快速檢測技術(shù)在食品真菌毒素檢測中的研究進展

王蕾，張莉蘊，王玉可，歐亞紅，彭大鵬，王旭，王玉蓮，潘源虎，謝書宇，陳冬梅，黃玲利，陶燕飛

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)國家獸藥殘留基準實驗室（HZAU），湖北 武漢 430070）

真菌毒素是多種真菌的新陳代謝產(chǎn)物，高溫高濕下可在飼料和不同的農(nóng)產(chǎn)品上生長，例如谷物、堅果、香料和咖啡等[1]。其中曲霉屬[產(chǎn)黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）、黃曲霉毒素B2（aflatoxin B2，AFB2）、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2、赭曲霉毒素（ochratoxin，OTA）和棒曲霉素]和鐮刀菌屬[產(chǎn)T-2毒素、嘔吐毒素（vomitoxin，DON）、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）和伏馬毒素B1（fumonisin B1，F(xiàn)B1）]最常見。毒素具有較強抵抗力，飼料中的毒素可隨著食物鏈廣泛分布，最終可在家禽、肉和牛奶等食品中檢測到[2]。其除有致癌和誘變作用外，還可對腎臟、肝臟、造血系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)等產(chǎn)生毒性影響[3]。由于真菌毒素對人類和動物健康的負面影響，在過去的10年～15年中受到了廣泛的關(guān)注。因此很多國家都制定了法規(guī)和標準，對食品和飼料中真菌毒素的最高殘留限量進行了嚴格把控[4]。同時國際癌癥研究機構(gòu)將黃曲霉毒素B1歸為Ⅰ類致癌物[5]，OTA和FB1被分類為ⅡB類致癌物，因此建立一種快速、準確和高通量的方法來檢測食品中毒素污染是非常必要的。

1 真菌毒素快速檢測方法研究現(xiàn)狀

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，檢測手段與方法多種多樣，檢測儀器越來越靈敏，檢測限也越來越低。國標中規(guī)定的毒素檢測主要是高效液相色譜和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的實驗室檢測方法，但要從根本上解決食品安全問題，就必須對食品的生產(chǎn)、加工、流通和銷售等各個環(huán)節(jié)實施全程管理和監(jiān)控，而實驗室檢測方法和儀器是很難及時、快速而全面地從各環(huán)節(jié)監(jiān)控食品安全狀況[6]，這就需要大量能夠滿足這一要求的快速、方便、準確、靈敏的食品安全分析檢測技術(shù)。目前常見的針對食品中真菌毒素的快速檢測方法主要是基于免疫分析技術(shù)，即利用抗原抗體結(jié)合特異性，例如膠體金檢測、酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、生物傳感器等[7]，具有樣品前處理、試驗準備、操作過程簡便，檢測時間短等優(yōu)點。此外納米材料因具有較大的表面體積比，對光、熱、磁和表面穩(wěn)定性等變化有較高靈敏度，常被作為一種與生物分子結(jié)合的分析標記物，可以大大提高生物分子的性能，顯著增強檢測系統(tǒng)的靈敏度和特異性，在檢測分析中發(fā)揮了廣闊的應(yīng)用前景[8]。一些新型生物材料及檢測元件也在不斷被挖掘，比如適配體、分子印跡聚合物（molecularly imprinted polymer，MIP）、模擬肽和獨特型抗體，它們都可作為抗原或抗體的替代物在毒素檢測中發(fā)揮巨大作用，不僅可增加抗體的穩(wěn)定性和特異性，減少毒素之間的交叉反應(yīng)，而且可以避免試驗中的假陽性結(jié)果，實現(xiàn)綠色無污染等目標。

2 常見的快速檢測技術(shù)

