牛初乳小分子活性肽對小鼠骨密度及脂肪含量的影響研究

郭瑞峰，劉少偉，姚剛

（1.華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院，上海200237；2.中國科學(xué)院上海營養(yǎng)與健康研究所，上海200031）

0 引言

牛初乳是母牛產(chǎn)犢后3天內(nèi)分泌的乳汁，因其含有較高的蛋白質(zhì)以及較低的脂肪和糖，與普通牛乳明顯不同。20世紀(jì)50年代以來，人們發(fā)現(xiàn)牛初乳中不僅含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，而且免疫因子、生長因子等天然功能因子的含量極為豐富。研究發(fā)現(xiàn)這些活性成分一般為蛋白質(zhì)或多肽，如免疫球蛋白、乳鐵蛋白、溶菌酶、類胰島素生長因子、表皮生長因子等，它們在免疫調(diào)節(jié)、改善胃腸道、促進生長發(fā)育、改善衰老癥狀、抑制多種病菌等方面發(fā)揮一系列生理功能。由此，牛初乳也被譽為“21世紀(jì)的保健食品”[1-4]。初乳作為哺乳動物提供給幼仔的最初食物，其功能性成分保障了動物幼仔的健康成長；而作為功能性食品，則具有很高的應(yīng)用價值。國內(nèi)外研究表明，牛初乳中的生理活性成分在免疫調(diào)節(jié)、延緩衰老、促進生長發(fā)育及抑制腫瘤等方面，不僅可以用來制造功能性食品，而且還具有開發(fā)成天然活性生物藥物的巨大潛力[5-8]。

目前，人們研究較多的乳源性生物活性肽主要有阿片肽、抗菌肽、抗高血壓肽、抗血栓肽、免疫調(diào)節(jié)肽、酪蛋白磷酸肽，以及近些年興起的富脯氨酸多肽等，多集中于分子量較大的活性分子，而對小分子多肽的研究卻鮮有報道。在前面的研究中，我們采用脫脂技術(shù)結(jié)合超濾膜法物理分離牛初乳中不同區(qū)段的蛋白片段，得到了天然的小分子蛋白多肽，并證實而其中3 ku以下的蛋白片段對不同種類細(xì)胞的生長都有一定的促進作用[9]。如，對HFL-Ⅰ細(xì)胞的生長具有很明顯的促進作用，并且對HFL-Ⅰ細(xì)胞、293細(xì)胞以及HL-7702細(xì)胞的生長均呈現(xiàn)出一定的劑量效應(yīng)關(guān)系；同時也驗證了超濾膜法分離得到的蛋白片段很好的保留了牛初乳中的活性物質(zhì)分子。此外,我們在另一項研究中還發(fā)現(xiàn)了3 ku以下的小分子多肽具有一定的抑菌作用，并在色譜法分離后經(jīng)過多肽/蛋白質(zhì)N-端測序分析，證實為β-酪蛋白片段。因此，我們初步認(rèn)定牛初乳中分子量低于3 ku的小分子蛋白多肽具有一定的功能作用。為了進一步探討牛初乳中小分子蛋白多肽對個體生長的促進作用，將分離獲得的不同區(qū)段的蛋白片段加以收集凍干，并作為膳食補充劑提供給Balb/C小鼠，初步探討牛初乳活性肽對小鼠生長方面的影響。

1 實驗

1.1 材料

1.1.1 試劑

牛初乳由上海奶牛場提供；冰醋酸、無水乙醇購自上海國藥集團。

1.1.2 主要儀器SY-MU2010切向流超濾系統(tǒng)為上海世遠(yuǎn)生物設(shè)備工程有限公司產(chǎn)品；KY-I微型空氣壓縮機，上海精勝科學(xué)儀器有限公司；ThermoLL3000冷凍干燥機；超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；Thermo ST8R高速冷凍離心機；雙能X線骨密度儀，美國Hologic公司產(chǎn)品。

1.1.3 實驗動物Balb/C雄性小鼠。

1.2 方法

1.2.1 實驗流程

新鮮牛初乳解凍→離心脫脂→調(diào)節(jié)pH去除酪蛋白→酒精去除白蛋白→過濾→超濾收集3 ku以下、3～10 ku及10 ku以上三個區(qū)段→凍干處理→動物實驗

1.2.2 牛初乳的預(yù)處理

牛初乳首先經(jīng)4℃、5 000g離心15 min進行脫脂處理，去除上層脂肪、大顆粒蛋白及雜質(zhì)沉淀；然后加入蒸餾水對倍稀釋，用冰醋酸調(diào)pH至4.0，45℃水浴30 min，并充分?jǐn)嚢杌靹?，再?jīng)8 000g、4℃離心10 min，去除酪蛋白沉淀，取上清蛋白溶液；再根據(jù)牛初乳的體積加入20%的酒精，沉淀白蛋白，于4℃以8 000g離心20 min，棄下層的蛋白沉淀，取出上層清液。

