苦瓜籽多肽K提取工藝優(yōu)化研究

馮誠(chéng)誠(chéng)，蘇健，琚茜茜，黃玉輝，黃熊娟，梁家作，陳小鳳，秦健，劉杏連，黃如葵*

（1.廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，廣西 南寧 530007；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200）

苦瓜（Momordica charantia L.）主要分布在熱帶和溫帶地區(qū)，我國(guó)南北方均有栽培[1]，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功效，是一種藥食同源的蔬菜[2]?？喙虾涂喙献迅缓嚯?、多糖、皂苷、類黃酮等多種生物活性成分[3-7]，具有降血糖、降血脂、抗腫瘤、抗病毒、增強(qiáng)免疫力及預(yù)防肥胖等功效[8-10]。近年來，Ⅱ型糖尿病和營(yíng)養(yǎng)性肥胖成為影響人類身體健康的主要慢性疾病之一[11]。但是改善血糖的藥物普遍具有副作用，探尋天然有效的改善胰島素抵抗藥物仍然是藥物研發(fā)中重要的方向[12-13]?？喙献讯嚯哪苡行Ц纳埔葝u素抵抗?fàn)顟B(tài)，進(jìn)一步減緩Ⅱ型糖尿病的發(fā)病進(jìn)程，其中在類胰島素研究方面降糖多肽P和降糖多肽K備受關(guān)注[14-17]?？喙献讯嚯腒的分子量為18 000 kDa，由18種氨基酸組成，性質(zhì)比較穩(wěn)定。經(jīng)過小鼠和臨床實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，降糖多肽K無需注射，口服就具有較好的降糖效果[18]。但是關(guān)于苦瓜多肽K分離純化的方法，以及對(duì)不同品種苦瓜籽的多肽K含量比較研究尚未見報(bào)道。因此，本研究以苦瓜籽為原料，采用堿提酸沉法結(jié)合單因素試驗(yàn)優(yōu)化多肽K提取工藝條件，并用建立的方法篩選出多肽K含量高的苦瓜品種，為苦瓜降糖功能產(chǎn)品的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

泰國(guó)山苦瓜籽、綠水果苦瓜籽、杜阮大頂苦瓜籽、大肉2號(hào)苦瓜籽、桂農(nóng)科9號(hào)苦瓜籽：廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所提供。5個(gè)苦瓜品種材料均種植于廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所里建科研基地?？喙咸镩g種植常規(guī)管理，2017年3月播種，7月采收結(jié)束。

蛋白裂解液（BC3720）、廣譜蛋白 Marker（5 kDa～245 kDa，PR1930）、蛋白酶抑制劑混合液（P6732）：北京索萊寶科技有限公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳液（P0014B）、蛋白上樣緩沖液（P0015）、廣譜蛋白Marker（10 kDa～150 kDa，P0060M）、BeyoGelTMPlus PAGE預(yù)制膠（P0523S）：碧云天生物技術(shù)有限公司；碳酸鈉（分析純）：天津市北辰方正試劑廠；碳酸氫鈉（分析純）：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）；鹽酸（分析純）、甲醇（分析純）、丙酮（分析純）、氫氧化鈉（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平（BSA224S）：賽多利斯（上海）貿(mào)易有限公司；冷凍干燥機(jī)（Alpha 1-2 Ldplus）：博然科儀有限公司；電泳儀（BIO-RAD）、凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RAD）：伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；冷凍離心機(jī)（5810R）：北京康高特科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 苦瓜籽脫脂處理

將苦瓜籽在研缽中研磨成細(xì)粉，過40目篩，精密稱取1 g，置均質(zhì)器中，加入預(yù)冷（-20℃）的甲醇2 mL（含蛋白酶抑制劑20 μL），在冰上研磨20 min，用甲醇轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，在4℃，14 000 r/min離心5 min，棄去上清液，沉淀用10 mL預(yù)冷甲醇洗2次，再用預(yù)冷的丙酮-水（體積比3∶1，-20℃）溶液10 mL洗3次，在4℃，14 000 r/min離心5 min后，收集沉淀，揮發(fā)去大部分溶劑，再置冷凍干燥機(jī)中凍干，即得到脫脂后的苦瓜籽凍干粉末，稱重，冷藏備用。