2.1 酶聯(lián)免疫法

酶聯(lián)免疫吸附試驗是一種常用的快速檢測毒素的實驗室免疫分析方法，以酶標記抗原或抗體作為示蹤物，通過高活性的酶催化底物顯色或發(fā)光達到定量分析的目的，在實際應(yīng)用中具有簡單、快速、易于操作等優(yōu)點。孫清[9]通過對AFB1進行修飾制得辣根過氧化物酶和牛血清白蛋白偶聯(lián)的黃曲霉毒素B1免疫原，成功研制了用于檢測玉米、豆粕和魚粉的高靈敏度黃曲霉毒素B1檢測試劑盒，檢測限可達7.6 pg/mL，線性范圍在10 pg/mL～810 pg/mL之間。近年來納米材料在ELISA檢測中得到廣泛應(yīng)用，通過制備納米材料標記抗體或抗原使固定化試劑的表面積顯著增加并加速其在反應(yīng)體系中均勻分布，促進了分析系統(tǒng)中各組分的簡單快速分離[10]，再加上本身高化學(xué)和熱穩(wěn)定性，為檢測小分子化合物提供了新思路。其中量子點熒光微球和量子點均已證明是用于生物標記和化學(xué)分析中常見的熒光標記物，可用于檢測毒素[11]。Liang Y等[12]和Zhan S等[13]兩個團隊均鑒于CdTe量子點對H2O2的高敏感性，研制了一種新型的熒光酶聯(lián)免疫吸附測定，可對OTA和ZEN實現(xiàn)低檢測限檢測。此外納米抗體因本身體積小，對溫度、pH值不敏感以及強大的抗原結(jié)合特性，也將成為一種非常有前途的食品質(zhì)量監(jiān)測工具。Liu等[14]開發(fā)了基于納米抗體-堿性磷酸酶融合蛋白的直接競爭ELISA，用于監(jiān)測谷物中的OTA污染。該方法的IC50為0.13 ng/mL，檢測限為0.04 ng/mL，線性范圍為0.06 ng/mL～0.43 ng/mL。表1列出了幾種常見的真菌毒素的ELISA檢測方法。

表1 幾種常見真菌毒素的ELISA檢測方法Table 1 ELISA method to detect several common mycotoxins

2.2 免疫層析法

免疫層析試紙條（immunochromatography test strip，LFIA）是一種快速簡便高效的篩選技術(shù)，它依賴于顆粒結(jié)合標記抗體（或抗原）探針向固定在多孔膜表面的特定抗原（或抗體）的傳遞。LFIA已被用于快速篩選各種食品或飼料商品中的單一或多種真菌毒素，如黃曲霉毒素（aflatoxin，AF）、OTA、黃曲霉毒素M1（aflatoxinM1，AFM1）、DON和ZEN。Sun YN等[21]開發(fā)了一種用于檢測玉米中ZEN的快速免疫試紙條，回收率在91.30%～97.07%范圍內(nèi)，肉眼靈敏度可達20 μg/kg。隨著傳統(tǒng)膠體金免疫層析技術(shù)的不斷應(yīng)用和發(fā)展，靈敏度低、基質(zhì)干擾強和穩(wěn)定性弱等特點逐漸被發(fā)現(xiàn)。因此目前大多都將提高靈敏度、實現(xiàn)多重以及定量檢測作為研究重點，其中新型納米材料的應(yīng)用取得了很好的效果，比如抗體標簽可以選用量子點、發(fā)光納米顆粒或者無定形碳納米顆粒作為熒光標記物用于定量研究[22-23]。趙衛(wèi)東等[24]用量子點熒光微球標記OTA單抗實現(xiàn)了對玉米和大米中的OTA檢測，與Bu T等[25]選用的Yeast@AuNPs和LAB@AuNPs作為標記相比，檢測時間縮短一半，靈敏度提高了近2倍。Chen Y等[26]通過制備并優(yōu)化抗體金納米粒子偶聯(lián)物、金納米粒子的大小和捕獲抗原的位置，建立了一種可同時定量測定玉米、水稻和花生中3種毒素（AFB1、ZEN和OTA）的多重側(cè)流免疫分析法。QingYu等[27]基于銀染側(cè)向免疫法完成了玉米樣品中FB1和DON的雙重檢測，當(dāng)銀離子被金納米粒子催化生成金屬銀沉積在金納米粒子表面時，檢測信號被放大，檢測時間僅為6 min。

2.3 免疫生物傳感器

免疫生物傳感器是一種分析裝置，由一種抗體（即識別元件）和一種轉(zhuǎn)導(dǎo)元件（負責(zé)將反應(yīng)產(chǎn)生的物理變量的變化轉(zhuǎn)換為可測量信號）組成，其中光、電、熱等信號的變化是檢測的重要指標[28]。電化學(xué)檢測器是基于電參數(shù)與被測物質(zhì)濃度之間的關(guān)系進行定量，常見有伏安法，電導(dǎo)法等。光學(xué)檢測器可以基于表面等離子體共振、熒光、光波導(dǎo)模式光譜、拉曼散射等。這些方法不僅檢測速度快，且成本低、高靈敏度和高便攜性，使得生物傳感器得到廣泛應(yīng)用。

