HPLC法測(cè)定飼料中7種青霉素類藥物含量

丁晨紅，黃曉梅，王威利，萬(wàn) 凱，蘇秋權(quán)，李亞菲

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品公共監(jiān)測(cè)中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（廣州），廣東 廣州 510640）

【研究意義】青霉素類藥物屬于β-內(nèi)酰胺類抗生素，是獸醫(yī)臨床最常用的抗生素，被廣泛應(yīng)用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)［1］。根據(jù)《飼料藥物添加劑使用使用規(guī)范》及其補(bǔ)充說(shuō)明，飼料中不得添加青霉素類藥物。由于抗生素藥渣中含有豐富的蛋白質(zhì)和微量抗生素成分，在飼料和飼養(yǎng)過(guò)程中使用對(duì)動(dòng)物有一定的促生長(zhǎng)作用。2002年農(nóng)業(yè)部176號(hào)公告明確禁止在飼料和動(dòng)物飲用水中使用抗生素濾渣。我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第194號(hào)規(guī)定，自2020年7月1日起，飼料生產(chǎn)企業(yè)停止生產(chǎn)含有促生長(zhǎng)類藥物飼料添加劑（中藥類除外）的商品飼料。而近年來(lái)，在養(yǎng)殖飼料中違規(guī)添加使用阿莫西林等青霉素類藥物以及青霉素藥渣的情況屢見(jiàn)不鮮。青霉素及青霉素藥渣的濫用會(huì)在動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生藥物殘留，導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重危害，也會(huì)嚴(yán)重危害人體健康、破壞環(huán)境［2-4］。許多國(guó)家和地區(qū)對(duì)青霉素類藥物在動(dòng)物源性食品中的殘留進(jìn)行了嚴(yán)格限制，我國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第235號(hào)中規(guī)定動(dòng)物肌肉中阿莫西林、氨芐西林、青霉素 G、氯唑西林、苯唑西林的最高殘留限量分別為50、50、50、300、300 μg/kg；歐盟指令No.2377/90/EEC規(guī)定動(dòng)物肌肉中阿莫西林、氨芐西林、青霉素 G、苯唑西林、氯唑西林、雙氯西林、萘夫西林的最高殘留限量分別為50、50、50、300、300、300、300 μg/kg。我國(guó)已制定動(dòng)物源食品中青霉素類藥物殘留量的多個(gè)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，研究飼料中青霉素類藥物殘留量檢測(cè)方法對(duì)從飼料源頭控制青霉素類藥物的濫用和亂用具有重要現(xiàn)實(shí)意義。

【前人研究進(jìn)展】目前對(duì)青霉素類藥物殘留的檢測(cè)方法已有較多報(bào)道，包括免疫分析法［5-6］、毛細(xì)管電泳法［7-8］、微生物測(cè)定法［9］、高效液相色譜法［10-16］、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［17-20］、電化學(xué)法［21］等；其中高效液相色譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有操作簡(jiǎn)單、分離快、效率高等特點(diǎn)，是青霉素類藥物殘留檢測(cè)的主流分析方法；而液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)儀器設(shè)備要求高，普通實(shí)驗(yàn)室的配置難以達(dá)到要求。相較而言，液相色譜法具有更好的實(shí)際應(yīng)用前景。

【本研究切入點(diǎn)】青霉素類藥物檢測(cè)方法研究大多集中于動(dòng)物體及蛋、奶中的殘留，對(duì)于飼料樣品中青霉素類藥物含量檢測(cè)的相關(guān)研究很少。飼料樣品種類繁多、成分復(fù)雜、基質(zhì)干擾強(qiáng)，高效液相色譜法測(cè)定青霉素類藥物的應(yīng)用受到一定制約，同時(shí)測(cè)定飼料中7種青霉素類藥物含量的方法更鮮見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本試驗(yàn)擬通過(guò)柱前衍生增強(qiáng)樣品中青霉素類藥物的紫外吸收，提高檢測(cè)靈敏度，從而建立飼料中7種青霉素類藥物的高效液相色譜檢測(cè)方法，為飼料中青霉素類藥物的測(cè)定提供支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

主要試劑：乙腈、甲醇（色譜純，Merk公司）；氫氧化鈉、檸檬酸鈉、磷酸氫二鈉、乙二胺四乙酸二鈉、苯甲酸酐、氯化汞、1,2,4-三氮唑、五水硫代硫酸鈉、二水磷酸二氫鈉、無(wú)水磷酸氫二鈉、四丁基硫酸氫銨（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）；青霉素類藥物標(biāo)準(zhǔn)品：阿莫西林、青霉素G、青霉素V、氨芐西林、苯唑西林、氯唑西林、雙氯西林（純度≥90.0%，德國(guó)Dr.Ehrenstrofer GmbH公司）；親水親脂平衡型（HLB）固相萃取柱（200 mg/6 mL，Waters）；0.22 μm微孔尼龍濾膜（津騰）。供試的配合飼料、濃縮料、精料補(bǔ)充料以及添加劑預(yù)混料為市售。