1.3.2 苦瓜籽總蛋白提取

精密稱取脫脂后的苦瓜籽凍干粉末0.05 g，加入蛋白裂解液0.5 mL，冰上孵育25 min，期間渦旋振蕩5次，然后在4℃，14 000 r/min離心30 min，收集上清液即為苦瓜籽總蛋白液，冷藏備用。

1.3.3 堿提酸沉法提取苦瓜多肽K

精密稱取脫脂后的苦瓜籽凍干粉末0.5 g，加入10 mL 碳酸鈉緩沖液（0.1 mol/L，pH 9.5），振搖后超聲10min，在50℃水浴上靜置1h，然后在4℃，10000r/min離心10 min，取上清液，用1 mol/L HCl調(diào)整pH值至3.0，靜置 30 min，4 ℃，10 000 r/min 離心 10 min，收集沉淀，加入2 mL碳酸鈉緩沖液（0.1 mol/L，pH 9.0）使其溶解，即獲得堿提酸沉的多肽K溶液。

1.3.3.1 堿液pH值的優(yōu)化

以桂農(nóng)科9號(hào)苦瓜籽為原料，固定料液比為1∶20（g/mL）、提取溫度為50℃，依次調(diào)節(jié)提取堿液的pH 值為 8.0、8.5、9.0、9.5、10.0，浸提 60 min 后，用1 mol/L HCl調(diào)整pH值至3.0，以牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）標(biāo)準(zhǔn)溶液（1mg/mL）作為蛋白質(zhì)定量的對(duì)照，計(jì)算苦瓜多肽K提取率。

1.3.3.2 提取溫度的優(yōu)化

以桂農(nóng)科9號(hào)苦瓜籽為原料，固定提取堿液的pH值為 9.5，料液比為 1 ∶20（g/mL），分別在溫度為 40、45、50、55、60℃條件下浸提60 min，計(jì)算苦瓜多肽K提取率。

1.3.3.3 料液比的優(yōu)化

以桂農(nóng)科9號(hào)苦瓜籽為原料，固定提取溫度為50℃，提取堿液的 pH 值為 9.5，分別以 1∶10、1∶20、1∶30、1 ∶40、1 ∶50（g/mL）為料液比，浸提 60 min，計(jì)算苦瓜多肽K提取率。

1.3.3.4 提取時(shí)間的優(yōu)化

以桂農(nóng)科9號(hào)苦瓜籽為原料，固定料液比為1∶20（g/mL）、提取溫度為50℃，提取堿液的pH值為9.5，在 50 ℃的水浴中分別加熱 30、60、90、120 min，計(jì)算苦瓜多肽K提取率。

1.3.3.5 蛋白酸沉pH值的優(yōu)化

以桂農(nóng)科9號(hào)苦瓜籽為原料，固定料液比為1∶20（g/mL）、提取溫度為50℃，堿液pH值為9.5，在50℃的水浴中分別加熱60 min，用1 mol/L HCl順序調(diào)整pH 值至 7.0、6.0、5.0、4.0和 3.0，靜置 30 min，4 ℃，10 000 r/min離心10 min，收集每個(gè)pH值下的沉淀，計(jì)算苦瓜多肽K提取率。

1.3.4 苦瓜籽蛋白的電泳分析

以十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodiumdodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分離蛋白，分離膠濃度為4%～20%，每個(gè)泳道蛋白質(zhì)上樣量約為50 μg，以廣譜蛋白Marker作為分子量大小的對(duì)照，以牛血清白蛋白（BSA）標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 mg/mL）作為蛋白質(zhì)定量的對(duì)照，在110 V電壓下電泳90 min。電泳后用考馬斯亮藍(lán)G250染色液染色60 min，純水脫色16 h，直至背景清晰，拍照。蛋白質(zhì)電泳的結(jié)果采用分析軟件Image Lab 6.0進(jìn)行分析。

