昆蟲病原真菌基因組學(xué)及多組學(xué)研究進(jìn)展

宋曉兵，彭埃天，凌金鋒，陳 霞，崔一平

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640）

昆蟲病原真菌廣泛存在于自然界中，是害蟲的自然天敵之一，由真菌侵染引起的昆蟲疾病約占60%［1］。昆蟲病原真菌種類資源豐富，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了1 000多種昆蟲病原真菌［2］，是微生物殺蟲劑的重要材料來源。生物控制是一種防治農(nóng)業(yè)害蟲的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)友好方法［3-4］，利用昆蟲病原真菌防治害蟲具有不易產(chǎn)生抗性、易造成昆蟲病害流行、生態(tài)安全環(huán)保等優(yōu)勢［5-6］，在今后的農(nóng)業(yè)害蟲防治中具有良好的應(yīng)用前景［7-8］。

基因組學(xué)是研究生物基因組的組成、結(jié)構(gòu)、相互關(guān)系、表達(dá)調(diào)控，以及對(duì)全基因進(jìn)行集體表征、定量分析及不同基因組比較研究的一門交叉生物學(xué)學(xué)科，基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)以及代謝組學(xué)等共同構(gòu)成系統(tǒng)生物學(xué)的組學(xué)基礎(chǔ)。測序技術(shù)的快速發(fā)展促進(jìn)了真菌基因組學(xué)的研究，通過基因組測序針對(duì)特定屬種的多基因組測序比較分析，獲得進(jìn)化過程中與真菌次級(jí)代謝合成相關(guān)的重要基因、蛋白質(zhì)家族等，進(jìn)而為真菌的形態(tài)差異、致病性差異、環(huán)境適應(yīng)性等提供遺傳依據(jù)［9-10］。昆蟲病原真菌是與宿主相互作用的真菌，不同真菌的寄主范圍不同、致病力也存在顯著差異。已完成的球孢白僵菌（Beauveria bassiana）、金龜子綠僵菌（Metarhizium anisopliae）、蝗綠僵菌（Metarhizium acridum）、冬蟲夏草菌（Ophiocordyceps sinensis）和蛹蟲草菌（Cordyceps militaris）等典型昆蟲病原真菌的全基因組測序，加速了涉及關(guān)鍵基因功能、真菌致病機(jī)制、宿主與病原體互作以及涉及真菌繁殖的深入研究［11］。

本文綜述了昆蟲病原真菌基因組學(xué)的最新研究進(jìn)展，涵蓋利用基因組學(xué)及多組學(xué)聯(lián)合揭示昆蟲病原真菌的種內(nèi)或物種間的進(jìn)化，以及寄主范圍改變、侵染機(jī)理、免疫機(jī)制、代謝產(chǎn)物等方面，期望能為今后農(nóng)業(yè)害蟲生物控制的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 基因測序技術(shù)

1.1 測序技術(shù)概述

目前，DNA測序已經(jīng)從第一代測序技術(shù)發(fā)展到第三代測序技術(shù)。1977年Maxam和Gilbert發(fā)明了化學(xué)降解法［12］，同年Sanger法即雙脫氧終止法（Chain Termination Method）標(biāo)志第一代測序技術(shù)的誕生［13］。Sanger測序技術(shù)因操作簡便、準(zhǔn)確率高和較長讀長的優(yōu)勢而被廣泛應(yīng)用，基于該技術(shù)完成了人類的基因組測序［14］。

第一代測序技術(shù)速度快，但單次僅能測一條序列，測序讀長在1 000～1 500 bp，測序成本高、通量低，不能夠應(yīng)用于大規(guī)模的基因測序［15］。20世紀(jì)90年代中后期，第二代測序（Nextgeneration sequencing，NGS）技術(shù)出現(xiàn)，主要解決了第一代測序通量低的問題，可以同時(shí)對(duì)多達(dá)幾百萬條的DNA序列進(jìn)行測定，也被稱為高通量測序技術(shù)［16］。二代測序平臺(tái)主要有Roche公司的454、Illumina公司的Solexa和Hiseq、ABI公司的Solid、華大基因的BGISEQ等［17］。

