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    BSA 熒光探針對(duì)醋氯芬酸含量的測定及相互作用的研究*

    2021-02-26 01:29:06王艷妮馬紅燕王文山
    化學(xué)工程師 2021年1期
    關(guān)鍵詞:殘基常數(shù)波長

    王艷妮,馬紅燕,王文山

    (延安大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院 陜西省反應(yīng)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西 延安 716000)

    醋氯芬酸(Aceclofenac,ACF)是目前常用的口服非甾體抗炎藥(NSAID)之一,具有顯著的抗炎、鎮(zhèn)痛作用,在治療術(shù)后疼痛,類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和骨關(guān)節(jié)炎方面有明顯的療效[1],與其他非甾體抗炎藥物相比,ACF 具有抗炎作用好、胃腸道不良反應(yīng)發(fā)生率低等優(yōu)點(diǎn)。為了保證ACF 在臨床上的安全性和有效性,避免長期服用導(dǎo)致含量過高而引起副反應(yīng),因此,建立一種快速、簡單的測定方法很重要。

    目前,國內(nèi)對(duì)ACF 含量的測定主要采用高效液相色譜法,隨著技術(shù)的成熟,電化學(xué)方法[2]、氣相色譜法[3]、紫外分光光度法[4,5]也相繼出現(xiàn),但熒光法測定卻鮮少報(bào)道。牛血清白蛋白(BSA)是動(dòng)物血漿中含量最豐富的功能蛋白,與人血清白蛋白(HSA)有高度的相似性和同源性,因此,常被用來研究藥物分子和血清蛋白的相互作用[6]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ACF 對(duì)BSA的內(nèi)源性熒光有線性猝滅作用,基于此,建立了測定ACF 的新方法。進(jìn)一步探討了二者的作用機(jī)理,為后續(xù)研究ACF 在人體的運(yùn)輸過程提供了數(shù)據(jù)參考。

    1 實(shí)驗(yàn)部分

    1.1 儀器與試劑

    日本日立F-4500 熒光光度計(jì);美國安捷倫8453紫外-可見分光光度計(jì)。

    3.35×10-3g·mL-1BSA 標(biāo)準(zhǔn)溶液 準(zhǔn)確稱取1.6750g 牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品,超純水溶解定容至500mL 容量瓶;

    3.5×10-4g·mL-1ACF 標(biāo)準(zhǔn)溶液 準(zhǔn)確稱取0.0350g 醋氯芬酸標(biāo)準(zhǔn)品,用熱的超純水溶解后定容至100mL 容量瓶,使用時(shí)稀釋至所需濃度;

    3.0×10-3mol·L-1HCl 溶液。

    所用試劑均為分析純,配置好后于冰箱4℃保存,水為UP 超純水(實(shí)驗(yàn)室自制)。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    25℃下,于5 支25mL 比色管中分別加入4.00mL的HCl 溶液和1.00mL 的BSA 標(biāo)準(zhǔn)液,一份做試劑空白,其余比色管加入不同濃度梯度的ACF 溶液,每次增加濃度為2.8×10-7g·mL-1。充分搖勻后,室溫下靜置15min 進(jìn)行測定。采用1cm 石英比色皿,激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫均為5.0nm,以283.0nm 為最佳激發(fā)波長,掃描300~450nm 范圍內(nèi)的熒光發(fā)射光譜圖。以ACF 的濃度為0g·mL-1作為參照組,熒光強(qiáng)度記為F0,并計(jì)算ΔF。293K、310K 下測定與上述方法一致。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 ACF 的測定

    2.1.1 熒光光譜圖

    由圖 1、2 可知,在 3.0×10-3mol·L-1的 HCl 溶液中,BSA 的最佳發(fā)射波長為338.0nm,較中性條件下藍(lán)移了6nm。而ACF 的加入使得BSA 338.0nm 處的熒光峰明顯降低,且隨著ACF 濃度的不斷增加,BSA 的熒光強(qiáng)度逐漸降低,說明ACF 和BSA 發(fā)生了結(jié)合反應(yīng)從而誘導(dǎo)其內(nèi)源性熒光猝滅。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ACF 在一定濃度范圍內(nèi)與體系的ΔF 值呈良好的線性關(guān)系,因此,可用于ACF 含量的測定。

