白芍多糖純化及其抗運(yùn)動(dòng)性疲勞活性研究*

李 然

（西安航空學(xué)院 體育部，陜西 西安 710077）

白芍為毛茛科芍藥屬植物芍藥的去皮干燥根，富含多糖、皂苷、蛋白質(zhì)、β-谷甾醇等化學(xué)成分，具有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)，斂陰止汗的功效，可用于抗炎、抗病毒、抗驚厥、鎮(zhèn)痛與護(hù)肝[1,2]。目前，有關(guān)白芍的研究，僅限于對(duì)其活性成分的提取及藥理作用的探討，如：秦亞?wèn)|等采用“水提醇沉”工藝制得白芍多糖，并發(fā)現(xiàn)其對(duì)羥基自由基、DPPH 自由基等活性氧自由基的清除作用較好[3,4]。由于“運(yùn)動(dòng)性疲勞”主要?dú)w因于機(jī)體劇烈運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的大量活性氧自由基，破壞體內(nèi)抗氧化與氧化系統(tǒng)的平衡，造成組織損傷和肌肉收縮能力的下降[5,6]，而對(duì)機(jī)體補(bǔ)充外源性抗氧化劑是延緩運(yùn)動(dòng)性疲勞產(chǎn)生的有效方法之一。近年來(lái)，部分體外抗氧化活性較好物質(zhì)，被發(fā)現(xiàn)其對(duì)體內(nèi)抗疲勞亦有較好作用[7,8]。由于白芍多糖提取物中仍有較多蛋白、色素等雜質(zhì)，可能影響其活性作用。為此，本研究利用大孔樹(shù)脂純化白芍多糖提取物，探討不同工藝條件對(duì)提取物純化效果的影響，同時(shí)通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，觀察其抗運(yùn)動(dòng)性疲勞活性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

白芍（老百姓大藥房，經(jīng)鑒定為毛茛科芍藥屬植物芍藥的根）；D-無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)食品藥品檢定研究院）；甲醇、無(wú)水乙醇、濃H2SO4、苯酚為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乳酸（LD）、尿素氮（BUN）試劑盒為江蘇科特生物科技有限公司生產(chǎn)；實(shí)驗(yàn)用水為超純水；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF 級(jí)健康雄性小鼠 100 只，體質(zhì)量 15～22g。

AB-8、H 103、D 101 型大孔樹(shù)脂（天津歐瑞生物科技有限公司）；HPD 400 型大孔樹(shù)脂（天津浩聚科技有限公司）；HPD 600 型大孔樹(shù)脂（北京索萊寶科技有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

XL-06A 粉碎機(jī)（上海燁昌食品機(jī)械有限公司）；752N 型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海儀電科技有限公司）；FA124 型電子天平（上海恒平科學(xué)儀器有限公司）；RE-52AA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；TG16G 型臺(tái)式高速離心機(jī)（常州億能實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；110X50 型水浴恒溫振蕩器（濟(jì)南來(lái)寶醫(yī)療器械有限公司）。

1.3 多糖提取物制備

白芍的干燥根經(jīng)粉碎后，稱取適量，經(jīng)無(wú)水乙醇浸泡過(guò)夜后，在1∶10 固液比下，于80℃熱水浸提2 次，合并提取溶劑，水浴濃縮至原體積三分之一后，在1∶3 固液比下，加入無(wú)水乙醇，4℃靜置12h 后離心，收集沉淀，真空干燥，即得白芍多糖粗提物[4]。

1.4 多糖含量測(cè)定

精密稱取干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，加入5%苯酚溶液和濃H2SO4處理后，于490nm 測(cè)定不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度[9]，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=2.391x+0.011（r=0.9994），表明葡萄糖在0.02～0.2mg·mL-1濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，另于相同波長(zhǎng)，測(cè)定實(shí)際樣品的吸光度，平行測(cè)定3 次，計(jì)算樣品中多糖純度。