二代測序技術(shù)通量高，但測序讀長較短，測序片段限制在250～300 bp，某些序列可能無法被大量擴(kuò)增，造成信息的丟失。目前第三代測序技術(shù)方興未艾，通過單分子水平讀取核苷酸序列，因此也被稱為單分子測序技術(shù)。當(dāng)前主流的第三代測序技術(shù)主要有HeliScope公司的SMS、PacBio公司的SMRT、Oxford公司的Nanopore、VisiGen公司的FRET。第三代測序技術(shù)無需PCR富集序列，直接測序的測序長度高達(dá)10 kb。三代測序技術(shù)直接對(duì)RNA分子測序，大幅度降低體外逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的系統(tǒng)誤差；直接檢測甲基化的DNA序列，為表觀遺傳學(xué)研究提供了有力手段；對(duì)特定序列的單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）檢測，測定稀有突變及其頻率等［18］。

1.2 基因組測序

基于基因組測序技術(shù)的飛速發(fā)展，已有1 500種以上的真菌獲得了全基因組序列［19］。以大規(guī)模測序?yàn)榛A(chǔ)的群體基因組學(xué)，逐漸應(yīng)用于解析真菌的物種形成、種群分化、群體結(jié)構(gòu)和位點(diǎn)特異性效應(yīng)。全基因組調(diào)查（Genome survey）提供了解決昆蟲病原真菌的生物學(xué)問題及其與宿主相互作用的復(fù)雜機(jī)制的新策略［20］。許多昆蟲致病真菌如球孢白僵菌、金龜子綠僵菌、蝗綠僵菌、冬蟲夏草菌、蛹蟲草菌等已成功完成基因組測序［21-24］，本團(tuán)隊(duì)利用Nanopore和Illumina平臺(tái)已完成了球孢白僵菌QB-28（GenBank登錄號(hào)：JADBGJ000000000）和宛氏擬青霉WS-11（GenBank登錄號(hào)：JACXGS000000000）兩株對(duì)柑橘木虱高致病性真菌的全基因組測序和全基因組調(diào)查。基因組測序技術(shù)的發(fā)展推動(dòng)了真菌鑒定、起源、進(jìn)化、不同的生活方式和宿主選擇、真菌病毒的鑒定等研究，促進(jìn)了后續(xù)的功能基因組、系統(tǒng)發(fā)育基因組和比較基因組的研究，對(duì)研究真菌的生長發(fā)育、功能調(diào)控和致病機(jī)制提供了大量的生物信息和遺傳信息數(shù)據(jù)。

利用Roche 454系統(tǒng)和Illumina雙端測序球孢白僵菌ARSEF2860，獲得了76.6倍覆蓋度的基因組測序數(shù)據(jù)，組裝的總基因組數(shù)據(jù)33.7 Mb，基因組預(yù)計(jì)編碼10 366個(gè)蛋白質(zhì)基因，通過基因注釋從7 283個(gè)預(yù)測蛋白中分析鑒定出3 002個(gè)蛋白質(zhì)家族；研究表明球孢白僵菌基因組中包含更多的細(xì)菌樣毒素（Bacterial-like toxins），以及更多的物種特異毒力基因，例如編碼一類小型富含半胱氨酸的分泌蛋白基因（SSCps）；與植物病原真菌相比，球孢白僵菌具有特殊的表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子（TFs），可用于調(diào)控和激活特定基因，以適應(yīng)不同的昆蟲宿主［23］?；邙B槍法測序蛹蟲草菌Cm01，獲得了147倍覆蓋度的基因組測序數(shù)據(jù)，組裝的總基因組數(shù)據(jù)32.2 Mb，基因組預(yù)計(jì)編碼9 684個(gè)蛋白質(zhì)基因，InterproScan分析鑒定了2 736個(gè)保守蛋白家族（包含6 725個(gè)蛋白），大約16%的預(yù)測基因被推定參與病原體與宿主的相互作用；蛹蟲草菌中蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、脂肪酶和蛋白激酶的基因家族膨脹，而糖苷水解酶和果膠裂解酶則發(fā)生了基因家族收縮［22］?；蚪M測序還可用于真菌病毒研究，使用Illumina HiSeq 2500系統(tǒng)對(duì)球孢白僵菌RCEF5853進(jìn)行宏基因組測序，發(fā)現(xiàn)了一種新的雙鏈RNA病毒，球孢白僵 菌Partitivirus 3（BbPV-3），BbPV-3的CP、RdRp序列同源性以及RdRp結(jié)構(gòu)域系統(tǒng)發(fā)育分析顯示其是Epsilonpartitivirus屬的新成員［25］。

