超高壓處理對(duì)生牛乳中微生物的影響

沈夢(mèng)琪，齡南，王猛，胡靜，胡長(zhǎng)利

（南京衛(wèi)崗乳業(yè)有限公司研發(fā)部,南京211151）

0 引言

現(xiàn)代食品工業(yè)中，為了保證食品安全性，延長(zhǎng)貨架期，可以通過各種殺菌技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)。目前乳品行業(yè)中常用的殺菌方式主要為熱殺菌，包括巴氏殺菌和超高溫瞬時(shí)殺菌（Ultra-high Temperature treated，UHT）。傳統(tǒng)熱殺菌技術(shù)雖然可以殺滅乳品中大部分微生物，但同時(shí)會(huì)造成牛乳中活性成分及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不可避免的損失，并伴隨著“蒸煮味”出現(xiàn)[1]。

超 高 壓 技 術(shù)（Ultra-high Pressure Processing，UHP）又稱為高靜水壓技術(shù)（High Hydrostatic Pressure，HHP），是一種新型冷殺菌技術(shù)，近年來(lái)已經(jīng)在食品工業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域得到一定的應(yīng)用。超高壓技術(shù)具有不升溫、無(wú)二次污染等特點(diǎn)，通常使用水作為壓強(qiáng)傳遞介質(zhì)，在常溫或低溫條件下，通過施加100～1 000 MPa的高壓，改變食品中蛋白質(zhì)、酶類、核酸等生物大分子的活性、構(gòu)象等，進(jìn)而殺滅存在的腐敗菌、致病菌，延長(zhǎng)食品貨架期[2-3]。超高壓技術(shù)是一種多靶點(diǎn)殺菌技術(shù)，其原理在于壓力會(huì)改變分子間距，致使微生物細(xì)胞形態(tài)改變，同時(shí)生物大分子物質(zhì)立體結(jié)構(gòu)的非共價(jià)鍵被破壞，酶活性和遺傳物質(zhì)復(fù)制等被抑制，從而引起細(xì)胞膜、細(xì)胞壁等細(xì)胞器功能損失，這些損傷累積最終導(dǎo)致了細(xì)胞死亡[4]。另外，高壓不會(huì)影響共價(jià)鍵，因此對(duì)食品內(nèi)部的化學(xué)變化影響較小，對(duì)維生素、風(fēng)味化合物、色素等食品質(zhì)量關(guān)鍵成分的破壞性較小，其非熱特性亦能較好保留食品原有感官品質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)成分[5-7]。

牛乳營(yíng)養(yǎng)豐富，同時(shí)也是微生物天然的培養(yǎng)基，因此乳和乳制品生產(chǎn)過程中很容易受到微生物的污染，進(jìn)而影響產(chǎn)品質(zhì)量安全[8]。有研究表明[9-11]，超高壓技術(shù)可以殺滅生牛乳中的腐敗菌、致病菌，400～600 MPa壓力處理生牛乳的殺菌效果與72℃，15 s的巴氏殺菌的效果相當(dāng)，且能顯著殺滅大腸桿菌和沙門氏菌等微生物。本實(shí)驗(yàn)以工作壓力、保壓時(shí)間和保溫時(shí)間為因素，研究不同條件超高壓處理對(duì)生牛乳中微生物的殺滅效果，篩選出殺滅效果較顯著的工藝參數(shù)組合，并跟蹤測(cè)定超高壓殺菌乳在2～6℃貯藏期間（0、5、10、20、25、30 d）菌落總數(shù)、大腸菌群、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的變化情況，為超高壓技術(shù)在乳品生產(chǎn)工業(yè)化應(yīng)用提供一定的理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生牛乳，南京衛(wèi)崗乳業(yè)自有牧場(chǎng)；平板計(jì)數(shù)瓊脂（plate count agar，PCA）培養(yǎng)基、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）培養(yǎng)基、緩沖蛋白胨水（BPW）、四硫磺酸鈉煌綠（TTB）增菌液、亞硒酸鹽胱氨酸（SC）增菌液、亞硫酸鉍（BS）瓊脂、木糖賴氨酸脫氧膽鹽（XLD）瓊脂，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；金黃色葡萄球菌測(cè)試片，美國(guó)3M。