主要儀器：LC-30A高效液相色譜儀（日本島津公司）、恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）、調(diào)速振蕩器（上海比朗儀器制造有限公司）、5804R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）、渦旋儀（美國(guó)Labnet公司）。

1.2 溶液配制

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（1 000 μg/mL）配置稱取適量青霉素類藥物標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品（精確至0.01 mg），置于10 mL棕色容量瓶中，用50%乙腈溶液溶解并定容至刻度，搖勻，于-20℃儲(chǔ)藏，有效期1個(gè)月。

1.2.2混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液（100 μg/mL）配置 準(zhǔn)確量取阿莫西林、青霉素G、青霉素V、氨芐西林、苯唑西林、氯唑西林、雙氯西林標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1.2.1）各1 mL，置于同一10 mL容量瓶中，用50%乙腈溶液稀釋至刻度，-20℃儲(chǔ)藏，有效期1個(gè)月。

1.2.3EDTA-Mcllvaine緩沖溶液 分別稱取檸檬酸鈉0.96 g、磷酸氫二鈉70.0 g、乙二胺四乙酸二鈉37.2 g，加水溶解，定容至1 000 mL，用5 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至8.0，混勻，臨用現(xiàn)配。

1.2.4衍生化溶液配置 稱取1,2,4-三氮唑13.78 g于100 mL棕色瓶中，用60 mL水溶解，加入10 mL現(xiàn)配制的0.1 mol/L氯化汞溶液，用5 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至9.0（±0.5），用水稀釋至100 mL，溶液為渾濁狀態(tài)。4℃避光保存，有效期3個(gè)月。

1.2.5磷酸鹽緩沖溶液配置 取五水硫代硫酸鈉2.00 g，用水溶解，再加入二水磷酸二氫鈉5.00 g、無(wú)水磷酸氫二鈉2.50 g和四丁基硫酸氫銨3.25 g，用適量水溶解稀釋到1 000 mL，過(guò)0.22 μm微孔尼龍濾膜。

1.3 樣品前處理

1.3.1配合飼料、濃縮飼料、精料補(bǔ)充料 稱取試樣2 g于50 mL離心管中，加入20 mL 20%乙腈溶液，漩渦混合30 s，振蕩20 min。10 000 r/min離心5 min，取500 μL上清液待衍生化。

1.3.2添加劑預(yù)混合飼料 稱取試樣2 g于50 mL離心管中，加入20 mL EDTA-Mcllvaine緩沖液，漩渦混合30 s，超聲10 min，10 000 r/min離心5 min，取上清液待凈化。HLB固相萃取小柱依次用甲醇、水各5 mL活化，取5.0 mL樣液過(guò)柱，先用3 mL水淋洗，抽干，加入5.0 mL乙腈洗脫，收集洗脫液，渦旋混勻后取500 μL待衍生化。

1.3.3衍生化 向所得待衍生化試液中加入50 μL 0.01 mol/L苯甲酸酐溶液，渦旋混勻后50℃水浴反應(yīng)5 min，冰浴快速冷卻至室溫后加入450 μL衍生化溶液，再次渦旋混勻后65℃水浴反應(yīng)10 min，冰浴快速冷卻至室溫；4℃下10 000 r/min離心3 min，取上層清液過(guò)微孔濾膜，6 h內(nèi)上機(jī)測(cè)定。

1.4 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備

取空白試樣，按1.3.1或1.3.2處理得到空白基質(zhì)溶液。在空白基質(zhì)溶液中加入適量混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（1.2.2），配制成濃度為0.50、0.75、1.00、2.00、5.00、10.00、20.00 μg/mL的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。取該標(biāo)準(zhǔn)系列溶液各500 μL，按1.3.3步驟進(jìn)行衍生化處理，所得基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液衍生物，所得最終濃度分別為0.25、0.375、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00 μg/mL，供上機(jī)測(cè)定。

1.5 色譜條件

色譜柱：Agilent Symmetry Shield C18（250 mm×4.6 mm，i.d 5μm）；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：325 nm；進(jìn)樣量：50 μL；流動(dòng)相：A：磷酸鹽緩沖溶液，B：乙腈；梯度洗脫：0～0.5 min 35%B，0.5～1.0 min B由35%升至40%，1.0～6.0 min B由40%升至50%，6.0～10 min B由50%升至60%并保持到12 min，12～13 mim B由60%降至35%并保持至16 min結(jié)束。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法優(yōu)化