2 基因組學(xué)研究

2.1 系統(tǒng)發(fā)育基因組學(xué)

系統(tǒng)發(fā)育基因組學(xué)是系統(tǒng)發(fā)育學(xué)與基因組學(xué)相融合的交叉學(xué)科，通過分析基因組水平的大規(guī)模分子數(shù)據(jù)來闡釋真菌譜系及其性狀進(jìn)化、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。簡化基因組測序（Reducedrepresentation sequencing）和目標(biāo)序列捕獲技術(shù)（Target sequence capture）是系統(tǒng)發(fā)育基因組學(xué)研究獲取數(shù)據(jù)的兩個(gè)主要技術(shù)手段［26］，而超級(jí)矩陣法（Supermatrix approach）和物種樹分析（Species-tree approach）是系統(tǒng)發(fā)育分析進(jìn)行進(jìn)化樹重建的兩類主要方法［27-28］。

基于蛹蟲草菌Cm01子實(shí)體發(fā)育的基因組測序，發(fā)現(xiàn)該菌的有性生殖是異宗配合的，是第一個(gè)被報(bào)道的無需不同交配型的配對(duì)也能產(chǎn)生有性子實(shí)體的子囊菌［22］。球孢白僵菌種系基因組分析證實(shí)，子囊菌對(duì)昆蟲的致病性是多元化的，而且具有趨同進(jìn)化的趨勢，伴隨多個(gè)物種?；缘亩玖蛞约芭c寄主范圍和致病策略相關(guān)的基因家族的擴(kuò)張和收縮［23］。系統(tǒng)發(fā)育基因組學(xué)分析球孢白僵菌和蛹蟲草菌，表明真菌昆蟲致病性是在距今2億年的三疊紀(jì)-侏羅紀(jì)界線時(shí)期演化而來的，而蟲草譜系的出現(xiàn)早于綠僵菌譜系1.3億年［22-23］。基因組測序分析表明，冬蟲夏草菌Co18基因組中包含兩個(gè)親和性交配型基因，并且具有自我繁殖力，可以獨(dú)立完成性循環(huán)；基因結(jié)構(gòu)的變化表明，冬蟲夏草菌具有早期潛伏侵染寄主幼蟲以及后期致死成熟幼蟲的雙重致病機(jī)制；假定蛋白分析表明，冬蟲夏草菌可能通過抗凍蛋白和增加脂質(zhì)積累和脂肪酸不飽和度的機(jī)制使其適應(yīng)極端寒冷［24］。

2.2 比較基因組學(xué)

比較基因組學(xué)以基因組圖譜和測序?yàn)榛A(chǔ)，對(duì)已知的基因和基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析比較，從而全面了解基因的功能、表達(dá)機(jī)制和物種進(jìn)化。比較基因組學(xué)可以更好地解析病原真菌的起源進(jìn)化、物種形成、寄主追蹤以及寄主跳轉(zhuǎn)［29］。通過近緣真菌或同種真菌不同生理小種之間的基因組對(duì)比研究，解析近緣真菌的細(xì)微區(qū)別，包括致病性、次級(jí)代謝模式或其他特性，闡釋真菌在基因進(jìn)化過程中的分離、內(nèi)含子的獲得或丟失以及不同生境對(duì)基因進(jìn)化的影響。