1.2 儀器與設(shè)備

超高壓食品加工設(shè)備HYPREE 50；隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；超凈工作臺(tái)，新加坡藝思高科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 生牛乳超高壓處理

取130 mL新鮮生牛乳裝入聚乙烯塑料瓶中，密封后先置于50℃水浴中進(jìn)行升溫，升溫結(jié)束后放入超高壓設(shè)備的壓力腔內(nèi)，以水為高壓介質(zhì)（介質(zhì)溫度為3～6℃），對(duì)生牛乳進(jìn)行不同條件的超高壓處理。

1.3.2 工作壓力單因素試驗(yàn)

選用300、400、500、600 MPa 4個(gè)工作壓力，分別處理10 min，空白對(duì)照組為未經(jīng)高壓處理的生牛乳，盡快進(jìn)行處理前后樣品微生物的測(cè)定。

1.3.3 保壓時(shí)間單因素試驗(yàn)

工作壓力選用400 MPa，分別處理5、10、15、20、25 min，空白對(duì)照組為未經(jīng)高壓處理的生牛乳，盡快進(jìn)行處理前后樣品微生物的測(cè)定。

1.3.4 保溫時(shí)間單因素試驗(yàn)

工作壓力選用400 MPa，保壓時(shí)間選用10 min，樣品溫度達(dá)到50℃后在水浴鍋中分別保溫5、10、15、20、25、30 min后再進(jìn)行超高壓處理，空白對(duì)照組為未經(jīng)高壓處理的生牛乳，盡快進(jìn)行處理前后樣品微生物的測(cè)定。

1.3.5 正交試驗(yàn)

選用工作壓力、保壓時(shí)間和保溫時(shí)間為實(shí)驗(yàn)因素，進(jìn)行L9（34）正交實(shí)驗(yàn)，空白對(duì)照為未經(jīng)任何處理的生牛乳，以菌落總數(shù)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選出微生物殺滅效果較顯著的工藝參數(shù)組合。因素水平設(shè)置如表1所示。

表1 超高壓處理生牛乳正交試驗(yàn)表

1.3.6 超高壓殺菌乳貯藏期間微生物的變化

測(cè)定超高壓殺菌乳在2～6℃貯藏期間（0、5、10、20、25、30 d）菌落總數(shù)、大腸菌群、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的變化情況，評(píng)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)參考企業(yè)內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.7 微生物的測(cè)定

菌落總數(shù)測(cè)定采用平板計(jì)數(shù)法，具體可參照GB 4789.2-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》。菌落總數(shù)致死率的計(jì)算公式為：

致死率（%）=（對(duì)照組樣品的菌落總數(shù)-實(shí)驗(yàn)組樣品的菌落總數(shù)）／對(duì)照組樣品的菌落總數(shù)×100%

大腸菌群測(cè)定采用平板計(jì)數(shù)法，具體可參照GB 4789.3-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》。大腸菌群致死率的計(jì)算公式為：

致死率（%）=（對(duì)照組樣品的大腸菌群數(shù)-實(shí)驗(yàn)組樣品的大腸菌群數(shù)）/對(duì)照組樣品的大腸菌群數(shù)×100%

金黃色葡萄球菌檢測(cè)采用測(cè)試紙片法[12]，取處理好的樣品1 mL接種于測(cè)試紙片上，將上層膜緩慢蓋下，靜置等待培養(yǎng)基凝固。將測(cè)試紙片疊放在一起放回原自封袋并封口，透明面朝上水平置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)溫度為36±1℃，培養(yǎng)24 h后觀察。對(duì)于疑似菌落，加入確認(rèn)反應(yīng)片，并在36±1℃環(huán)境下再培養(yǎng)1～2 h后觀察。

