海南辣椒、櫻桃番茄病毒病調(diào)查及病原dot-ELISA鑒定

嚴(yán)婉榮，趙志祥，肖彤斌，張善學(xué)，文香玲，王會(huì)芳

（1.海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，海南 ?？?571100；2.海南正業(yè)中農(nóng)高科股份有限公司，海南 海口 571100）

【研究意義】2018年海南省冬季蔬菜種植面積257 728 hm2,產(chǎn)量566.77萬(wàn)t，其中辣椒種植面積408 96 hm2，產(chǎn)量101.52萬(wàn)t（據(jù)《海南統(tǒng)計(jì)年鑒-2019》），櫻桃番茄種植面積約7 822 hm2，產(chǎn)量28.15萬(wàn)t左右［1］。辣椒大面積種植主要集中在瓊海、澄邁、文昌、臨高等縣市，是供應(yīng)內(nèi)地冬季“菜籃子”的第一大蔬菜品類(lèi)［2］。櫻桃番茄俗稱“圣女果”，重點(diǎn)產(chǎn)區(qū)分布在陵水、定安、東方、昌江等縣市，僅陵水就占全省種植面積的69%。2016年，“陵水圣女果”獲國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局“國(guó)家地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品”認(rèn)證［1］。隨著辣椒和櫻桃番茄多年連作、較高的復(fù)種指數(shù)以及海南優(yōu)越的天氣條件，導(dǎo)致病蟲(chóng)害發(fā)生嚴(yán)重。尤其病毒病在辣椒和櫻桃番茄上普遍發(fā)生，陵水、定安主產(chǎn)區(qū)出現(xiàn)的病毒病對(duì)櫻桃番茄生產(chǎn)造成了毀滅性的影響［3］，使產(chǎn)量和品質(zhì)明顯下降，嚴(yán)重影響了種植效益和農(nóng)戶生產(chǎn)積極性。【前人研究進(jìn)展】國(guó)內(nèi)外報(bào)道的辣椒病毒已有70種以上，我國(guó)報(bào)道的已達(dá)31種［4］，侵染番茄的病毒至少有136種［5］,我國(guó)報(bào)道的已達(dá)34種［4］。海南地區(qū)陸續(xù)也有新病毒發(fā)現(xiàn)，首次在海南辣椒上檢測(cè)到辣椒脈斑駁病毒（Chilli veinal mottle virus,ChiVMV）［6］和甜椒脈斑駁病毒（Pepper veinal mottle virus,PVMV）［7］,首次在海南番茄上發(fā)現(xiàn)了番茄斑駁花葉病毒（Tomato mottle mosaic virus,ToMMV）［8］。在優(yōu)勢(shì)毒源上，姚玉榮等報(bào)道海南辣椒的優(yōu)勢(shì)毒源為黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus,CMV）和辣椒輕斑駁病毒（Pepper mild mottle virus,PMMoV）［9］，嚴(yán)婉榮等［10］檢測(cè)表明辣椒上的優(yōu)勢(shì)毒源為CMV和煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus,TMV），番茄上的優(yōu)勢(shì)毒源為番茄黃花曲葉病毒（Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV）和CMV［10］，除CMV外，辣椒環(huán)斑病毒（Chilli ringspot virus,ChiRSV）、PVMV、ChiVMV 3種病毒已成為海南辣椒上不可忽視的毒源［7］，番茄褪綠病毒（Tomato chlorosis virus,ToCV）［11］和番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus,TSWV）［12］已在云南番茄種植區(qū)大面積發(fā)生，海南地區(qū)應(yīng)引起高度重視和警惕?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】通過(guò)全面系統(tǒng)調(diào)查，明確10個(gè)市縣辣椒和櫻桃番茄病毒病發(fā)生為害情況。通過(guò)dot-ELISA方法，對(duì)CMV、TMV、蕪菁花葉病毒（Turnip mosaic virus,TuMV）、蠶豆萎蔫病毒（Broad bean wilt virus,BBWV）、黃瓜綠斑駁病毒（Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV）進(jìn)行檢測(cè)，明確其變化動(dòng)態(tài)。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】進(jìn)一步明確病毒病的種類(lèi)及侵染情況，為病害的診斷、藥劑的篩選及綜合防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 海南辣椒、櫻桃番茄病毒病發(fā)生、為害程度調(diào)查

2018—2019年，對(duì)?？谑协偵絽^(qū)、澄邁縣永發(fā)鎮(zhèn)、定安縣定城鎮(zhèn)深田村、臨高縣加來(lái)鎮(zhèn)賢郎村，五指山市番陽(yáng)鎮(zhèn)、昌江縣十月田鎮(zhèn)、陵水縣光坡鎮(zhèn)武山村、三亞市吉陽(yáng)區(qū)、瓊海市潭門(mén)鎮(zhèn)福田村和東方市感城鎮(zhèn)10個(gè)市縣的辣椒、櫻桃番茄病毒病發(fā)生情況進(jìn)行了抽樣調(diào)查分析，調(diào)查了不同地點(diǎn)、不同作物時(shí)期病毒病的為害程度。每個(gè)調(diào)查田塊采用五點(diǎn)取樣法，每點(diǎn)取不同方位植株30株，每個(gè)田塊共計(jì)調(diào)查150株，記錄病害發(fā)生株數(shù)，觀察每株的發(fā)病程度，辣椒病情級(jí)數(shù)調(diào)查參照《農(nóng)藥田間藥效試驗(yàn)準(zhǔn)則 第9部分殺菌劑防治辣椒病毒病》（NY/T 1464.9-2007），番茄病情級(jí)數(shù)調(diào)查參照《農(nóng)藥田間藥效試驗(yàn)準(zhǔn)則 第8部分殺菌劑防治番茄病毒病》（NY/T 1464.8-2007）。計(jì)算病毒病田間發(fā)病率和病情指數(shù)，并進(jìn)行癥狀類(lèi)型歸類(lèi)和統(tǒng)計(jì)分析。