1.2.3 超濾離心預(yù)處理過的牛初乳獲取不同區(qū)段蛋白

利用30 ku超濾離心管，在20℃、4 000g條件下離心20 min，收集上層蛋白溶液(含30 ku以上蛋白)；然后把下層蛋白溶液轉(zhuǎn)入10 ku超濾離心管，在20℃、4 000 g條件下離心20 min，收集上層蛋白液體(含10～30 ku蛋白)；再把下層蛋白溶液轉(zhuǎn)入3 ku超濾離心管，在20℃、4 000g條件下離心20 min，分別收集上層(含3～10 ku蛋白)和下層(含3 ku以下蛋白)蛋白液體，這樣就得到了不同區(qū)段的蛋白溶液，包括30 ku以上蛋白、10～30 ku區(qū)間的蛋白、3～10 ku區(qū)間的蛋白以及3 ku以下的蛋白。

1.2.4 牛初乳中不同區(qū)段蛋白樣品的收集

把收集的不同區(qū)段的蛋白溶液及去除的酪蛋白分別放入茄型瓶中，凍干后收集、稱重，記錄獲得的質(zhì)量數(shù)據(jù)。

1.2.5 骨密度及脂肪含量試驗

（1）動物分組。

本實驗采用3周齡斷奶的Balb/C雄性小鼠。84只小鼠隨機分成10組，每組8只(對照組為4只)，分別為牛初乳3 ku以下10倍日服量組；牛初乳3 ku以下30倍日服量組；牛初乳3～10 ku 10倍日服量組；牛初乳3～10 ku 30倍日服量組；牛初乳10 ku以上10倍日服量組；牛初乳10 ku以上30倍日服量組以及對照組。

（2）實驗劑量設(shè)計。

牛初乳人體推薦日服量為2 g/(60 kg·bw)，即0.035 g/(kg·bw)。設(shè)人體推薦日服量為1倍日服量，則實驗中小鼠的日服量為10倍（人體）日服量和30倍（人體）日服量。

以實驗開始階段每只小鼠體重為12 g計，則每只小鼠日服牛初乳0.00042 g（1倍日服量）。10倍日服量組每只小鼠服用牛初乳0.0042 g；30倍日服量組每只小鼠服用牛初乳0.0126 g。

每只實驗小鼠每日攝水量約為2.5 mL/(10 g·bw)。以實驗開始階段每只小鼠體重為12 g計，則每只小鼠日攝水量為約為3 mL。10倍日服量組牛初乳濃度為0.0042 g/3 mL，即0.0014 g/mL；30倍日服量組牛初乳濃度為0.0126 g/3 mL，即0.0042 g/mL。則實驗劑量最終為10倍組：0.28 g+200 mL水；30倍組：0.84 g+200 mL水。

（3）喂養(yǎng)方式。

將牛初乳不同區(qū)段按照上述劑量溶解于蒸餾水中配制成不同濃度的溶液供小鼠自由取食（對照組不加任何溶質(zhì)，為普通蒸餾水），實驗用水由實驗小鼠自由攝取，平均每4 d換一次水，正常鼠糧供應(yīng)。整個實驗過程持續(xù)60 d。60 d后處死實驗小鼠，對其進行骨密度及脂肪含量的評估。

（4）檢測方法。

服用60 d后將小鼠送上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院骨科通過Hologic雙能X線骨密度儀活體檢測小鼠骨密度值(BMC單位：g/cm2)及脂肪含量。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism7統(tǒng)計軟件進行one-way ANOVA處理分析。資料數(shù)據(jù)以(x)±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示，以P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義，但作為探索性研究，本次統(tǒng)計把檢驗水平放寬到0.1。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛初乳中不同區(qū)段的蛋白的收集

每50 mL牛初乳得到樣品質(zhì)量如表1所示。其中3 ku以下蛋白多肽的相對含量較少，低于總量的10%。

表1 不同區(qū)段蛋白的質(zhì)量

酪蛋白是牛初乳中的一種大分子蛋白，且占有相當(dāng)大的比例。我們在制備小分子蛋白片段時，通過調(diào)節(jié)pH值至4.0，并加溫至45℃，同時攪拌混勻，之后再進行離心，較佳的去除了酪蛋白分子；牛初乳中的酪蛋白去除后，剩余的蛋白主要為白蛋白，可通過酒精法形成蛋白沉淀進行去除，之后便可通過超濾法進一步分出各個不同的蛋白區(qū)段。