    圖1 激發(fā)光譜Fig.1 Excitation spectrum

    圖2 發(fā)射光譜Fig.2 Emission spectrum注:1-5cACF=0,1.4×10-7,4.2×10-7,7.0×10-7,9.8×10-7g·mL-1;cBSA=1.34×10-4g·mL-1

    2.1.2 緩沖體系pH 值、種類及用量的選擇

    固定BSA 和ACF 的測試濃度,研究了不同程度的緩沖液對(duì)BSA-ACF 體系的影響,結(jié)果見圖3。

    圖3 pH 值對(duì)體系的影響Fig.3 Influence of pH on system

    由圖 3 表明,pH 值在 3.30 左右體系的 ΔF 值最大。于此考察了同一pH 值下鄰苯二甲酸-HCl、檸檬酸-Na2HPO4、檸檬酸鈉-檸檬酸、B-R 等緩沖介質(zhì)及3.0×10-3mol·L-1HCl 對(duì) ΔF 的影響,結(jié)果表明在 3.0×10-3mol·L-1HCl 溶液中體系的 ΔF 值最大,且最佳用量為4.00mL。

    2.1.3 BSA 用量的選擇

    實(shí)驗(yàn)研究了不同用量的BSA 對(duì)體系ΔF 值的影響,結(jié)果見圖4。

    圖4 BSA 用量對(duì)ΔF 的影響Fig.4 Effect of BSA on ΔF

    由圖 4 結(jié)果表明,當(dāng) BSA 用量在 0.5~2.0mL 時(shí)體系的ΔF 值最大且基本不變,但兼顧靈敏度和線性范圍考慮,本實(shí)驗(yàn)選擇加入BSA 溶液1.00mL,最終測試濃度為 1.34×10-4g·mL-1。

    2.1.4 增敏劑的選擇 為了提高檢測靈敏度,試驗(yàn)了一系列的金屬離子和表面活性劑對(duì)ACF 的協(xié)同作用,例如 Cu2+,Ba2+,Ca2+,Mg2+,Mn2+,Zn2+、CTMAB、Tween-80、DTAB、β-CD、SDBS 等對(duì)體系的影響,結(jié)果表明,上述離子和表面活性劑均對(duì)BSA-ACF 體系的ΔF 值無明顯增敏作用,因此,本實(shí)驗(yàn)不加入任何增敏劑。

    2.1.5 穩(wěn)定性的測定 按照實(shí)驗(yàn)步驟配置好溶液、充分搖勻,每5min 測定一次熒光強(qiáng)度。結(jié)果表明靜置15min 后反應(yīng)完全并且ΔF 值達(dá)到最大,且體系在10h 內(nèi)無明顯波動(dòng)情況,說明該體系比較穩(wěn)定。

    2.1.6 共存物質(zhì)干擾 以相對(duì)誤差不高于±5%為限,研究了實(shí)驗(yàn)過程中和實(shí)際樣品中可能存在物質(zhì)的干擾情況。當(dāng) ACF 濃度為 4.2×10-7g·mL-1時(shí),1000倍的 K+、Al3+、Ca2+、Zn2+、葡萄糖、果糖、蔗糖,500 倍的Cu2+、Mn2+,250 倍的 Mg2+,5 倍的 Fe3+不產(chǎn)生干擾。

    2.1.7 精密度、檢出限及線性范圍的確定 在優(yōu)化的條件下,ACF 溶液濃度在 1.4×10-8~0.99×10-6g·mL-1范圍內(nèi)與體系的熒光強(qiáng)度ΔF 值呈良好的線性關(guān)系,線性回歸方程為 ΔF=3.0×108c(g·mL-1)+12.1,R2為 0.9925。對(duì)濃度為 2.8×10-7g·mL-1的 ACF 溶液平行測定5 次,其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.43%。根據(jù)IUPAC規(guī)定,以 3S0/S 計(jì)算,方法檢出限(S/N=3)為1.1×10-8g·mL-1。