基于金龜子綠僵菌和蝗綠僵菌的全基因組比較分析表明，兩者的基因組結(jié)構(gòu)高度同源，前者基因組編碼有更多的不同蛋白基因，含有大量的轉(zhuǎn)座子基因以及丟失重復(fù)引起點(diǎn)突變的防御功能基因，加快基因組進(jìn)化以適應(yīng)感染不同種類的昆蟲宿主；推測綠僵菌由植物內(nèi)生真菌或病原真菌進(jìn)化而來，與植物病原真菌及其他絲狀真菌相比，昆蟲病原真菌基因組中的蛋白酶、幾丁質(zhì)酶及脂酶等用于昆蟲體壁降解的基因家族存在顯著的擴(kuò)張現(xiàn)象；相比其他真菌，兩者具有更大比例的編碼分泌蛋白的基因，其中高達(dá)30%的同源物功能尚未鑒定，昆蟲與病原菌的互作機(jī)制需要進(jìn)一步研究［21］。通過比較分析7種綠僵菌的基因組信息，表明綠僵菌由?；跃?jīng)由中間型過渡物種向廣譜菌方向演化，與宿主表現(xiàn)協(xié)同進(jìn)化的特性，期間伴隨著基因及蛋白家族擴(kuò)張、基因組結(jié)構(gòu)及生殖類型變化等；研究表明綠僵菌的泛基因組是開放式的，預(yù)測不斷會(huì)有新的物種形成［30-31］。

球孢白僵菌JEF-007與其他分離株基因組的比較分析表明，JEF-007與ARSEF2860具有高度同源性，共有232個(gè)基因具有100%的同源性，3 362個(gè)基因具有90%～100%的同源性；而參與致病過程的基因，如幾丁質(zhì)酶（Chitinases）和胰蛋白酶樣蛋白（Trypsin-like protease）基因，在JEF-007中是高度保守的，而其他基因在同一物種中出現(xiàn)明顯的序列變異，基因組的差異可能導(dǎo)致不同的形態(tài)表型和生物學(xué)功能［32］。淡紫擬青霉菌株P(guān)LBJ-1和PLFJ-1的基因組比較分析表明，PLBJ-1基因組中88.12%的序列與PLFJ-1基因組中88.60%的序列具有很好的共線性關(guān)系，與其他真菌的重復(fù)序列分別為6.07%和6.00%；對(duì)淡紫擬青霉兩個(gè)菌株的主要蛋白家族進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)兩者均具有較多的水解酶類、蛋白酶類和致病相關(guān)蛋白等家族的合成基因；單拷貝同源蛋白重建的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，昆蟲致病菌與線蟲致病菌可能具有共同的祖先［33］。比較冬蟲夏草菌與肉座菌目其他真菌線粒體基因組發(fā)現(xiàn)，PcG（polycomb group）基因和rRNA基因排列順序、數(shù)目基本一致；基于線粒體基因系譜的分析，傳統(tǒng)的蟲草類真菌可劃分成不同的科屬［34］。

3 多組學(xué)研究

3.1 轉(zhuǎn)錄組學(xué)

轉(zhuǎn)錄組學(xué)是在特定環(huán)境下，或者在不同細(xì)胞類型、器官中研究所有基因轉(zhuǎn)錄水平的方法。轉(zhuǎn)錄組分析是研究基因功能及結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，也是發(fā)掘功能基因的重要途徑之一，對(duì)昆蟲病原真菌關(guān)鍵時(shí)期中重要的基因進(jìn)行篩選研究，能更快的找出新的生長基因、致病基因、調(diào)控基因等相關(guān)信息，揭示其生長發(fā)育、侵染、定殖等作用機(jī)制。