本試驗(yàn)對(duì)配合飼料、濃縮飼料、精料補(bǔ)充料和添加劑預(yù)混合飼料采取兩種方法進(jìn)行前處理。對(duì)于配合飼料、濃縮飼料和精料補(bǔ)充料，分別選擇水、20%乙腈、50%乙腈、80%乙腈以及純乙腈作為提取劑，對(duì)添加濃度10 mg/kg的樣品進(jìn)行回收試驗(yàn)。結(jié)果表明，20%乙腈水溶液作為提取劑時(shí)，目標(biāo)化合物的回收率高、雜質(zhì)干擾少。對(duì)于添加劑預(yù)混合飼料，以EDTA-Mcllvaine緩沖溶液作為提取劑，通過(guò)HLB固相萃取小柱凈化后，再進(jìn)行衍生化反應(yīng)。試驗(yàn)比較了震蕩提取10、20、30 min和超聲波提取10 min的提取效果差異，表明超聲震蕩提取10 min為最優(yōu)提取方式，青霉素類藥物的回收率范圍在78.5%～103.3%之間。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液及其衍生物的穩(wěn)定性

取7種青霉素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（10 μg/mL）于-20℃保存，考察阿莫西林、青霉素G、青霉素V、氨芐西林、苯唑西林、氯唑西林、雙氯西林的穩(wěn)定性，于第0、7、15、30天連續(xù)監(jiān)測(cè)目標(biāo)化合物濃度的變化，結(jié)果表明，目標(biāo)化合物在-20℃條件下，1個(gè)月內(nèi)穩(wěn)定。將衍生后的7種青霉素類藥物混合溶液（濃度為1.25 μg/mL）分別置于室溫、4℃、-20℃保存，放置不同時(shí)間后，測(cè)定濃度變化，結(jié)果表明，7種青霉素類衍生物在室溫下至少可保存6 h，在4℃至少可保存48 h，在-20℃至少可保存6 d。

2.3 方法專屬性考察

以β-內(nèi)酰胺類抗生素（頭孢曲松和羧芐西林）和喹諾酮類抗生素（氧氟沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星）作為青霉素類藥物檢測(cè)的干擾物質(zhì)，考察方法的專屬性。7種青霉素類藥物以及干擾物質(zhì)經(jīng)衍生化后的標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見(jiàn)圖1，以上兩類干擾物質(zhì)均能與目標(biāo)化合物有效分離。取空白飼料樣品，加入7種青霉素類藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液（添加濃度為1.25 μg/mL）以及兩類干擾物質(zhì)（添加濃度為2.5 μg/mL）進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，結(jié)果表明，青霉素類藥物目標(biāo)峰附近無(wú)干擾峰出現(xiàn)，目標(biāo)化合物加標(biāo)回收率無(wú)明顯區(qū)別，能達(dá)到檢測(cè)要求，該方法專屬性較好。

2.4 線性范圍、檢出限與定量下限

按照1.3制備基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液衍生物，對(duì)于配合飼料、濃縮飼料和精料補(bǔ)充料使其濃度為0.25、0.375、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00 μg/mL，對(duì)于添加劑預(yù)混料使其濃度為0.1、0.25、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00 μg/mL。在優(yōu)化試驗(yàn)條件下，以青霉素類藥物衍生物的峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明：配合飼料、濃縮飼料和精料補(bǔ)充料中7種青霉素類藥物在0.25～10 μg/mL范圍內(nèi)，添加劑預(yù)混合飼料中7種青霉素類藥物在0.10～10 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r2）均在0.99以上。在空白飼料中添加青霉素類藥物標(biāo)準(zhǔn)品，按優(yōu)化方法進(jìn)行檢測(cè)，以信噪比S/N≥3計(jì)算方法的檢出限（LOD）；以S/N≥10計(jì)算方法的定量限（LOQ）。結(jié)果測(cè)得7種青霉素類藥物在配合飼料、濃縮飼料、精料補(bǔ)充料中的檢出限為2.5 mg/kg，定量限為5.0 mg/kg；在添加劑預(yù)混合飼料中的LOD為1.0 mg/kg，LOD為2.0 mg/kg。7種青霉素類藥物在4種飼料中定量添加濃度水平的信噪比見(jiàn)表1。

2.5 添加回收和精密度實(shí)驗(yàn)

分別選取空白配合飼料、濃縮料、精料補(bǔ)充料添加5、10、25 mg/kg 3個(gè)不同濃度，空白添加劑預(yù)混料添加2、5、10、25 mg/kg 4個(gè)不同濃度進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，各濃度5個(gè)平行樣品進(jìn)行三批次測(cè)定，結(jié)果表明，7種青霉素類藥物批內(nèi)平均添加回收率在69.6%～103.9%，3批次總平均添加回收率在70.6%～98.4%范圍，批內(nèi)及批間RSD均＜15%。4種飼料中7種青霉素類藥物3批次總平均添加回收率和批間RSD值見(jiàn)表2。青霉素類藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.5 μg/mL）、空白配合飼料、空白添加劑預(yù)混合飼料、空白精料補(bǔ)充料、空白濃縮料及其添加青霉素類藥物標(biāo)準(zhǔn)品（添加劑預(yù)混料添加濃度為2 mg/kg，其他飼料添加濃度為5 mg/kg）的液相色譜圖見(jiàn)圖2。

