人多能干細胞誘導(dǎo)類腎的實驗研究

俞 欣，李開霖，孔 峰，趙升田，張登祿

1中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院（安徽省立醫(yī)院）急診外科，安徽 合肥 230001；2山東大學(xué)第二醫(yī)院中心實驗室，山東 濟南 250000；3山東省立醫(yī)院山東省泌尿器官與功能重建工程實驗室，山東 濟南 250000；4山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院實驗中心，山東 濟南 250000

終末期腎?。╡nd stage renal disease，ESKD）已成為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重的健康問題，每年約有260 萬ESKD患者需要透析或腎移植，其中220萬患者因無法醫(yī)治而過早死亡［1］。由于腎移植供體不足，長期透析的成年患者平均壽命僅為10年［2］。因此，迫切需要阻止慢性腎臟疾病向ESKD進展的治療。考慮到腎臟疾病可能由遺傳異常引起，所以需要更全面地了解人類腎臟的發(fā)育，盡管動物模型可以提供關(guān)于發(fā)育機制的信息，但不能準(zhǔn)確反映由同源基因突變引起的人類腎臟疾?。?］。人多能干細胞（human pluripotent stem cell，hPSC）由于其擴增性及對發(fā)育信號的可塑性，可以誘導(dǎo)分化成腎臟細胞從而模擬人類遺傳腎臟疾病的發(fā)病過程［4-6］，為準(zhǔn)確了解腎臟發(fā)育過程和腎臟疾病發(fā)病機制并最終治療ESKD提供了新的思路和手段。本實驗利用hPSC在體外構(gòu)建類腎體，并通過類腎體在小鼠腎包膜下移植，證實用hPSC誘導(dǎo)類腎，具有腎臟早期的特征結(jié)構(gòu)，可在小鼠體內(nèi)環(huán)境下進一步血管化。

1 材料和方法

1.1 材料

NuwacellTM科研級HiPSC 細胞株購自安徽中盛溯源生物科技有限公司，健康4～6周SCID小鼠購自北京維通利華公司，小鼠購買后于山東大學(xué)動物實驗中心SPF級飼養(yǎng)，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

hPSC誘導(dǎo)類腎試劑：NuwacellTMNova hPSC培養(yǎng)基、NuwacellTMhPSC來源腎上皮細胞分化試劑盒、Nu?wacellTMEDTA 傳代工作液、NuwacellTMBlebbistatin、NuwacellTMhPSC 凍存液、NuwacellTMSolase 細胞消化液、0.25%Trypsin?EDTA 和Trypsin inhibitor（安徽中盛溯源生物科技有限公司），Matrigel（Corning公司，美國），DMEM/F12培養(yǎng)基、DPBS、24孔板和T25培養(yǎng)瓶（Thermo Scientific 公司，美國），poly?HEMA（Sigma公司，美國）。類腎鑒定用試劑：多聚甲醛、Triton X?100、FluoroshieldTMwith DAPI（Sigma 公司，美國），CDH1、LTL、PODXL和內(nèi)皮細胞抗原?32（MECA?32）抗體（Abcam 公司，美國），Donkey Anti?Goat IgG（594）、Donkey Anti?Rabbit IgG（488）（Life Technology公司，美國）。1200型號透射電鏡（transmission elec?tron microscopy，TEM）和LKB?V半薄切片機（日本電子公司，日本）；熒光倒置顯微鏡（Nikon 公司，日本）。

1.2 方法

1.2.1 類腎的誘導(dǎo)