2.3.1 電化學(xué)免疫傳感器

電化學(xué)免疫傳感器是電化學(xué)檢測技術(shù)和免疫分析技術(shù)的結(jié)合，其檢測信號來源于電極表面抗原抗體特異性結(jié)合后反應(yīng)體系中的電信號變化，常作為食品和飲料樣品中小分子物質(zhì)的檢測工具。Riberi WI等[29]基于直接免疫測定法成功研發(fā)了用于檢測玉米中ZEN的電化學(xué)免疫傳感器，通過ZEN和辣根過氧化物酶偶聯(lián)玉米赤霉烯酮競爭氧化過氧化氫測得響應(yīng)電流與樣品中ZEN的濃度關(guān)系，檢測限為1.5×10-4ng/mL。Karczmarczyk A等[30]同樣采用了一種競爭性檢測形式的傳感器用于檢測紅酒和牛奶樣品中真菌毒素，將牛血清白蛋白偶聯(lián)赭曲霉毒素和牛血清白蛋白偶聯(lián)黃曲霉毒素M1共軛物共價附著在金電極表面3-巰基丙酸自組裝單層上，然后注入一抗和含有游離抗原樣品的復(fù)合物，通過用堿性磷酸酶標記二抗完成檢測，該傳感器線性范圍寬并且檢測限比歐盟委員會要求的最大殘留水平仍低兩個數(shù)量級。Dan Wang等[31]首次開發(fā)了一種基于石墨烯-聚吡咯-吡咯丙酸復(fù)合膜的新型阻抗型免疫傳感器，其中石墨烯大大提高了薄膜的導(dǎo)電性和穩(wěn)定性，吡咯丙酸為探針固定提供了共價鍵合物，聚吡咯通過其固有的電化學(xué)摻雜/脫摻雜特性賦予了薄膜的電活性，從而顯著提高了在10 fg/mL至10 pg/mL范圍內(nèi)對AFB1的靈敏性，具有較高的特異性和良好的重復(fù)率，可為新型傳感器地開發(fā)提供參考。

2.3.2 光學(xué)免疫傳感器

幾乎所有的光學(xué)現(xiàn)象都能用作生物傳感設(shè)計，相比于傳統(tǒng)的免疫測定方法而言，光學(xué)免疫傳感器被認為是臨床檢測的一種有利分析。其中表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR）得到了廣泛應(yīng)用，Wei T等[32]利用間接競爭性免疫方法構(gòu)建了一種基于自組裝單層特殊而靈敏的SPR傳感器芯片，可用來同時檢測玉米和小麥中AFB1、OTA、ZEN和DON 4種毒素，通過將抗原修飾在活化芯片表面的N-羥基琥珀酸酯羧基上進行標記，然后用乙醇胺溶液封閉活化羧基即可進行檢測。Joshi S等[33]和Karczmarczyk A等[34]均使用金屬納米顆粒標記的二抗開發(fā)出一種間接競爭性SPR生物傳感免疫測定法，即實現(xiàn)了傳感器放大效應(yīng)，又完成了毒素的多重檢測。在此基礎(chǔ)上，Li Y等[35]研制出了可同時檢測食品中3種主要毒素（AFB1、ZEN、OTA）的微陣列表面增強拉曼散射（surface enhanced raman scattering，SERS）免疫傳感器，是一種結(jié)合了SERS標記技術(shù)和抗原抗體相互作用的新型免疫傳感平臺，3個免疫反應(yīng)獨立存在互不干擾，優(yōu)化后回收率在83.8%～108.1%之間。此外Nabok A等[36]又開發(fā)了基于平面光波導(dǎo)偏振干涉技術(shù)的新型生物傳感器來檢測AFB1，表明通過特異性抗體直接免疫檢測AFB1的初步生物傳感試驗成功。