本團(tuán)隊(duì)利用Illumina Miseq測序技術(shù)對(duì)感染球孢白僵菌24、48、72 h以及健康的柑橘木虱進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，在CK vs.S24h、CK vs.S48h和CK vs.S72h三個(gè)轉(zhuǎn)錄組里分別獲得了971、1 671、752個(gè)顯著差異表達(dá)基因（DEGs），差異表達(dá)基因主要富集在能量代謝、離子運(yùn)輸、轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控、生殖和發(fā)育調(diào)控以及免疫防御反應(yīng)等相關(guān)通路；通過基因序列比對(duì)、結(jié)構(gòu)域分析、系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建等生物信息學(xué)方法，共篩選鑒定出柑橘木虱80個(gè)免疫相關(guān)基因，為篩選球孢白僵菌侵染昆蟲的重要靶標(biāo)基因以及柑橘木虱生物學(xué)途徑的關(guān)鍵基因提供了豐富的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)［35］。基于轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)解析健康小菜蛾及感染球孢白僵菌48 h小菜蛾的基因表達(dá)差異，獲得15 542個(gè)表達(dá)差異基因，其中顯著差異表達(dá)基因2 434個(gè)；KEGG pathway分析表明差異基因主要富集在核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工以及半乳糖、酪氨酸代謝等免疫相關(guān)通路，而肽聚糖識(shí)別蛋白、酚氧化酶、絲氨酸蛋白酶等基因在寄主的免疫應(yīng)答過程中起了重要的作用［36］。通過轉(zhuǎn)錄組測序比較體外共生藍(lán)變菌Sporothrixsp.1和球孢白僵菌感染松墨天牛蛹所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)，分析表明松墨天牛對(duì)兩種真菌的免疫應(yīng)答方式具有顯著性差異，球孢白僵菌感染48 h后松墨天牛的差異表達(dá)基因數(shù)量是藍(lán)變菌感染的2倍；藍(lán)變菌感染松墨天牛過程中Toll和IMD信號(hào)通路起主導(dǎo)作用，而球孢白僵菌感染松墨天牛過程中，只有Toll信號(hào)通路上調(diào)表達(dá)［37］。

綠僵菌和蝗綠僵菌的高通量轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析中，涉及宿主識(shí)別、附著胞分化和侵染性的基因和途徑在早期感染過程中表現(xiàn)出差異表達(dá)，可能是影響真菌宿主特異性的因子；不同寄主體壁信號(hào)誘導(dǎo)下，兩者表達(dá)不同信號(hào)識(shí)別蛋白，誘導(dǎo)下游的MAPK和PKA的信號(hào)強(qiáng)度不同，從而精確調(diào)控細(xì)胞分化，決定了不同綠僵菌的寄主范圍［21］。利用RNA-seq技術(shù)對(duì)羅伯茨綠僵菌ARSEF23在生長發(fā)育、逆境脅迫、侵染定殖以及退化條件下的轉(zhuǎn)錄組測序，對(duì)比參考基因組中已有的轉(zhuǎn)錄本，共獲得769個(gè)新轉(zhuǎn)錄本，其中77個(gè)為可編碼的新轉(zhuǎn)錄本，并從注釋的新轉(zhuǎn)錄本中篩選到抗逆相關(guān)基因—小泛素相關(guān)修飾基因（SUMO）［38］。統(tǒng)計(jì)學(xué)及生物信息學(xué)等多重方法分析羅伯茨綠僵菌ARSEF23中可變剪接基因的表達(dá)差異，鑒定出可變剪接事件數(shù)10 471個(gè)，相關(guān)參與基因5 005個(gè)；KEGG通路富集分析顯示，擁有較多變體mRNA的基因顯著富集于MAPK信號(hào)通路及泛素介導(dǎo)的蛋白水解酶通路［39］。

通過比較轉(zhuǎn)錄組的方法，對(duì)綠僵菌侵染東亞飛蝗的血細(xì)胞與脂肪體的免疫應(yīng)答進(jìn)行分析表明，脂肪體的免疫應(yīng)答主要通過激活先天性免疫相關(guān)的基因、與能量代謝和發(fā)育相關(guān)的基因，血細(xì)胞的免疫應(yīng)答主要通過調(diào)控與膜調(diào)控相關(guān)的基因、激活細(xì)胞免疫應(yīng)答和釋放體液免疫因子［40］。飼喂飛蝗含綠僵菌及胞外蛋白酶抑制劑（TPCK）的餌劑，對(duì)飛蝗中腸樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析顯示，上調(diào)的差異基因主要與飛蝗的生長、發(fā)育相關(guān)，下調(diào)的基因富集到與飛蝗先天性免疫反應(yīng)途徑密切相關(guān)的PI3K/Akt信號(hào)途徑；胞外蛋白酶誘導(dǎo)的免疫相關(guān)基因防御素（Defensin）、防御蛋白（Hdd11）、表面抗原蛋白、Takeout蛋白等上調(diào)表達(dá)，推測胞外蛋白酶在飛蝗免疫反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用［41］。通過比較對(duì)宿主的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）是一個(gè)關(guān)鍵信號(hào)受體，在宿主識(shí)別階段廣泛地被昆蟲病原菌所共有，并在羅伯茨綠僵菌、綠僵菌和球孢白僵菌中被上調(diào)［21,23］。通過調(diào)節(jié)3%～12%效應(yīng)子基因在不同脅迫條件下的差異表達(dá)，分析與Hog1相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子Msn2的功能和轉(zhuǎn)錄組信息，明確其對(duì)球孢白僵菌和羅伯茨綠僵菌的分生孢子形成、滲透抗性、抗氧化能力、UV-B抗性、耐熱性和毒力具有顯著作用，同時(shí)揭示了兩種真菌之間獨(dú)特的熱響應(yīng)機(jī)制［42］。