1.3.5 苦瓜籽多肽K提取率計(jì)算

式中：CBSA為標(biāo)準(zhǔn)蛋白上樣濃度，μg/μL；ABSA為標(biāo)準(zhǔn)蛋白電泳分析條帶響應(yīng)值；AK為多肽K電泳分析條帶響應(yīng)值；n為樣品稀釋倍數(shù)；L為樣品上樣量，μL；W為苦瓜籽粉末質(zhì)量，g。

不同品種苦瓜籽多肽K含量計(jì)算方法同上公式。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel和SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以±sD表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 堿液pH值對(duì)苦瓜籽多肽K提取率的影響

堿液pH值對(duì)苦瓜籽多肽K提取率的影響結(jié)果見圖1。

圖1 堿液pH值對(duì)苦瓜籽多肽K提取率的影響Fig.1 Effect of alkaline solution pH on polypeptide-K extraction ratio of bitter gourd seeds

從圖1可以看出，在pH 8.0～9.5的堿性范圍內(nèi)，多肽K提取率隨著pH值的提高呈上升趨勢(shì)，當(dāng)pH值為9.5時(shí)，多肽K的提取率達(dá)到峰值，蛋白質(zhì)溶液達(dá)到飽和狀態(tài)。隨著pH值的繼續(xù)增加，多肽K提取率開始減小，原因可能是pH值大于9.5時(shí)，苦瓜籽蛋白變性嚴(yán)重，導(dǎo)致多肽K的損失增加。因而在此試驗(yàn)條件下，多肽K提取的最適pH值為9.5。

2.2 提取溫度對(duì)苦瓜籽多肽K提取率的影響

提取溫度對(duì)苦瓜籽多肽K提取率的影響結(jié)果見圖2。

圖2 提取溫度對(duì)苦瓜籽多肽K提取率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on polypeptide-K extraction ratio of bitter gourd seeds

由圖2可以看出，溫度對(duì)苦瓜籽多肽K提取率影響較大。當(dāng)提取溫度為40℃時(shí)，由于反應(yīng)體系溫度較低，多肽K提取率也很低。當(dāng)溫度從40℃上升到50℃時(shí)，多肽K提取率隨著溫度的增加逐漸增大，并且在50℃時(shí)提取率達(dá)到最大值，但隨著溫度繼續(xù)增加，其中部分蛋白質(zhì)變性，導(dǎo)致多肽K提取率略有下降。因此，多肽K提取的最適溫度為50℃。

2.3 料液比對(duì)苦瓜籽多肽K提取率的影響

料液比對(duì)苦瓜籽多肽K提取率的影響結(jié)果見圖3。

圖3 料液比對(duì)多肽K提取率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on polypeptide-K extraction ratio of bitter gourd seeds

從圖 3 可以看出，當(dāng)料液比 1∶10（g/mL）～1∶20（g/mL）時(shí)，多肽K提取率隨著溶劑體積的增加而增大，且變化幅度較大。當(dāng)料液比為1∶20（g/mL）時(shí)，多肽K提取率最高。之后隨著溶劑體積繼續(xù)增大多肽K提取率的變化幅度不大?？紤]到加水量增加會(huì)導(dǎo)致多肽K分離時(shí)間大幅加長(zhǎng)，所以選擇料液比為1∶20（g/mL）。

2.4 提取時(shí)間對(duì)苦瓜籽多肽K提取率的影響

提取時(shí)間對(duì)苦瓜籽多肽K提取率的影響結(jié)果見圖4。

圖4 提取時(shí)間對(duì)苦瓜籽多肽K提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on polypeptide-K extraction ratio of bitter gourd

由圖4可知，苦瓜籽多肽K提取率隨提取時(shí)間延長(zhǎng)呈先增大后減小的趨勢(shì)，當(dāng)提取時(shí)間為60 min時(shí)，多肽K提取率達(dá)最大值。當(dāng)提取時(shí)間超過60min，多肽K提取率逐漸降低，但變化幅度不大。因此，在此單因素試驗(yàn)條件下多肽K的最佳提取時(shí)間為60 min。