2.4 生物芯片

生物芯片是一種生物微陣列裝置，被廣泛用于研究大量蛋白質(zhì)和生物功能基因組的分析，芯片上的結(jié)合位點可固定抗原或抗體用于樣品分析。由于其低消耗、高通量和微型化的特點，該技術(shù)在毒素的檢測方面具有很大優(yōu)勢。Chen Y等[37]開發(fā)了一種自動微流控芯片，使用原型非便攜式熒光檢測平臺在30 min內(nèi)即可完成T-2毒素和AFB1的檢測。Uludag Y等[38]制作了一種電化學(xué)可讀微芯片，通過自組裝單分子層結(jié)合在電極上的蛋白A促進抗毒素抗體的定向固定來檢測AFB1。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)ELISA和免疫層析法是近年來有效的真菌毒素快速檢測方法，雖然可以達到快速簡便的效果，但易出現(xiàn)假樣性結(jié)果，而且免疫層析法在實現(xiàn)多重檢測和低檢測限方面仍需進一步加強。免疫傳感器作為一種新興的生物分析技術(shù)，以其鑒定物質(zhì)的高度特異性、敏感性和穩(wěn)定性受到關(guān)注，它將傳統(tǒng)的免疫測試和生物傳感技術(shù)融為一體，集兩者的諸多優(yōu)點于一身，不僅減少了分析時間，提高了靈敏度，也使得測定過程變得簡單，易于實現(xiàn)自動化，有著廣闊的應(yīng)用前景。生物芯片由于采用了微電子學(xué)的并行處理和高密度集成的概念，因此具有高效、高信息量等突出優(yōu)點。

3 新型生物材料及檢測元件在真菌毒素快速檢測中的應(yīng)用

隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，一些新型生物材料和檢測元件被不斷發(fā)現(xiàn)并得到應(yīng)用，例如模擬肽、適配體、獨特型抗體和MIPs等[39]，不僅可以提高受體的化學(xué)和物理穩(wěn)定性并降低其生產(chǎn)成本，在理論上也可以以足夠的選擇性和結(jié)合強度針對任何目標進行合成，并實現(xiàn)綠色無污染，有望用于臨床開發(fā)。

3.1 適配體

適配體是一種合成的寡核苷酸鏈，包含10個～50個可變堿基[40]，可以折疊成特定的三維結(jié)構(gòu)與配體互補并結(jié)合[41]。與抗體相比，適配體易合成、可被多種化學(xué)基團修飾、穩(wěn)定性好、成本效益高[42-43]。其可在反復(fù)的變性循環(huán)中維持其結(jié)構(gòu)，并對廣泛的靶標（如毒素、藥物、多肽、蛋白質(zhì)等分子）表現(xiàn)出高度親和性和特異性。因此，在許多生物應(yīng)用中，適配體被認為是比抗體更好的選擇。研究發(fā)現(xiàn)適配體常與納米材料（石墨烯、金屬納米顆粒和金屬氧化物納米顆粒等）偶聯(lián)用于快速分析[44]。Zhao Y等[45]將生物素修飾的核酸適體固定在金表面的中性親和素層上構(gòu)建了電化學(xué)傳感器，并在加標牛奶樣品中驗證了該傳感器的有效性，LOD為8.62 ng/L，回收率高達78%，低于乳和乳制品中AFM1的允許限值。Bratakou S等[46]構(gòu)建了以核酸外切酶III的信號放大和金納米粒子的熒光猝滅為基礎(chǔ)的OTA檢測平臺。通過對加標紅酒的檢測，驗證了該檢測方法的可行性和適配體的適用性。

3.2 分子印跡聚合物

分子印跡聚合物是一種對特定靶分子具有高親和力的合成材料。功能單體圍繞模板分子自組裝后，在過量的交聯(lián)劑存在下聚合形成固體材料，去除模板就會產(chǎn)生形狀和功能都與原始模板互補的空洞。直到本世紀初在基于MIP的毒素分析上才發(fā)現(xiàn)成功案例。Yu等[27]首次將氯離子與聚吡咯聚合在金表面，進而制備出檢測OTA的表面等離子體共振裝置。Pavel P等[47]選用印跡蛋白作為競爭性ELISA中的識別元件檢測小麥中ZEN殘留量，并討論了使用不同的蛋白質(zhì)生成針對檢測的影響，結(jié)果顯示靈敏度與市售ELISA試劑盒的靈敏度相當(dāng)。Burmistrova NA等[48]首次應(yīng)用具有大量單個微毛細管的軟玻璃管作為生物印跡載體，使用透射光譜中光譜帶的移動來進行表面改性的監(jiān)測，進而對谷物中ZEN進行定量。近年也來有研究表明，F(xiàn)e3+的引入可提高其它金屬離子與模板的螯合作用，使檢測結(jié)果更加穩(wěn)定[49]。