3.2 蛋白組學(xué)

蛋白質(zhì)組學(xué)是一種直接針對(duì)基因組圖譜進(jìn)行比對(duì)的技術(shù)，轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)與蛋白質(zhì)基因組學(xué)的結(jié)合可以用于發(fā)現(xiàn)并鑒定新的基因［43］。昆蟲病原真菌通過侵染菌絲或者附著胞等結(jié)構(gòu)將效應(yīng)蛋白分泌到寄主細(xì)胞中或者細(xì)胞間質(zhì)中［44］，例如球孢白僵菌通過效應(yīng)子LysM破壞昆蟲的免疫反應(yīng)而引起侵染［45］。

分析鑒定昆蟲病原真菌在侵染過程中與寄主之間互作的效應(yīng)蛋白質(zhì)，對(duì)研究其在侵染致病過程中起到的關(guān)鍵作用具有重要意義。利用生物信息學(xué)和預(yù)測軟件從球孢白僵菌10 364個(gè)蛋白序列中預(yù)測到940個(gè)分泌蛋白，其中185個(gè)為碳水化合物活性酶家族蛋白；將分泌蛋白與胞外酶數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)分析篩選，得到18個(gè)候選效應(yīng)子，包括11個(gè)功能未知的推定蛋白，其余為胞外蛋白、幾丁質(zhì)酶蛋白、細(xì)胞壁蛋白等［46］?；诒容^轉(zhuǎn)錄組學(xué)和孢外粘液蛋白表達(dá)譜的聯(lián)合分析，從鹿兒島被毛孢的野生型孢外粘液中鑒定出474個(gè)蛋白，包含7個(gè)與黏附相關(guān)蛋白、13個(gè)與寄主體壁降解相關(guān)酶類、9個(gè)直接參與防御相關(guān)的蛋白以及2個(gè)昆蟲激素代謝相關(guān)酶，鹿兒島被毛孢中分泌蛋白、昆蟲激素代謝類基因和凝集素類蛋白共同參與應(yīng)答過程［47］。

病原真菌侵染昆蟲需要穿透富含幾丁質(zhì)的表皮，利用宿主組織作為營養(yǎng)資源，需要分泌大量降解酶作為致病因子。羅伯茨綠僵菌和蝗綠僵菌分泌較多的蛋白酶的基因，分別為132、104個(gè)［21］。羅伯茨綠僵菌、蝗綠僵菌和球孢白僵菌擁有的糖苷水解酶的數(shù)量接近植物病原性真菌的平均值150個(gè)［21,23］，而冬蟲夏草菌只有66個(gè)糖苷水解酶，并且缺少專門用于降解植物組織的酶［24］。

3.3 代謝組學(xué)

代謝組學(xué)是對(duì)一定條件下生物體內(nèi)初級(jí)和次級(jí)代謝產(chǎn)物的定性及定量，從而揭示生命現(xiàn)象及其內(nèi)在規(guī)律的學(xué)科，可以直接動(dòng)態(tài)地反映出細(xì)胞的生理生化過程，從而有效地檢測和發(fā)現(xiàn)特定的生化途徑，準(zhǔn)確地解釋生理或者病理現(xiàn)象［48］。代謝組學(xué)可以有效闡釋真菌生物生態(tài)系統(tǒng)中各種復(fù)雜的相互作用，以及真菌對(duì)環(huán)境和基因變化的響應(yīng)。