按NuwacellTMhPSC來源腎上皮細胞分化試劑盒步驟，誘導(dǎo)過程如下：①誘導(dǎo)起始日（D0），當(dāng)hP?SC 細胞匯合度達到50%時，啟動分化程序，將NuwacellTMNova hPSC 培養(yǎng)基吸除，加入500 μL DPBS（不含鈣鎂）洗滌細胞1次，隨后加入0.5 mL/孔分化完全培養(yǎng)基A。每天更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)4 d（D0～D4）。②第4天（D4），吸除分化完全培養(yǎng)基A，以1 mL/孔加入分化完全培養(yǎng)基B，每天換液，培養(yǎng)2 d（D4～D6）。③第6天（D6），吸除分化完全培養(yǎng)基B，按照1 mL/孔加入分化完全培養(yǎng)基C，培養(yǎng)2 d（D6～D8）。④第8 天（D8），轉(zhuǎn)3D 培養(yǎng)：提前配制好6 mL 分化完全培養(yǎng)基D，并加入10 μmol/L Nu?wacellTMBlebbistatin，向24 孔板的1個孔中加入500 μL 0.25%Trypsin EDTA，37 ℃孵育3 min 后加入500 μL Trypsin Inhibitor 終止消化，使用1 mL 移液器輕柔吹打，隨后將細胞懸液轉(zhuǎn)移至1.5 mL 離心管，掌上離心機瞬時離心5～10 s，吸棄上清。加入含10 μmol/L NuwacellTMBlebbistatin 的分化完全培養(yǎng)基D 重懸細胞并轉(zhuǎn)移至poly?HEMA 包被的T25 培養(yǎng)瓶中，置于三維搖床，15 r/min 培養(yǎng)。每天換液（D8～D10）。⑤第10天（D10），吸除分化完全培養(yǎng)基D，按照6 mL/孔加入分化完全培養(yǎng)基C，連續(xù)培養(yǎng)3 d，每天換液（D10～D13）。⑥第13天（D13），吸除分化完全培養(yǎng)基C，按照5 mL/孔加入Nephron分化培養(yǎng)基E，每天換液，約2～4 d可獲得類腎（D13～D15/17）。

1.2.2 類腎免疫熒光檢測

類腎冰凍切片使用DPBS洗1遍，5 min；4%多聚甲醛室溫固定10 min，DPBS 洗3 遍，每遍5 min；向切片中加入1%Triton X?100（溶于DPBS 中）室溫通透1 h；DPBS洗3遍，每遍5 min；使用10%山羊血清室溫封閉1 h；用封閉液按1∶100 稀釋一抗；移除封閉液，加入一抗CDH1、PODXL 和LTL 抗體，4 ℃孵育過夜；移除一抗，DPBS 洗3 遍，每遍5 min；使用封閉液按1∶1 000 稀釋二抗Donkey Anti?Goat IgG（594）、Donkey Anti?Rabbit IgG（488），避光加入二抗，室溫孵育1 h；移除二抗，用DPBS洗2遍，每遍5 min，避光；向切片中加入適量FluoroshieldTMwith DAPI，熒光顯微鏡下觀察染色情況。

1.2.3 類腎的電鏡觀察

類腎誘導(dǎo)的第15 天（D15），取約1 mm3類腎樣品若干塊，分別迅速置入盛有3%戊二醛固定液的小瓶中，常規(guī)浸洗、1%鍔酸固定、磷酸緩沖液漂洗、梯度脫水、Epon812 包埋，半薄切片定位，制備超薄切片，經(jīng)醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重電子染色后，用透射電鏡觀察。

1.2.4 小鼠腎包膜下類腎移植

SCID 小鼠實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，類腎在體外誘導(dǎo)至D15，進行移植手術(shù)，切開小鼠右腎包膜，將類腎顆粒移植到小鼠右腎包膜下，利用包膜的組織張力固定類腎顆粒。

1.2.5 移植后類腎的組織學(xué)檢測

移植手術(shù)后，小鼠繼續(xù)飼養(yǎng)4周，處死。取右腎及類腎標(biāo)本進行大體觀察、HE 染色和免疫熒光鑒定。HE 染色：取移植后類腎標(biāo)本，甲醛固定后，經(jīng)過脫水、透明和浸蠟等程序后，再以石蠟、切片進行HE染色。免疫熒光鑒定CDH1、PODXL和MECA?32，實驗過程同類腎免疫熒光檢測。

2 結(jié)果

2.1 類腎的組織學(xué)檢測

利用腎臟高效表達特異性標(biāo)志物PODXL、LTL和CDH1 分別檢測類腎足細胞、近端小管和遠端小管。免疫熒光顯示PODXL呈陽性表達，陽性細胞呈球形分布。免疫熒光顯示LTL 和CDH1 表達陽性，陽性細胞呈管形分布。PODXL 陽性表達細胞分布于LTL 和CDH1 陽性表達細胞的末端（圖1）。足細胞、近端小管和遠端小管的特異性蛋白陽性表達，且陽性細胞的毗鄰位置關(guān)系與腎臟細胞位置關(guān)系一致，提示類腎具備足細胞、近端小管和遠端小管等腎單位組成結(jié)構(gòu)。

