速度施加拉力，直到發(fā)生斷裂，記錄拉力F(N)。測(cè)量結(jié)果以MPa表示，是通過(guò)將斷裂時(shí)的作用力F(N)除以單個(gè)樣品的粘接面積得出的。記錄每組24 h和6個(gè)月水儲(chǔ)的微拉伸測(cè)試粘接強(qiáng)度(μTBS)，并計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行雙因素方差分析(Two-way ANOVA)，P<0.05為差異有顯著性意義。

1.3 X射線衍射分析(XRD)

取0.3 g羥基磷灰石粉，分為3份，按照表1分組進(jìn)行處理，反應(yīng)4 h。反應(yīng)完成后，加入丙酮，3 500 r/min離心20 min，倒出上清液，反復(fù)清洗3次，然后將反應(yīng)殘余物放置于37 ℃恒溫箱干燥4 h。通過(guò)射線衍射儀上進(jìn)行分析，工作電壓為40 kV，電流為200 mA，以連續(xù)方式進(jìn)行掃描，掃描2θ范圍為0.6°～40.0°，速度為0.02°/s，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.4 原位酶譜分析

按照表1分組對(duì)4個(gè)1 mm厚的牙本質(zhì)片表面進(jìn)行處理。將厚度為1 mm的流動(dòng)樹(shù)脂(Filtek Flow，3M ESPE，美國(guó))堆置到牙本質(zhì)上并光固化20 s，然后用低速切割機(jī)將其垂直于粘接界面切成1 mm厚的薄片，從厚度為1 mm的薄片中心區(qū)域切取出1 mm的柱狀試件，暴露出樹(shù)脂-粘接劑-牙本質(zhì)界面。

用砂紙將柱狀試件磨至厚度為500 μm的樣本，然后用氰基丙烯酸粘接劑粘到顯微鏡載玻片上以備用。使用DQ-明膠(dyequenched-gelatin)作為MMP底物(EnzChekTMGelatinase/Collagenase Assay Kit, Thermo Fisher Scientific, 美國(guó))進(jìn)行原位酶譜分析。通過(guò)向含有DQ-明膠的管中加入1.0 mL純水制備成1.0 mg/mL熒光素標(biāo)記的明膠溶液，將其儲(chǔ)存在-20 ℃直至使用。用1∶1的PBS緩沖液以體積比1∶8稀釋明膠原液，避光保存。用移液槍將50 μL明膠混合物置于載玻片上，使明膠混合液充分浸泡試件，并蓋上蓋玻片。將載玻片避光保存并在37 ℃恒溫箱內(nèi)孵育24 h。使用激光共聚焦顯微鏡(CLSM)(Zeiss LSM880 with NLO & Airyscan, 德國(guó))進(jìn)行分析，評(píng)估牙本質(zhì)內(nèi)源性明膠分解酶的活性。

2 結(jié) 果

2.1 微拉伸測(cè)試

4組試件分別在37 ℃水浴鍋中儲(chǔ)存24 h和6個(gè)月后的微拉伸強(qiáng)度測(cè)試值，見(jiàn)表2。

表2 在不同水儲(chǔ)情況下，4組μTBS結(jié)果Tab.2 μTBS results of 4 groups under different water storage conditions MPa

上標(biāo)大寫(小寫)字母表示表格中數(shù)值的橫向(縱向)比較，相同上標(biāo)大寫(小寫)字母表明兩組μTBS數(shù)據(jù)沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)

使用HSD檢驗(yàn)法和最小顯著性法統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，水儲(chǔ)24 h后，不同處理方式的4組微拉伸粘接強(qiáng)度均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均大于0.05)，然而水儲(chǔ)6個(gè)月后，對(duì)照組、10-MDP組、SBU組的微拉伸粘接強(qiáng)度相對(duì)于24 h者均顯著降低(P<0.05)，其中對(duì)照組最低；CHX組則在水儲(chǔ)6個(gè)月后維持了微拉伸粘接強(qiáng)度的穩(wěn)定(P=0.352)。

2.2 XRD

如圖1所示：對(duì)照組，10-MDP組和SBU組反應(yīng)殘留物的XRD圖譜，10-MDP組和SBU組分別在2θ=4.16°，7.34°和2θ=4.66°，7.02°(箭頭所示)有兩個(gè)特征性的峰，表明MDP-鈣鹽的形成[7]。

圖1 XRD結(jié)果Fig.1 Results of XRD

2.3 原位酶譜

各組樣本經(jīng)過(guò)24 h孵育后，原位酶譜結(jié)果如圖2顯示，對(duì)照組中在混合層以及牙本質(zhì)小管中可以看出強(qiáng)烈的綠色熒光標(biāo)記，這表明對(duì)照組中的明膠水解較強(qiáng)烈；與對(duì)照組相比，10-MDP組與SBU組熒光強(qiáng)度明顯減弱，表明這兩組明膠有被水解，但水解程度低于對(duì)照組，而10-MDP組與SBU組間的熒光程度沒(méi)有明顯區(qū)別；CHX組的熒光強(qiáng)度也較對(duì)照組低。

3 討 論

R：樹(shù)脂；D：牙本質(zhì)；HL：混合層圖2 原位酶譜結(jié)果Fig.2 Results of in situ zymography

CHX是一種有效和非特異性的MMPs抑制劑，在微拉伸結(jié)果中顯示，CHX組在24 h和6個(gè)月時(shí)的粘接強(qiáng)度無(wú)明顯區(qū)別(P>0.05)，這與原位酶譜結(jié)果一致，如圖1所示，在CHX組表現(xiàn)為最低的熒光強(qiáng)度，這與先前的研究一致[16]。Favetti等[17]提出，CHX可以在6個(gè)月內(nèi)保持粘接強(qiáng)度的耐久性。與CHX組比較，10-MDP組和SBU組微拉伸強(qiáng)度均有所降低(P<0.05)，這表明雖然10-MDP-鈣鹽的形成對(duì)內(nèi)源性牙本質(zhì)MMPs的活性被表現(xiàn)為抑制，但其抑制能力并不強(qiáng)于CHX。

此外，在微拉伸的結(jié)果中，10-MDP組與SBU組從24 h到6個(gè)月，粘接強(qiáng)度表現(xiàn)為明顯的降低(P<0.05)。這與一些研究結(jié)果不一致[18-19]。這可能是因?yàn)閷⒀辣举|(zhì)粘接樣本存儲(chǔ)在水環(huán)境中時(shí)，粘接劑會(huì)吸收水分，使其內(nèi)部的親水性和疏水性成分發(fā)生相分離，會(huì)增加水解作用的敏感性，從而使樹(shù)脂-牙本質(zhì)界面水解，導(dǎo)致微拉伸強(qiáng)度的下降[20]。

4 結(jié) 論

酸性功能單體10-MDP之所以能發(fā)揮作用，離不開(kāi)與羥基磷灰石之間相互作用形成的10-MDP-鈣鹽，通過(guò)10-MDP-鈣鹽保護(hù)暴露的膠原纖維不接觸到MMPs而免于水解，這對(duì)延長(zhǎng)樹(shù)脂-牙本質(zhì)粘接界面的保存時(shí)間有顯著意義。