1.5 樹(shù)脂靜態(tài)吸附-解吸性能比較

經(jīng)預(yù)處理后的5.0g 不同型號(hào)樹(shù)脂置于錐形瓶?jī)?nèi)，分別加入50mL 3mg·mL-1多糖提取液，于室溫振蕩至飽和吸附后過(guò)濾，測(cè)得飽和吸附后溶液中多糖濃度。隨后，將飽和吸附的大孔樹(shù)脂采用純水沖洗至無(wú)色后，置于錐形瓶?jī)?nèi)，另加入100mL，體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液，于相同條件振蕩解吸至平衡，測(cè)得乙醇溶液中多糖濃度，計(jì)算不同類型大孔樹(shù)脂的吸附率、解吸率及回收率[10]。

1.6 樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附-解吸條件考察

1.6.1 吸附條件考察 固定樣品溶液體積50mL，以吸附率為衡量指標(biāo)，分別考察樣品濃度、上樣液pH值及上樣流速對(duì)D101 樹(shù)脂吸附白芍多糖的影響，具體如下：當(dāng)上樣液pH 值為5，上樣流速為2mL·min-1，樣品濃度分別為：1、2、3、4、5mg·mL-1；當(dāng)樣品濃度為3mg·mL-1，上樣流速為 2mL·min-1，上樣液 pH 值分別為：3、4、5、6、7；當(dāng)樣品濃度為 3mg·mL-1，上樣液pH 值為 5，上樣流速分別為 1、2、3、4、5mL·min-1。

1.6.2 解吸條件考察 以不同濃度乙醇作洗脫液，解吸率為衡量指標(biāo)，分別考察洗脫液濃度、體積和洗脫流速對(duì)解吸率的影響，具體如下：當(dāng)洗脫流速為1mL·min-1，洗脫液體積為 120mL 時(shí)，洗脫液濃度分別為：50%、60%、70%、80%、90%；當(dāng)洗脫液濃度為70%，洗脫液體積為120mL 時(shí)，洗脫流速分別為0.5、1、2、3、4mL·min-1；當(dāng)洗脫液濃度為 70%，洗脫流速為1mL·min-1時(shí)，洗脫液體積分別為100、110、120、130、140mL。

1.7 抗疲勞活性研究

1.7.1 動(dòng)物分組與劑量設(shè)計(jì) 80 只健康雄性小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7d 后（飼養(yǎng)環(huán)境溫度：20～25℃，相對(duì)濕度：50～70%），按體質(zhì)量隨機(jī)分為4 組，即空白對(duì)照組和純化產(chǎn)物的低、中、高劑量組，每組各20 只，根據(jù)《保健食品功能評(píng)價(jià)》要求，設(shè)計(jì)人體推薦攝入劑量的 10、20、30 倍，作為低、中、高劑量組動(dòng)物每日純化產(chǎn)物的攝入量，即 0.10、0.20、0.30mg·（g·d）-1，空白對(duì)照組則給予等量生理鹽水，全部動(dòng)物每天灌胃1 次，連續(xù)灌胃30d，灌胃期間各組小鼠可自由喂食與飲水[11]。

1.7.2 力竭游泳時(shí)間 末次灌胃結(jié)束后，各組隨機(jī)選取10 只小鼠，于鼠尾負(fù)重5%體重重物，置于游泳池內(nèi)，溫度為（25±2）℃，記錄其自入水游泳至沉沒(méi)超過(guò) 10s 的時(shí)間[12]。

1.7.3 生化指標(biāo)檢測(cè) 末次灌胃結(jié)束后，各組剩余動(dòng)物游泳30min，取出擦凈，休息15min 后，摘眼球取血后離心，制備血清，照相關(guān)試劑盒使用說(shuō)明，檢測(cè)各組小鼠血清中LD 和BUN 的含量[13]。

1.8 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差描述，利用SPSS 19.0 進(jìn)行單因素方差分析，不同組間的比較采用方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，當(dāng)P<0.05 判斷為差異顯著，P<0.01 判斷為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 樹(shù)脂靜態(tài)吸附-解吸性能比較

大孔樹(shù)脂的吸附與解吸性能與樹(shù)脂的極性、比表面積有關(guān)，不同類型樹(shù)脂的靜態(tài)吸附與解吸性能，見(jiàn)表1。

表1 不同樹(shù)脂的靜態(tài)吸附與解吸性能Tab.1 Static adsorption and desorption performance of different resins