2.2 牛初乳各區(qū)段蛋白對小鼠骨密度的影響

牛初乳各個區(qū)段實驗組和對照組骨密度的均值情況如圖1所示。

圖1 牛初乳各區(qū)段蛋白對Balb/C小鼠骨密度的影響

各實驗組與對照組間經(jīng)統(tǒng)計學(xué)方法分析后得到的P值 依 次 如 下：0.1993，0.0634，0.3916，0.0756，0.0756，0.3460，雖然均大于0.05，但3 ku以下30倍組、3～10 ku 30倍組和10 ku以上10倍組的P值小于0.1，表明差異具有一定的意義。另外，專業(yè)意義上的差異是否顯著，我們做了如下分析。

計算公式：

骨密度增幅=（各組指標(biāo)平均值-對照組指標(biāo)平均值）/對照組指標(biāo)平均值×100%

則牛初乳3 ku以下10倍組骨密度增幅為4.65%；牛初乳3 ku以下30倍組：6.77%；牛初乳3～10 ku 10倍組：3.59%；牛初乳3～10 ku 30倍組：7.04%；牛初乳10 ku以上10倍組：4.91%；牛初乳10 ku以上30倍組：4.12%，結(jié)果如圖2所示。

圖2 各區(qū)段蛋白對Balb/C小鼠骨密度提升的幅度

由骨密度增幅結(jié)果可見，牛初乳的各個區(qū)段對于實驗小鼠骨密度值的增長都體現(xiàn)出良好的促進作用。在低劑量組方面，牛初乳3 ku以下10倍組小鼠的骨密度值略高于牛初乳3～10 ku 10倍組；而在高劑量組方面，牛初乳3 ku以下30倍組和牛初乳3～10 ku 30倍組的效果尤為突出，達到了近7%左右的增幅，具有較強的專業(yè)意義。

2.3 牛初乳各區(qū)段蛋白對小鼠脂肪含量的影響

牛初乳各個區(qū)段實驗組和對照組小鼠脂肪含量的均值情況如圖3所示。

圖3 各區(qū)段蛋白對Balb/C小鼠脂肪含量的影響

用統(tǒng)計學(xué)方法計算各實驗組間及實驗組與對照組間P值情況，其中牛初乳3 ku以下10倍組與牛初乳10 ku以上10倍組和10 ku以上30倍組間差異顯著，P值分別為0.0193和0.0210，P＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。此外，牛初乳3 ku以下30倍組與牛初乳10 ku以上10倍組和10 ku以上30倍組間P值分別為0.0561和0.0606，雖然大于0.05，但卻小于0.1，差異具有一定意義。而且專業(yè)意義上仍呈現(xiàn)出較為顯著的差異。

計算公式：

脂肪量增幅=（各組指標(biāo)平均值-對照組指標(biāo)平均值）/對照組指標(biāo)平均值×100%

牛初乳各個區(qū)段實驗小鼠的脂肪含量增幅如下，牛初乳3 ku以下10倍組：-2.29%；牛初乳3 ku以下30倍組：-1.78%；牛初乳3～10 ku10倍組：4.83%；牛初乳3～10 ku30倍組：21.63%；牛初乳10 ku以上10倍組：27.23%；牛初乳10 ku以上30倍組：27.23%，結(jié)果如圖4所示。

圖4 各區(qū)段蛋白對Balb/C小鼠脂肪含量影響的幅度

分析結(jié)果表明，在對小鼠脂肪含量的影響方面，牛初乳3 ku以下實驗組與對照組相比均有所減少，其余各組的脂肪水平則都有不同程度的上升。牛初乳3～10 ku以及10 ku以上組小鼠的脂肪含量明顯高于對照組及3 ku以下組，而其中牛初乳10 ku以上2個組的變化結(jié)果尤為突出，達到了近30%的增幅，在專業(yè)意義上差異顯著。

3 討論

牛初乳3～10 ku區(qū)段中含有大量胰島素樣生長因子I（IGF-1）。IGF-1也 被稱作“促 生長因子”（somatomedin C），是一種在分子結(jié)構(gòu)上與胰島素類似的多肽蛋白物質(zhì)。作為人體內(nèi)非常重要的細(xì)胞有絲分裂促進劑，IGF-1對于人體的生長發(fā)育有良好的促進作用[10-11]，體現(xiàn)在能促進骨的基質(zhì)合成，抑制骨骼的分解代謝，防治骨骼中鈣的流失，維持骨骼的正常結(jié)構(gòu)和功能等方面，因此在防治骨質(zhì)疏松癥中效果明顯。然而，當(dāng)今業(yè)界對于IGF-1的功效卻眾說紛紜，其中負(fù)面聲音主要針對IGF-1具有致癌作用。有事件表明，在女性攝入大量IGF-1后乳腺癌發(fā)病率明顯地提高[12-13]。雖然目前還沒有確切的證據(jù)確認(rèn)IGF-1是癌癥的誘因之一，然而從健康的角度考慮，減少IGF-1的攝入仍是安全的做法。