    2.1.8 樣品測定 隨機(jī)抽取同一批號(hào)的醋氯芬酸8片,準(zhǔn)確稱取其質(zhì)量,研細(xì)后稱取適量粉末,用超純水加熱溶解并超聲15min,最后定容至250mL 容量瓶中,搖勻,干過濾,棄去初濾液,移取一定量續(xù)濾液,按照實(shí)驗(yàn)方法測定,并進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),結(jié)果見表1。

    表1 樣品測定及回收率實(shí)驗(yàn)(n=5)Tab.1 Determination results of ACF in samples and recovery of the method(n=5)

    2.2 作用機(jī)理的研究

    2.2.1 猝滅方式的判斷 參考斯特恩-沃爾默方程:

    式中 F、F0:有無猝滅劑時(shí) BSA 的熒光強(qiáng)度;KSV:猝滅常數(shù);Kq:雙分子猝滅過程速率常數(shù);[Q]:猝滅劑的濃度;τ0:無猝滅劑時(shí)生物大分子的平均壽命。

    測定不同ACF 濃度下的F0/F 值,以F0/F 對(duì)[Q]作圖得出:293K 下,方程為 y=1.18×105x+0.963,r=0.9913;310K 下,方程為 y=1.40×105x+0.960,r=0.9991;根據(jù)方程得到的猝滅常數(shù)KSV由1.18×105逐漸增加至1.40×105L·mol-1,說明二者反應(yīng)形成了復(fù)合物且猝滅方式為動(dòng)態(tài)猝滅。但Kq的數(shù)量級(jí)為1013,猝滅方式似乎為靜態(tài)猝滅,考慮到離子強(qiáng)度是影響KSV的主要因素[8],因此Kq的增大有可能是離子強(qiáng)度影響的結(jié)果,所以初步認(rèn)為ACF-BSA 體系的猝滅過程為動(dòng)態(tài)猝滅。

    2.2.2 結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)的計(jì)算 由lg [(F0-F)/F]= lgKA+nlg[Q]可求出表觀結(jié)合常數(shù)KA和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n:

    以lg[(F0-F)/F]對(duì)lg[Q]作圖,擬合出不同ACF 濃度下的雙對(duì)數(shù)曲線:293K 下,方程為y=1.064x+5.36,r=0.9977;310K 下,方程為 y=1.134x+5.84,r=0.9980;可以看出,ACF 和BSA 的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)分別為1.06和1.13,總體接近于1,表明ACF 在BSA 上只有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。通過計(jì)算得出KA分別為2.29×105和6.92×105L·mol-1,數(shù)量級(jí)均達(dá)到 105,隨著溫度的升高逐漸增大,揭示了二者的結(jié)合力不斷增強(qiáng),即ACF能夠很好的與蛋白質(zhì)發(fā)生結(jié)合,從而在體內(nèi)起到運(yùn)輸和儲(chǔ)存的作用。

    2.2.3 作用力的判斷 有機(jī)小分子和蛋白質(zhì)大分子發(fā)生反應(yīng)主要通過各種作用力相結(jié)合,類型有:疏水作用力(ΔH>0,ΔS>0),氫鍵和范德華力(ΔH<0,ΔS<0),靜電引力(ΔH<0,ΔS>0),參考范特霍夫方程[9]:

    計(jì)算出ACF 和BSA 之間的熱力學(xué)參數(shù),見表2。

    表2 ACF-BSA 的猝滅常數(shù)、結(jié)合常數(shù),結(jié)合位點(diǎn)數(shù)和熱力學(xué)參數(shù)Tab.2 Quenching constants, binding constants, binding sites and thermodynamics parameters of BSA-ACF

    ΔH>0,ΔS>0 說明二者通過疏水作用力相結(jié)合,即ACF 進(jìn)入到BSA 的疏水腔內(nèi)部是通過疏水作用力完成的,ΔH>0,ΔG<0 說明該反應(yīng)放熱、自發(fā)正向進(jìn)行[10]。