沙門氏菌檢測(cè)程序可參考GB 4789.4-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)》。

2 結(jié)果與討論

2.1 工作壓力對(duì)生牛乳中微生物的影響

在樣品溫度4℃、保壓時(shí)間10 min條件下，采用不同工作壓力處理生牛乳，其微生物結(jié)果如圖1所示。不同的超高壓工作壓力對(duì)生牛乳中的菌落總數(shù)和大腸菌群均有顯著的殺滅效果，且隨著工作壓力的增加，滅菌效果均呈上升趨勢(shì)。

圖1 不同工作壓力對(duì)生牛乳中微生物的影響

菌落總數(shù)的致死率曲線表明：當(dāng)工作壓力為300 MPa時(shí)，致死率已經(jīng)超過85%；當(dāng)工作壓力增加至400 MPa時(shí)，致死率呈直線上升趨勢(shì)，達(dá)到95%以上，滅菌效果十分明顯；當(dāng)工作壓力＞400 MPa時(shí)，致死率仍呈上升趨勢(shì)，雖然整體趨于平緩，但此時(shí)致死率已經(jīng)接近100%。

大腸菌群的致死率曲線整體趨勢(shì)與菌落總數(shù)相似：當(dāng)工作壓力為300 MPa時(shí)，致死率已經(jīng)超過95%，滅菌效果十分明顯；當(dāng)工作壓力≥400 MPa時(shí)，致死率仍呈上升趨勢(shì)，雖然整體趨于平緩，但此時(shí)致死率已經(jīng)接近100%。

由此可見相比菌落總數(shù)，超高壓對(duì)于大腸桿菌的殺滅效果更顯著，這與Toledo[10]、魏靜[13]等的研究結(jié)果相符。研究表明[12,14-15]，超高壓對(duì)微生物的破壞主要集中在細(xì)胞膜和細(xì)胞壁上，壓力可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜中脂質(zhì)從凝膠向水合物的晶體結(jié)構(gòu)改變，從而降低膜流動(dòng)性，改變細(xì)胞膜通透性，不僅影響微生物自身營(yíng)養(yǎng)吸收，同時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)積累的代謝廢物清除受阻，進(jìn)而破壞正常代謝途徑?？梢妷毫κ怯绊懳⑸锸Щ畹闹匾蛩?，且工作壓力越大，微生物細(xì)胞膜的破壞程度也越嚴(yán)重。另外，姜雪等[16]研究也表明保壓時(shí)間一致時(shí)，壓力的增加能有效提升菌落總數(shù)的致死率。

綜上，以微生物致死率達(dá)到95%以上為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選擇400、500、600 MPa進(jìn)行下一步正交試驗(yàn)。

2.2 保壓時(shí)間對(duì)生牛乳中微生物的影響

在樣品溫度4℃、工作壓力400 MPa條件下，選取保壓時(shí)間5、10、15、20、25 min對(duì)生牛乳進(jìn)行超高壓處理，其微生物結(jié)果如圖2所示。隨著保壓時(shí)間的增加，超高壓處理對(duì)生牛乳中菌落總數(shù)和大腸菌群的殺滅效果均呈上升趨勢(shì)。

圖2 不同保壓時(shí)間對(duì)生牛乳中微生物的影響

菌落總數(shù)的致死率曲線表明：當(dāng)保壓時(shí)間為5 min時(shí)，致死率已經(jīng)超過85%；當(dāng)保壓時(shí)間增加至10 min時(shí)，致死率呈直線上升趨勢(shì)，達(dá)到95%以上，滅菌效果十分明顯；當(dāng)保壓時(shí)間＞10 min時(shí)，致死率仍呈上升趨勢(shì)，雖然整體趨于平緩，但此時(shí)致死率已經(jīng)接近100%。

大腸菌群的致死率曲線整體趨勢(shì)與菌落總數(shù)相似：當(dāng)保壓時(shí)間為5 min時(shí)，致死率已經(jīng)超過95%，滅菌效果十分明顯；當(dāng)保壓時(shí)間＞10 min時(shí)，致死率仍呈上升趨勢(shì)，雖然整體趨于平緩，但此時(shí)致死率已經(jīng)接近100%。