牛初乳3 ku以下區(qū)段中則不含有IGF-1成分[9]，但在本實驗中對于小鼠的骨密度提高方面卻表現(xiàn)出和含有IGF-1的3～10 ku區(qū)段相當(dāng)?shù)男ЧＳ纱丝梢?，其中的生物活性肽具有良好的促生長作用，并且由于天然牛初乳中生物活性肽的絕對安全性，使其體現(xiàn)出巨大的市場應(yīng)用潛力。

本實驗采用三周齡斷奶的Balb/C雄性小鼠作為實驗對象，通過在小鼠平日飲用水中添加物質(zhì)組分來研究牛初乳不同劑量的各區(qū)段蛋白對骨密度和脂肪含量等生長發(fā)育指標(biāo)的作用與影響[14]。骨密度反映的是骨質(zhì)疏松程度，是衡量骨骼質(zhì)量最重要的指標(biāo)；而骨骼質(zhì)量則又充分反映了生長發(fā)育的實際情況。因此，實驗結(jié)果中骨密度的變化會反映出牛初乳對于促進生長發(fā)育的影響程度。從實際的實驗結(jié)果來看，牛初乳各個區(qū)段實驗組小鼠的骨密度值（BMD）均高于對照組的數(shù)據(jù)。尤其是3 ku以下30倍組、3～10 ku 30倍組和10 ku以上10倍組與對照組間的P值均小于0.1，雖未達及0.05，但也體現(xiàn)出一定的意義。另外，實驗結(jié)果中30倍日服量組對于骨密度值的提升程度相比于10倍日服量組為大，證明了牛初乳的效用是依賴于劑量的，且僅從10倍日服量至30倍日服量范圍內(nèi)來看，劑量越高，對骨密度值增加的效果越明顯。

脂肪水平是衡量身體健康的重要指標(biāo)之一，脂肪水平含量過高，身體健康狀況就會降低。牛初乳3 ku以下區(qū)段在促進生長發(fā)育的同時并沒有以脂肪水平的升高作為代價，而是很好地控制住了脂肪的增長。實驗中3 ku以下10倍組與10 ku以上10倍組和10 ku以上30倍組間差異顯著，P＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。且3 ku以下30倍組與10 ku以上10倍組和10 ku以上30倍組間P值小于0.1，差異具有一定意義。由此可見，在控制脂肪水平方面，牛初乳3 ku以下區(qū)段要優(yōu)于牛初乳10 ku以上區(qū)段，其對于生長的促進作用是安全、有效以及可靠的。

牛初乳3 ku以下區(qū)段在促進生長發(fā)育中的作用未見過報道，所以，作為探索性研究，本次統(tǒng)計把檢驗水平放寬到0.1。若干組數(shù)據(jù)P值雖未達到小于0.05，但卻達到了小于0.1，而且顯示出了較為明顯的專業(yè)意義上的差異，預(yù)示著這是一個值得進一步探索的方向。同時，我們認(rèn)為這一點也可能是由于樣本量相對不足所致[15-17]，擬在后繼的研究中通過進一步增加實驗動物的數(shù)量加以完善。

綜上所述，通過超濾膜法可以很好的分離并得到牛初乳中各個區(qū)段的蛋白；牛初乳的三個區(qū)段的組分對小鼠骨密度值的增長均體現(xiàn)了良好的促進作用，尤其是3 ku以下和3～10 ku區(qū)段的高劑量組效果最為明顯；而在對脂肪含量的影響方面，3 ku以下區(qū)段的小分子多肽則具有最積極的作用，值得進一步開發(fā)和利用。

構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸雖然只有20種，但由它們排列組合所形成的肽的品種在理論上可以達到天文數(shù)字。因此，生物活性肽的資源十分廣闊，是一座亟待人類去開發(fā)挖掘的天然寶庫。然而，目前本領(lǐng)域?qū)τ趧游锍跞榈难芯烤窒抻谄渲械拇蠓肿由锘钚晕镔|(zhì)，對于小分子物質(zhì)成分卻乏人問津。因此，還需進一步在生物活性肽小分子組分上對牛初乳加以研究，以期開發(fā)出動物初乳的新制劑，提高動物初乳原料的利用率。這方面的探索必將對人類的健康事業(yè)產(chǎn)生巨大的推動作用，并帶來新的經(jīng)濟價值和社會價值。