    2.2.4 結(jié)合位置的確定 由表2 可知ACF 和BSA反應(yīng)形成復(fù)合物時(shí)存在一個(gè)結(jié)合位點(diǎn),而在BSA 的疏水亞結(jié)構(gòu)域中,含有兩個(gè)能和藥物分子結(jié)合的位點(diǎn)(ⅡA 和ⅢA)。ⅡA 位點(diǎn)同時(shí)含有 Trp 和 Tyr 兩種氨基酸殘基,而ⅢA 只含有Tyr 一種發(fā)熒光的殘基。當(dāng)激發(fā)波長為283nm 時(shí),可同時(shí)激發(fā)BSA 的Trp 和Tyr 殘基的熒光,當(dāng)激發(fā)波長為295nm 時(shí),僅激發(fā)Tyr 殘基的熒光[11]。因此,欲探究ACF 和BSA 發(fā)生反應(yīng)時(shí)兩種氨基酸的參與情況及二者具體的結(jié)合位置,本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了不同激發(fā)波長下(283nm 和295nm)ACF 對(duì)BSA 的熒光猝滅程度,計(jì)算出不同濃度下的F/F0值。

    圖5 ACF 與BSA 作用的相對(duì)熒光猝滅曲線Fig.5 Fluorescence quenching curves of ACF-BSA

    由圖5 可知,當(dāng)激發(fā)波長分別為283 和295nm時(shí),ACF 和BSA 的相對(duì)猝滅曲線沒有發(fā)生重疊,且以283nm 為激發(fā)波長的熒光猝滅程度比295 nm 激發(fā)的猝滅程度大,表明兩種氨基酸殘基均參與了猝滅過程,也進(jìn)一步確定ACF 主要和BSA 的ⅡA 位點(diǎn)發(fā)生結(jié)合。

    2.2.5 紫外吸收光譜 靜態(tài)猝滅是藥物分子與BSA在基態(tài)生成了不發(fā)光的配合物,從而引起B(yǎng)SA 的紫外吸收光譜的變化,而動(dòng)態(tài)猝滅不影響紫外吸收光譜的變化。實(shí)驗(yàn)于8453 型紫外-可見分光光度計(jì)上分別測定BSA 及BSA-ACF 的紫外吸收光譜圖,發(fā)現(xiàn)最大吸收波長和峰型均沒有發(fā)生變化。進(jìn)一步揭示了ACF 和BSA 的猝滅過程為動(dòng)態(tài)猝滅。

    2.2.6 同步熒光分析 同步熒光法可以探究ACF對(duì)BSA 的Trp 殘基和Tyr 殘基的影響,因此,同步熒光光譜也可以作為判斷結(jié)合位點(diǎn)的手段。Δλ=15nm時(shí)為Tyr 殘基的光譜特征,Δλ=60nm 時(shí)為Trp 殘基的光譜特征。

    圖6 BSA-ACF 的同步熒光光譜圖Fig.6 Synchronous fluorescence spectra of BSA-ACF system

    由圖6 可知,隨著ACF 濃度的增大,Trp 和Tyr殘基的熒光強(qiáng)度均逐漸降低,但峰位置沒有發(fā)生明顯變化,表明兩種氨基酸殘基均參加了結(jié)合反應(yīng),與位點(diǎn)判斷實(shí)驗(yàn)相互印證。相比較體系在Δλ=60nm 的猝滅程度比Δλ=15nm 的猝滅程度大,證明Trp 對(duì)BSA 的熒光猝滅貢獻(xiàn)大于Tyr 殘基,即ACF 主要與BSA 的 Trp 殘基結(jié)合。

    3 結(jié)論

    在酸性條件下,利用熒光光譜法測定出不同濃度ACF 對(duì)BSA 熒光強(qiáng)度的影響,提出了定量測定ACF 的熒光新方法。溫度影響的研究表明,ACF 以動(dòng)態(tài)方式猝滅了BSA 的熒光,結(jié)合常數(shù)為105數(shù)量級(jí),即二者有很強(qiáng)的相互作用;熱力學(xué)參數(shù)表明二者主要靠疏水作用力自發(fā)結(jié)合形成復(fù)合物;同步熒光法和位點(diǎn)實(shí)驗(yàn)證明只有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn),且主要位于BSA 的ⅡA 亞結(jié)構(gòu)域中。該研究為進(jìn)一步了解ACF在體內(nèi)的儲(chǔ)存、運(yùn)輸提供了數(shù)據(jù)參考,為測定ACF含量提供了新方法。

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