表1 7種青霉素類藥物在4種飼料中定量限添加濃度水平的信噪比Table 1 S/N of seven penicillins in four feeds at the level of limit of quantitation additive concentration

表2 4種飼料中7種青霉素類藥物的總平均添加回收率和批間變異系數(shù)Table2 Total average recovery rates and coefficient of variation among batches of seven penicillins in four feeds

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定

隨機(jī)抽取40批配合飼料、濃縮飼料、精料補(bǔ)充料和添加劑預(yù)混合飼料，用上述確立的方法進(jìn)行測(cè)定，阿莫西林、青霉素G、青霉素V、氨芐西林、苯唑西林、氯唑西林和雙氯西林均未檢出。

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

本研究選擇將青霉素類藥物通過(guò)衍生化生成特異性的青霉酸硫醇汞鹽，在325 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè)。由于多數(shù)青霉素類化合物無(wú)專一的紫外吸收?qǐng)F(tuán)，其最大吸收值一般都在200～235 nm之間，而樣品基質(zhì)在此紫外吸收區(qū)域存在很高的背景干擾，另外青霉素類藥物的穩(wěn)定性也很差［22］。參考農(nóng)業(yè)部781號(hào)公告-11-2006《牛奶中青霉素類藥物殘留量的測(cè)定 高效液相色譜法》及其他相關(guān)文獻(xiàn)［10-16］，先采用苯甲酸酐溶液將阿莫西林和氨芐西林的氨基發(fā)生?；磻?yīng)，再利用青霉素類藥物的β-內(nèi)酰胺在1,2,4-三氮唑作用下發(fā)生開(kāi)環(huán)反應(yīng)并與三氮唑結(jié)合，最后與氯化汞作用生成特異性的青霉酸硫醇汞鹽，其最大紫外吸收波長(zhǎng)為325 nm。通過(guò)衍生化反應(yīng)大大減少了基質(zhì)對(duì)目標(biāo)峰的干擾，從而提高了檢測(cè)方法的靈敏度和專屬性。

3.2 樣品提取劑的選擇

對(duì)于配合飼料、濃縮飼料和精料補(bǔ)充料，采用20%乙腈水溶液作為提取劑時(shí)，目標(biāo)化合物的回收率高，雜質(zhì)干擾小。而對(duì)于添加劑預(yù)混合飼料，在用20%乙腈水溶液提取時(shí)，目標(biāo)化合物阿莫西林和氨芐西林的回收率近乎為零，其他5種藥物回收率也無(wú)法滿足要求，推測(cè)添加劑預(yù)混合飼料中的重金屬、吸附劑等物質(zhì)會(huì)影響青霉素類藥物的提取率以及穩(wěn)定性。采用EDTA-Mcllvaine緩沖溶液（pH=8.0）作為提取液時(shí)各藥物回收率有顯著提高。這可能與EDTA與添加劑預(yù)混合飼料中的金屬離子形成絡(luò)合物，從而改善提取與凈化效果有關(guān)。然而，當(dāng)提取液直接進(jìn)行衍生化時(shí)，目標(biāo)化合物的回收率仍為零，推測(cè)青霉素類藥物在水相中衍生化過(guò)程發(fā)生了降解；當(dāng)添加一定比例的乙腈，預(yù)期達(dá)到穩(wěn)定目標(biāo)化合物的目的時(shí)，由于提取液中鹽含量較高，乙腈與水相發(fā)生了分層現(xiàn)象。因此，我們通過(guò)HLB固相萃取小柱將提取液切換成乙腈溶液，提高目標(biāo)化合物在衍生化過(guò)程中的穩(wěn)定性，從而達(dá)到檢測(cè)要求。

4 結(jié)論

本研究建立了飼料中阿莫西林、氨芐西林、青霉素G、青霉素V、苯唑西林、氯唑西林、雙氯西林7種青霉素藥物含量的柱前衍生高效液相色譜方法。配合飼料、濃縮飼料、精料補(bǔ)充料的檢測(cè)限為2.5 mg/kg，定量限為5 mg/kg；添加劑預(yù)混合飼料的檢測(cè)限為1.0 mg/kg，定量限為2.0 mg/kg；7種青霉素類藥物線性關(guān)系良好，平均加標(biāo)回收率在69.6%～103.9%范圍。該方法快速、準(zhǔn)確、專屬性及重現(xiàn)性好，適合日常飼料樣品中7種青霉素類藥物含量的測(cè)定。