從表1 可見(jiàn)，各類樹(shù)脂對(duì)白芍多糖的吸附與解吸效果呈明顯差別，其中D 101 樹(shù)脂對(duì)提取液中多糖的回收率達(dá)到79.1%，其次為H 103，這歸因于多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)中存在較多羥基，具有一定的極性，但H 103 樹(shù)脂的比表面積≥900m2·g-1，吸附作用最強(qiáng)，而 D 101 樹(shù)脂的比表面積為 500～600m2·g-1，易于脫附，因而確定采用D 101 樹(shù)脂作為純化白芍多糖提取物的大孔樹(shù)脂。

2.2 樹(shù)脂吸附條件優(yōu)化

2.2.1 樣品濃度選擇 不同樣品濃度對(duì)樹(shù)脂的吸附率影響，見(jiàn)圖1。

圖1 樣品濃度的選擇Fig.1 Selection of concentration of sample solution

由圖1 可見(jiàn)，隨著樣品濃度的增大，吸附率先升高后降低，這歸因于提取物濃度過(guò)大，使得樣品中雜質(zhì)增多，競(jìng)爭(zhēng)吸附于樹(shù)脂內(nèi)，導(dǎo)致待分離物的過(guò)早泄漏，因此，確定樣品中提取物濃度為3mg·mL-1。

2.2.2 上樣流速選擇 不同上樣流速對(duì)樹(shù)脂的吸附率影響，見(jiàn)圖2。

圖2 上樣流速的選擇Fig.2 Selection of loading flow rate of sample solution

由圖2 可見(jiàn)，隨著上樣流速的增大，吸附率逐漸下降，這源于流速過(guò)快，樣品溶液未與樹(shù)脂充分接觸，致使吸附量降低，但流速過(guò)慢，可能影響吸附效率。為此，綜合考慮選擇上樣流速為2mL·min-1。

2.2.3 上樣液pH 值選擇 不同上樣液pH 值對(duì)樹(shù)脂的吸附率影響，見(jiàn)圖3。

圖3 上樣液pH 值的選擇Fig.3 Selection of sample solution pH

由圖3 可見(jiàn)，伴隨上樣液pH 值的增大，吸附率先升高后降低，這可能源于多糖在酸、堿條件下均易發(fā)生水解反應(yīng)，影響其溶解度與化學(xué)性質(zhì)[14]，而在弱酸性條件下，多糖更易于被樹(shù)脂吸附，因此確定上樣液pH 值為5。

2.3 樹(shù)脂解吸條件優(yōu)化

2.3.1 洗脫液濃度選擇 圖4 為不同洗脫液濃度對(duì)多糖解吸率的影響。

由圖4 可見(jiàn)，當(dāng)乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)增大至70%時(shí)，解吸率開(kāi)始降低，若乙醇濃度過(guò)高，易將吸附在樹(shù)脂的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)洗脫，而乙醇濃度過(guò)低，則與多糖的極性相差較大，因此，選擇洗脫液乙醇的濃度為70%。

圖4 洗脫液濃度的選擇Fig.4 Selection of eluent concentration

2.3.2 洗脫流速選擇 圖5 為不同洗脫流速對(duì)多糖解吸率的影響。

圖5 洗脫流速的選擇Fig.5 Selection of different flow rate of elution

由圖5 可見(jiàn)，隨著洗脫液洗脫流速的增大，多糖的解吸率不斷降低，這歸因于洗脫流速過(guò)快，同樣會(huì)使洗脫劑與樹(shù)脂接觸不充分，導(dǎo)致其解吸多糖效果較差，綜合解吸效率，選擇洗脫流速為1mL·min-1。

2.3.3 洗脫液體積選擇 洗脫液體積對(duì)多糖解吸率的影響，見(jiàn)圖6。

圖6 洗脫液體積的選擇Fig.6 Selection of eluent volume

由圖6 可見(jiàn)，隨著洗脫液體積增大至120mL時(shí)，解吸率逐漸上升至趨于平衡，表明吸附在樹(shù)脂的多糖基本被解吸完全，因此選擇洗脫液體積為120mL。