2.2 透射電鏡觀察

電鏡下觀察到類腎體有簇狀分布的足細胞，其電鏡下特征表現(xiàn)為細胞突起豐富，細胞器豐富，細胞核凹凸明顯，有上皮樣連接結(jié)構(gòu)。TEM還觀察到上皮細胞組成的管狀結(jié)構(gòu)，上皮細胞腔面存在大量不規(guī)則的微纖毛樣結(jié)構(gòu)，細胞內(nèi)含大量線粒體，符合腎小管上皮細胞微觀表現(xiàn)；細胞核質(zhì)比大，部分上皮細胞呈復(fù)層排列，缺乏透明的管狀基底膜，提示極化不完全（圖2）。TEM未觀察到紅細胞和毛細血管。TEM 分析說明類腎具備足細胞和腎小管上皮的特征結(jié)構(gòu)，但結(jié)構(gòu)仍處于不成熟階段。

圖1 體外類腎器官CDH1、LTL和PODXL免疫熒光染色（×200）Figure 1 Immunofluorescence staining of CDH1，LTL，PODXL in renal organoids in vitro（×200）

2.3 移植類腎肉眼觀察

類腎移植小鼠腎包膜當(dāng)日觀察，類腎體積?。ㄒ运拗髂I為參照），類腎未見血管。移植4周后，類腎體積較移植時增大，類腎與宿主嵌合生長，移植物表面可觀察到多條小血管（圖3）。說明類腎可在小鼠體內(nèi)環(huán)境下完成血管化，移植物可在體內(nèi)環(huán)境持續(xù)生長。

2.4 移植類腎組織學(xué)檢測

圖2 類腎透射電鏡觀察（×8 000）Figure 2 Renal organoids were observed by TEM（×8 000）

圖3 類腎移植于SCID小鼠腎包膜下Figure 3 The renal orgnoids were transplanted into the renal subcapsular of the SCID mouse

HE 染色觀察，移植物可觀察到腎小球樣結(jié)構(gòu)、小管狀結(jié)構(gòu)和大量類軟骨結(jié)構(gòu)，腎小球和類腎基質(zhì)內(nèi)可觀察到大量紅細胞，提示類腎在移植后，獲得血管化，同時出現(xiàn)大量非腎系組成（圖4）。免疫熒光顯示，人源性特異性標(biāo)志物人抗核抗原（human unclear antigen，HNA）表達陽性，腎小球樣結(jié)構(gòu)PODXL 表達呈陽性，管狀結(jié)構(gòu)CDH1 表達呈陽性。小鼠MECA?32 陽性細胞散在分布于移植組織和腎小球結(jié)構(gòu)中（圖5）。提示移植物的血管化，其血管內(nèi)皮細胞可能是宿主來源。

3 討論

圖4 移植4周類腎HE染色（×200）Figure 4 HE staining of renal organoids after transplantation for 4 weeks（×200）

圖5 移植4周類腎免疫熒光染色（×200）Figure 5 Immunofluorescence staining of renal organoids after transplantation for 4 weeks（×200）

近年來，利用干細胞誘導(dǎo)類器官作為研究發(fā)育和疾病的體外模型研究取得了較大進展［5，7-8］。早期將多能干細胞轉(zhuǎn)化為腎細胞的方案，是試圖模擬控制中間中胚層早期腎臟形成的發(fā)育信號，發(fā)現(xiàn)包括低劑量Wnt 激動劑CHIR99021 在內(nèi)的一系列誘導(dǎo)因子可誘導(dǎo)中間中胚層樣細胞［9］。該領(lǐng)域的重大突破是發(fā)現(xiàn)高濃度的CHIR99021（8 mmol/L）和成纖維細胞生長因子9（fibroblast growth factor 9，F(xiàn)GF9）可誘導(dǎo)具有類似于妊娠早期胎兒腎臟的類器官［10］。隨后研究表明，B27可以替代FGF9，B27是一種用于維持神經(jīng)元細胞培養(yǎng)中的無血清補充劑。此外，激活素A、骨形態(tài)發(fā)生蛋白和FGF9的更復(fù)雜組合已被用于誘導(dǎo)腎臟類器官的形成［11-13］。這些誘導(dǎo)因子在多能干細胞誘導(dǎo)類腎過程中的作用機制，目前尚不清楚［14］。目前誘導(dǎo)方案的主要缺點是試劑成本高以及誘導(dǎo)過程復(fù)雜，從而限制了腎臟類器官的大規(guī)模培養(yǎng)［13］。本研究通過腎上皮細胞誘導(dǎo)試劑盒優(yōu)化類腎誘導(dǎo)過程，誘導(dǎo)出類腎結(jié)構(gòu)，成本較低，并且具有較好的重復(fù)性。HE 染色觀察到腎小球樣和腎小管樣結(jié)構(gòu)，免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，足細胞標(biāo)志物PODXL在腎小球結(jié)構(gòu)中陽性表達，近端小管標(biāo)志物L(fēng)TL和遠端小管標(biāo)志物CDH1 在小管結(jié)構(gòu)中陽性表達，表明本實驗誘導(dǎo)的類腎體具有足細胞、近端小管和遠端小管等腎臟特征結(jié)構(gòu)。