由此可見相同工作壓力條件下，多數(shù)情況下延長(zhǎng)保壓時(shí)間可以提高超高壓處理的滅菌效果，保壓時(shí)間越長(zhǎng)，滅菌效果越好。Gaenzle[17]等通過熒光染色技術(shù)研究超高壓處理對(duì)大腸桿菌細(xì)胞膜的破壞作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，不可逆的膜損傷與保壓時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān)。但當(dāng)保壓時(shí)間增加至一定范圍，其對(duì)滅菌效果的影響基本可忽略不計(jì)，喬長(zhǎng)晟[18]等的研究也表明了這一點(diǎn)。這可能是因?yàn)檫^長(zhǎng)的保壓時(shí)間會(huì)導(dǎo)致部分微生物產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)進(jìn)而適應(yīng)壓力[19]。

綜上，以微生物致死率達(dá)到95%以上為評(píng)價(jià)指標(biāo)，同時(shí)考慮實(shí)際生產(chǎn)耗能問題，選擇5、10、15 min進(jìn)行下一步正交試驗(yàn)。

2.3 保溫時(shí)間對(duì)生牛乳中微生物的影響

考慮到牛乳的實(shí)際生產(chǎn)過程中，除了殺菌之外，還可能存在在其他環(huán)節(jié)受到熱影響的情況，因此通過水浴將樣品升溫至50℃后，在水浴鍋中保溫5、10、15、20、25、30 min后再進(jìn)行超高壓處理，超高壓條件為工作壓力400 MPa，保壓時(shí)間10 min，其微生物結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同保溫時(shí)間對(duì)生牛乳中微生物的影響

菌落總數(shù)的致死率曲線表明：當(dāng)保溫時(shí)間為5 min時(shí)，致死率已經(jīng)超過95%，滅菌效果十分明顯；當(dāng)保溫時(shí)間≥10 min時(shí)，盡管致死率出現(xiàn)上升-下降-上升的趨勢(shì)，但仍維持在95%以上，滅菌效果十分顯著。

大腸菌群的致死率曲線表明：當(dāng)保溫時(shí)間為5 min時(shí)，致死率已經(jīng)超過95%；當(dāng)保溫時(shí)間≥10 min時(shí)，盡管致死率略有降低，但仍維持在95%以上，滅菌效果十分顯著。

由此可見隨著保溫時(shí)間的增加，超高壓處理對(duì)生牛乳中菌落總數(shù)和大腸菌群仍有顯著的殺滅效果，但整體趨勢(shì)出現(xiàn)了上下波動(dòng)，不再呈線性相關(guān)關(guān)系。溫度是影響超高壓處理致死微生物效果的因素之一，其對(duì)微生物生長(zhǎng)代謝和存活與否有著重要的影響[20]。低溫條件下蛋白質(zhì)易受高壓影響發(fā)生變性，降低了微生物的耐壓性；溫度適當(dāng)提高的情況下，溫度可與超高壓起協(xié)同作用[21-22]。方亮[23]、Islam[24]等的研究也表明中溫協(xié)同超高壓不僅可以有效的殺菌、滅酶，同時(shí)也可相應(yīng)降低超高壓設(shè)備的工藝參數(shù)，降低耗能，為加工技術(shù)產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用進(jìn)一步創(chuàng)造有利條件。但從圖3可以看出，保溫時(shí)間對(duì)于菌落總數(shù)和大腸菌群的殺滅效果并未起到明顯的促進(jìn)作用，溫度對(duì)微生物的影響并沒有通過保溫時(shí)間體現(xiàn)。綜上，以微生物致死率出現(xiàn)拐點(diǎn)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選擇10、20、30 min進(jìn)行下一步正交試驗(yàn)。

2.4 正交試驗(yàn)