2.5 蛋白酸沉pH值對(duì)苦瓜籽多肽K提取率的影響

蛋白酸沉pH值對(duì)苦瓜籽多肽K提取率的影響結(jié)果見圖5。

圖5 酸沉pH值對(duì)苦瓜籽多肽K提取率的影響Fig.5 Effect of acid precipitation pH on polypeptide-K extraction ratio of bitter gourd

由圖5可知，通過比較在不同pH值條件下的多肽K提取率，發(fā)現(xiàn)酸沉pH值對(duì)多肽K提取率影響不大，因此本試驗(yàn)選擇將酸沉的pH值直接調(diào)整至3.0。

2.6 不同品種苦瓜籽的多肽K含量

苦瓜籽總蛋白電泳圖見圖6。不同品種苦瓜籽多肽K含量見表1?？喙蠅A提酸沉法提取的蛋白電泳圖見圖7。

圖6 苦瓜籽總蛋白電泳圖Fig.6 The total protein electrophoresis of bitter gourd seeds

表1 不同品種苦瓜籽多肽K含量Table 1 The content of polypeptide-K in different varieties of bitter gourd seeds

圖7 苦瓜籽堿提酸沉法提取的蛋白電泳圖Fig.7 Electrophoresis of protein extracted from bitter gourd seeds by alkali extraction-acid precipitation method

由圖6可以看出，使用蛋白裂解液提取的總蛋白電泳條帶豐富，分子量分布在6 kDa～75 kDa之間，5個(gè)品種的蛋白質(zhì)條帶分布大致相同。其中4個(gè)苦瓜籽品種在18 kDa的位置均有清晰的條帶，而泰國(guó)山苦瓜籽18 kDa位置的條帶不明顯。經(jīng)與BSA標(biāo)準(zhǔn)蛋白比對(duì)和計(jì)算，桂農(nóng)科9號(hào)苦瓜籽的多肽K含量最高，為2.06 mg/g，多肽K含量最低的是泰國(guó)山苦瓜籽，僅為0.20 mg/g，前者為后者的10.30倍（表1）。經(jīng)堿提酸沉工藝優(yōu)化提取后，高分子量的蛋白質(zhì)被除去，電泳圖中高分子蛋白質(zhì)條帶數(shù)量與總蛋白提取法相比明顯減少，主要的條帶分布在35 kDa以下（圖7），說明堿提酸沉法可以用于苦瓜籽多肽K的初步純化。經(jīng)堿提酸沉工藝處理后，其中多肽K提取率最高的是桂農(nóng)科9號(hào)苦瓜籽，其次是綠水果苦瓜籽，泰國(guó)山苦瓜籽的多肽K提取率最低。

3 結(jié)論

本研究以5個(gè)品種的苦瓜籽為研究對(duì)象，通過蛋白裂解法對(duì)苦瓜籽總蛋白中的多肽K含量進(jìn)行比較研究，發(fā)現(xiàn)不同品種的苦瓜籽多肽K含量有顯著差異，篩選出2個(gè)含量相對(duì)較高的品種，分別是桂農(nóng)科9號(hào)苦瓜籽和綠水果苦瓜籽，其中桂農(nóng)科9號(hào)苦瓜籽的多肽K含量最高，為2.06 mg/g。以桂農(nóng)科9號(hào)苦瓜籽為原料，通過料液比、堿液pH值、酸沉pH值、提取溫度、提取時(shí)間5個(gè)因素對(duì)堿提酸沉工藝進(jìn)行優(yōu)化研究，獲得最佳工藝條件為料液比1∶20（g/mL）、堿液pH 9.5、提取時(shí)間60 min、提取溫度50℃，酸沉pH3.0。此工藝條件下，桂農(nóng)科9號(hào)苦瓜籽中多肽K提取率為0.18 mg/g。研究結(jié)果可為苦瓜籽精深加工和降糖多肽K為主要功能成分的產(chǎn)品開發(fā)提供參考。