多種體外誘導(dǎo)類腎方案都可以生成人類腎臟特征的細胞類型和結(jié)構(gòu)，但相較于人類腎臟約35周的體內(nèi)發(fā)育時間，體外誘導(dǎo)類腎培養(yǎng)時間最多只有幾周，因此類腎的成熟程度普遍較低，這在基因和形態(tài)水平上均得到了證實［14］。為了進一步評估類腎中腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)成熟度，本研究對體外誘導(dǎo)的類腎體進行了TEM分析，觀察到類腎中足細胞初級突起、次級突起等特征表現(xiàn)，但足細胞排列松散，也未發(fā)現(xiàn)毛細血管結(jié)構(gòu)；在腎小管中，觀察到上皮細胞腔面大量不規(guī)則的微纖毛樣結(jié)構(gòu)，形成刷狀緣，同時部分上皮細胞表現(xiàn)為多層上皮，提示極化不完全。本研究在超微觀結(jié)構(gòu)上進一步證實了體外誘導(dǎo)的類腎結(jié)構(gòu)不成熟，這與其他誘導(dǎo)方案通過免疫組化等鑒定結(jié)果相一致。體外誘導(dǎo)類腎體的結(jié)構(gòu)幼稚，目前認(rèn)為當(dāng)前的誘導(dǎo)方案尚無法完全模擬體內(nèi)腎臟發(fā)育過程［15］。另外，在體外培養(yǎng)環(huán)境中，隨著類腎組織體積增大，由于沒有功能性血管的營養(yǎng)供應(yīng)，類腎的營養(yǎng)攝入和代謝物排出障礙出現(xiàn)負(fù)代謝平衡，細胞無法持續(xù)擴增［16］。

類腎體的血管化是其發(fā)育成熟并最終產(chǎn)生功能的關(guān)鍵，van den Berg 等［16］和Bantounas 等［17］利用Takasato 方案誘導(dǎo)的類腎，分別移植到小鼠腎包膜和皮下，發(fā)現(xiàn)hPSC來源的腎臟組織能夠募集宿主來源的內(nèi)皮細胞，形成宿主來源的腎小球循環(huán)，并促進了移植物結(jié)構(gòu)成熟，這表明功能性血管化是人類腎臟類器官成熟形態(tài)形成所必需的。本研究將體外誘導(dǎo)的D15 類腎體移植到小鼠腎包膜下，發(fā)現(xiàn)移植物體積逐漸增大，并且肉眼可見移植物中存在連接移植物和宿主的血管。HE 染色可見移植物腎小球結(jié)構(gòu)內(nèi)部及移植物基質(zhì)中大量紅細胞。免疫熒光顯示，小鼠MECA?32陽性細胞彌散分布于移植組織和腎小球結(jié)構(gòu)中。本研究進一步證實類腎在小鼠體內(nèi)環(huán)境中，可能通過招募宿主來源的內(nèi)皮細胞完成血管化，并促進其進一步生長。本研究還發(fā)現(xiàn)，隨著移植時間的延長，腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)逐漸減少，移植物中出現(xiàn)大量類軟骨結(jié)構(gòu)。這可能是由于誘導(dǎo)過程中脫靶細胞的存在，以及上皮細胞向非腎系的去分化［15］。這說明，生成結(jié)構(gòu)單一的腎臟組織，需要進一步優(yōu)化誘導(dǎo)方案，以促進干細胞向腎系最終分化，并在誘導(dǎo)過程中避免細胞脫靶。

綜上所述，人多能干細胞hPSC通過體外誘導(dǎo)可生成類似早期腎臟的幼稚結(jié)構(gòu)，在體內(nèi)環(huán)境，可能通過招募宿主內(nèi)皮細胞完成血管化，促進類腎生長，同時大量非腎系組織生成，所以仍需優(yōu)化誘導(dǎo)方案，避免脫靶細胞的產(chǎn)生和促進類腎組織的最終分化。