綜合工作壓力、保壓時(shí)間及保溫時(shí)間的單因素試驗(yàn)，根據(jù)菌落總數(shù)致死率確定最佳正交水平，試驗(yàn)結(jié)果及方差分析如表2所示。

表2 不同超高壓處理對(duì)生牛乳中菌落總數(shù)致死率的影響

根據(jù)表2的數(shù)據(jù)，分析k值可知：最優(yōu)工藝組合為A3B3C3，即工作壓力600 MPa、保壓時(shí)間15 min、保溫時(shí)間30 min，經(jīng)驗(yàn)證在此條件下，菌落總數(shù)的致死率為100%；分析極差可知：RA＞RB＞RC，因此所設(shè)3個(gè)影響因素對(duì)生牛乳中菌落總數(shù)滅菌效果的作用順序?yàn)椋汗ぷ鲏毫Γ颈簳r(shí)間＞保溫時(shí)間。

2.5 超高壓殺菌乳貯藏期間微生物的變化

選用工作壓力600 MPa、保壓時(shí)間15 min、保溫時(shí)間30 min對(duì)生牛乳進(jìn)行超高壓處理，并測(cè)定超高壓殺菌乳在2～6℃貯藏期間（0、5、10、20、25、30 d）菌落總數(shù)、大腸菌群、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的變化情況，結(jié)果如表3所示。評(píng)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)參考企業(yè)內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)：菌落總數(shù)小于100，大腸菌群、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌未檢出即視為合格。

表3 超高壓殺菌乳貯藏期間微生物的變化情況

由表3可知，超高壓處理對(duì)生牛乳中微生物的殺滅效果十分明顯。隨著貯藏時(shí)間的增加，菌落總數(shù)也逐漸增加，但在0～25 d內(nèi)仍少于100，符合內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)，直到30 d才超出100；大腸菌群、沙門氏菌及金黃色葡萄球菌則直到第30 d仍符合內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)。由此可見優(yōu)化得到的工藝組合可顯著殺滅生牛乳中的微生物，且一定程度上可以有效延長(zhǎng)巴氏殺菌乳的貨架期。

3 結(jié)論

通過工作壓力、保壓時(shí)間和保溫時(shí)間單因素試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)超高壓處理能夠顯著殺滅生牛乳中的微生物，且滅菌效果會(huì)隨工作壓力、保壓時(shí)間的增加而增加，但保溫時(shí)間并沒有明顯的促進(jìn)作用。另外，盡管滅菌效果與工作壓力、保壓時(shí)間成正比關(guān)系，但當(dāng)工作壓力或者保壓時(shí)間增加到一定范圍時(shí)，滅菌效果仍然趨于緩慢增加，說(shuō)明當(dāng)殺菌率達(dá)到一定后，僅通過增加工作壓力或者保壓時(shí)間并不能實(shí)現(xiàn)完全殺滅微生物的目標(biāo)，需要結(jié)合其它因素來(lái)進(jìn)一步提高滅菌效率。

通過正交試驗(yàn)，初步篩選出超高壓處理的最優(yōu)工藝組合為工作壓力600 MPa、保壓時(shí)間15 min、保溫時(shí)間30 min，影響因素對(duì)菌落總數(shù)滅菌效果的作用順序?yàn)椋汗ぷ鲏毫Γ颈簳r(shí)間＞保溫時(shí)間。

通過測(cè)定超高壓殺菌乳貯藏期間微生物的變化情況，發(fā)現(xiàn)優(yōu)化得到的工藝組合對(duì)生牛乳中微生物的致死作用明顯，且一定程度上可以有效延長(zhǎng)巴氏殺菌乳的貨架期，直到第30 d時(shí)菌落總數(shù)才超出評(píng)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)范圍，有利于擴(kuò)大超高壓殺菌乳的銷售半徑。

綜上所述，超高壓處理對(duì)生牛乳中的微生物有良好的殺滅效果，對(duì)于乳制品生產(chǎn)加工行業(yè)而言有著廣泛的應(yīng)用前景。