次生代謝產(chǎn)物參與真菌與其宿主害蟲之間的相互作用，可能是真菌致病的毒素，也可能是可以藥用的多肽類物質(zhì)［44,49］。真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成受到多種方式的調(diào)控，包括發(fā)育調(diào)控、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控、全局調(diào)控因子調(diào)控等，合成基因與調(diào)控基因通常成簇出現(xiàn)，有利于通過遺傳操作對(duì)次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成進(jìn)行調(diào)控。代謝組學(xué)能快速鑒定不同菌株代謝物的區(qū)別找到標(biāo)志代謝物，促使真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因的鑒定快速發(fā)展，未來可能成為一種新型分類鑒定方法。

在絲狀真菌中，代謝相關(guān)基因一般是以基因簇（Genes clusters）的形式分布，相對(duì)于綠僵菌和植物病原菌，蛹蟲草菌的次生代謝產(chǎn)物相關(guān)的核心基因較少，相比綠僵菌，蛹蟲草菌的萜類合成酶、聚酮化合物合酶（PKS）和非核糖體肽合酶（NRPS）基因較少；對(duì)冬蟲夏草菌PKS和PKS樣基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)蛹蟲草菌的蛋白與已知真菌毒素的PKS分為不同的簇［50］。蟲草素、白僵菌素、卵孢白僵菌素、白僵菌酮、卵孢霉素和綠僵菌素已經(jīng)被鑒定出來，涉及其生物合成的基因簇在基因組測序之前鮮為人知［51-54］。真菌毒素的合成路徑及其調(diào)控機(jī)制、產(chǎn)毒真菌與昆蟲互作、侵染致病的機(jī)理提供了新的思路。真菌毒素合成主要通過聚酮化合物（PKS）代謝、非核糖體多肽（NRP）合成、PKS-NRP混合代謝、萜類化合物代謝、氨基酸相關(guān)代謝［55］。鑒定出羅伯茨綠僵菌43個(gè)與次生代謝產(chǎn)物相關(guān)的假定核心基因，而蝗綠僵菌有20個(gè)［21］。綠僵菌素基因簇的富足或缺失與宿主特異性密切相關(guān)［56］?；贖PLC-MS的代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)昆蟲病原真菌、食用菌以及植物病原真菌菌絲體的甲醇和乙酸乙酯混合提取物進(jìn)行代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)白僵菌、綠僵菌和棒束孢特有的化合物可能是蟲生真菌長期協(xié)同進(jìn)化所產(chǎn)生的特有產(chǎn)物［57］。

4 展望

國際生物基因組學(xué)會(huì)議于2017年提出“地球生物基因組計(jì)劃”，計(jì)劃未來10年對(duì)地球上所有已知的真核生物進(jìn)行基因組測序［26］?；蚪M測序推動(dòng)昆蟲病原真菌毒素基因鑒定、昆蟲—真菌分子相互作用及遺傳改造、提高真菌殺蟲劑的應(yīng)用效率等基礎(chǔ)及應(yīng)用研究?；谡婢蚪M學(xué)，對(duì)昆蟲致病性真菌的生物學(xué)有了更全面的了解，包括起源和進(jìn)化、真菌與昆蟲的相互作用機(jī)制、宿主特異性和次生代謝產(chǎn)物?；虻墓δ苎芯坎粌H促進(jìn)了對(duì)真菌致病機(jī)理和多應(yīng)激反應(yīng)所涉及的分子機(jī)制的理解，而且還提供了進(jìn)行遺傳操作以提高性能的靶基因，有助于生物殺蟲劑的改良和研發(fā)。

基于基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)和表型組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行多組學(xué)的整合分析，能夠更全面、深層次和精確地闡釋復(fù)雜性狀形成的分子機(jī)制和調(diào)控機(jī)理，對(duì)生物過程進(jìn)行全面深入的解析。三維基因組學(xué)是以研究真核生物核內(nèi)基因組空間構(gòu)象，及其對(duì)不同基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的生物學(xué)效應(yīng)為主要研究內(nèi)容的新興學(xué)科，也是后基因組學(xué)時(shí)代研究的熱門領(lǐng)域之一［58-61］。基因組的三維空間結(jié)構(gòu)對(duì)基因組的表達(dá)、調(diào)控等功能有著重要影響，全基因組的三維空間結(jié)構(gòu)和功能研究將成為昆蟲病原菌基因組學(xué)一個(gè)新的研究方向。