3.3 模擬肽

真菌毒素是一種有毒的天然毒素，使用時為保證毒素與蛋白質(zhì)分子結(jié)合特異性和穩(wěn)定性通常選用純毒素，這就很大可能會對生產(chǎn)廠家、使用者和環(huán)境造成毒性風(fēng)險。從安全的角度來看，使用無毒化學(xué)試劑代替有毒化合物用于免疫分析有利于提高實驗室和環(huán)境的安全性，也可避免毒素偶聯(lián)物釋放的部分分析物對傳感器發(fā)出假信號。模擬肽作為一種毒素替代物，是從噬菌體隨機展示的肽庫中選出的對毒素具有良好親和力的氨基酸多肽序列。研究人員已經(jīng)合成了各種毒素的模擬肽，比如OTA、ZEN、DON，并已用于快速準確檢測[50-52]。隨著噬菌體展示肽庫的進一步發(fā)展，系統(tǒng)地體現(xiàn)了易于獲得和低成本的優(yōu)點，將噬菌體展示技術(shù)應(yīng)用于電化學(xué)免疫傳感器可以放大檢測信號，增強靈敏度，并實現(xiàn)綠色無毒檢測[53]。Yan J等[54]以DON為模型，將與抗DON抗體特異性結(jié)合選定的DON模擬表位用作電化學(xué)免疫傳感器中模擬競爭性抗原進行檢測。優(yōu)化后傳感器動態(tài)范圍可達0.1pg/mL～10 000pg/mL，回收率在90.4%～118%之間。電化學(xué)免疫傳感器放大信號的特性與噬菌體展示肽庫的優(yōu)勢相結(jié)合，為提高檢測靈敏度提供了新思路。

3.4 獨特型抗體

抗體V區(qū)的抗原決定簇具有抗原活性，被細胞識別后可產(chǎn)生特異性抗體，稱為抗獨特型抗體。隨著研究地深入，抗獨特型抗體可用于腫瘤疫苗研制和免疫檢測中?？躬毺匦涂贵w可取代真菌毒素及其結(jié)合物，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)[55]。小且熱穩(wěn)定好以及具有高表達水平的納米抗體是生產(chǎn)抗獨特型抗體的首選。Shu M等[56]以抗FB1單抗為靶點，從納米抗體噬菌體展示庫中篩選FB1替代品，選用ELISA對分離出的抗獨特型抗體進行谷物和飼料中FB1的檢測。結(jié)果顯示檢測限可達0.15 ng/mL，與化學(xué)合成的牛血清白蛋白偶聯(lián)伏馬毒素B1相比靈敏度提高了約20倍，并且對伏馬毒素B2的交叉反應(yīng)性低。Schulz K等[57]通過毒素特異性抗體與抗獨特型抗體相結(jié)合的間接競爭免疫測定法開發(fā)了一種電化學(xué)生物芯片，可用于快速檢測T-2毒素和AFM1及其相應(yīng)同源物。因此利用生物技術(shù)開發(fā)替代物可作為替代傳統(tǒng)合成抗原的理想策略。

4 結(jié)論與展望

本文著重介紹了幾種常見的免疫分析法在真菌毒素快速檢測中的應(yīng)用，其中納米材料以特殊的化學(xué)和物理性質(zhì)廣泛用于ELISA、免疫層析和生物傳感器檢測中，在協(xié)同組合的納米材料或納米復(fù)合材料參與下可實現(xiàn)更低的檢出限和較寬的線性分析范圍；此外，對一些新型生物材料及檢測元件在快速檢測中的發(fā)展進行了介紹，它們既避免了抗體制備周期長成本高等弊端，也使檢測技術(shù)向更加綠色安全、更靈敏的方向發(fā)展。可以看出研究人員已將注意力轉(zhuǎn)移到利用技術(shù)進步來構(gòu)建真菌毒素檢測工具，其中可以向這幾個方向發(fā)展：一是開發(fā)諸如適配體、MIP等合成受體來代替昂貴且不穩(wěn)定單克隆抗體用于檢測分析；二是將納米顆粒作為標記分子對新型生物材料或檢測元件進行標記，用于各種快速檢測技術(shù)的檢測；三是基于納米材料的光學(xué)和電化學(xué)傳感平臺可認為是食品制造業(yè)中用于真菌毒素自動現(xiàn)場分析的可靠工具。這些技術(shù)都有望為研制一種快速、可靠、便攜式現(xiàn)場分析設(shè)備提供重要幫助，進而滿足各國對食品安全的監(jiān)督。