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

采取上述最佳條件純化白芍提取物中多糖，即配制濃度為 3mg·mL-1，pH 值為 5 的樣品溶液 50mL，以2mL·min-1流速上樣至D 101 樹(shù)脂中吸附后，采用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液120mL，以1mL·min-1流速洗脫，產(chǎn)物的多糖含量由純化前85.57 提高至純化后 224.2mg·g-1，約為 2.6 倍。

2.5 純化產(chǎn)物對(duì)動(dòng)物力竭游泳時(shí)間影響

動(dòng)物力竭游泳實(shí)驗(yàn)可客觀反映白芍多糖的抗運(yùn)動(dòng)性疲勞效果，見(jiàn)表2。

表2 白芍多糖對(duì)力竭游泳時(shí)間的影響Tab.2 Effect of polysaccharide of Radix Paeoniae Alba on exhaustive swimming time

由表2 可知，與空白對(duì)照組相比，中、高劑量的純化產(chǎn)物均可顯著延長(zhǎng)動(dòng)物的力竭游泳時(shí)間，中劑量組與其差異顯著（P<0.05），而高劑量組與其差異極顯著（P<0.01），表明中、高劑量的白芍多糖純化產(chǎn)物有助于提高機(jī)體的運(yùn)動(dòng)耐力，延長(zhǎng)運(yùn)動(dòng)時(shí)間。

2.6 純化產(chǎn)物對(duì)動(dòng)物體內(nèi)乳酸濃度影響

高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)時(shí)體內(nèi)供氧不足，部分血糖易轉(zhuǎn)化成乳酸，使得四肢肌肉酸痛，出現(xiàn)疲勞感，因此，分別考察運(yùn)動(dòng)后不同組別動(dòng)物體內(nèi)的LD 濃度，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 白芍多糖對(duì)LD 濃度的影響Tab.3 Effect of polysaccharide of Radix Paeoniae Alba on LD concentration

由表3 可知，與空白對(duì)照組相比，中、高劑量組動(dòng)物的體內(nèi)LD 濃度均明顯低于空白對(duì)照組（P<0.05, P<0.01），表明中、高劑量的純化產(chǎn)物可明顯減少體內(nèi)乳酸的累積，延緩運(yùn)動(dòng)疲勞產(chǎn)生。

2.7 純化產(chǎn)物對(duì)動(dòng)物體內(nèi)尿素氮濃度影響

當(dāng)機(jī)體劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)，血糖供應(yīng)不足，體內(nèi)蛋白質(zhì)和氨基酸分解代謝加快，以維持運(yùn)動(dòng)，致使代謝產(chǎn)物尿素氮濃度增大[25]，運(yùn)動(dòng)后不同組別動(dòng)物體內(nèi)的尿素氮濃度，見(jiàn)表4。

表4 白芍多糖對(duì)BUN 濃度的影響Tab.4 Effect of polysaccharide of Radix Paeoniae Alba on BUN concentration

由表4 可知，與空白對(duì)照組相比，中、高劑量組動(dòng)物體內(nèi)的BUN 濃度均明顯低于空白對(duì)照組（P<0.05, P<0.01），表明中、高劑量的白芍多糖可顯著減少運(yùn)動(dòng)時(shí)體內(nèi)蛋白質(zhì)的分解利用。

3 結(jié)論

本研究探討了大孔樹(shù)脂純化白芍多糖的最佳工藝條件并考察其抗運(yùn)動(dòng)性疲勞活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，配制濃度為 3mg·mL-1，pH 值為 5 的樣品溶液 50mL，以2mL·min-1流速上樣至D 101 樹(shù)脂中吸附后，采用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液120mL，以1mL·min-1 流速洗脫，產(chǎn)物的多糖含量由純化前85.57 提高至純化后224.2mg·g-1，約為2.6 倍。中、高劑量的白芍多糖純化產(chǎn)物有助于避免運(yùn)動(dòng)時(shí)體內(nèi)的乳酸累積，降低蛋白質(zhì)的分解利用，因此，可為相關(guān)運(yùn)動(dòng)食品的開(kāi)發(fā)提供參考。