1.2 辣椒、櫻桃番茄病毒病dot-ELISA檢測(cè)

1.2.1辣椒、櫻桃番茄樣本采集 在?？谑?、定安縣、臨高縣、陵水縣等市縣采集到辣椒病毒病葉片樣本288份，櫻桃番茄病毒病葉片樣本305份。

1.2.2辣椒、櫻桃番茄樣本dot-ELISA檢測(cè)稱取葉片1 g，加入10 mL 0.01 mol/L PBS研磨，8 000 r/min離心3 min；取2 uL上清點(diǎn)到硝酸纖維素膜（NC膜）上，室溫干燥10 min后將NC膜浸入到100 mL含5%脫脂奶粉的PBST緩沖液中溫室封閉30 min；NC膜放入5%脫脂奶粉1∶5 000倍稀釋的單抗中室溫孵育60 min,PBST洗膜4次,每次3 min；NC膜放入用5%的脫脂奶粉1∶8 000倍稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記羊抗鼠IgG二抗中室溫孵育60 min，PBST洗膜5次，每次5 min,PBS洗膜1次，5 min;用濾紙吸干膜，放入底物顯色液中反應(yīng)5～20 min，清水中漂洗后觀察結(jié)果。底物顯色液：顯色底物NBT 66 uL和 BCIP 33 μL加到10 mL底物緩沖液（0.1 mol/L Tris-Cl、0.1 mol/L NaCl、0.025 mol/L MgCl、pH9.5）中混勻。檢測(cè)對(duì)象包括CMV、TMV、TuMV、BBWV和CGMMV。其中NC膜購(gòu)自Amersham 公司，貨號(hào)RPN303C。Anti-Mouse IgG二抗購(gòu)自Sigma公司，貨號(hào)A3562。顯色底物BCIP/NBT購(gòu)自Promega公司，貨號(hào)S3771。部分一抗和試驗(yàn)方法由浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院謝艷老師提供。每種病毒的陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照購(gòu)自北京萊特生物試劑公司。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒病發(fā)生、為害程度調(diào)查結(jié)果

10個(gè)市縣辣椒和櫻桃番茄病毒病發(fā)病率和病情指數(shù)見(jiàn)表1，調(diào)查結(jié)果顯示：10個(gè)市縣的癥狀類(lèi)型主要以斑駁花葉，頂部葉片皺縮卷曲，黃花及矮縮（叢枝）為主（圖1），斑駁花葉和頂部葉片皺縮卷曲癥狀在田間分布較均勻，植株矮縮斑駁、黃花癥狀多分布在田塊邊緣地區(qū)。在定點(diǎn)調(diào)查的10個(gè)地點(diǎn)中，陵水縣光坡鎮(zhèn)武山村和定安縣定城鎮(zhèn)深田村的櫻桃番茄病毒病發(fā)生情況最為嚴(yán)重，病害發(fā)生率在10%～98%，病情指數(shù)在2.89～40.78，其周邊地區(qū)也有大面積感染病毒病，田間煙粉虱發(fā)生嚴(yán)重，可能是導(dǎo)致病毒大面積爆發(fā)的主要傳毒媒介［13-14］。臨高縣加來(lái)鎮(zhèn)賢郎村和瓊海潭門(mén)鎮(zhèn)福田村的辣椒病毒病發(fā)生也比較嚴(yán)重，病害發(fā)生率在18%～75%，病情指數(shù)在4.44～25.69，田間薊馬爆發(fā)，可能是導(dǎo)致病毒病發(fā)生的主要傳毒媒介［15］，?？诃偵胶蜄|方感城種植的櫻桃番茄和辣椒病毒病發(fā)生均較輕，病害發(fā)生率在3%～15%，病情指數(shù)在0.78～5.22（表1）。藥劑防治結(jié)果均不理想，尤其在櫻桃番茄上，一旦發(fā)生病毒病，傳播速度很快，無(wú)藥可治。不同區(qū)域病毒病發(fā)生情況不同，不同時(shí)間段病情也有差異，前期的調(diào)查發(fā)現(xiàn)從苗期到開(kāi)花期之前病毒病發(fā)生情況較少，只有臨高、瓊海的辣椒和陵水的櫻桃番茄有少量病害發(fā)生，發(fā)病率最高只有3%，開(kāi)花期到掛果期病毒病發(fā)生情況較嚴(yán)重。

表1 辣椒、櫻桃番茄病毒病發(fā)生情況Table 1 The occurrence of pepper and cherry tomato virus diseases

2.2 dot-ELISA檢測(cè)結(jié)果

辣椒樣本288份，來(lái)自?？谑?、澄邁縣、瓊海市、三亞市、五指山市、東方市和臨高縣。CMV、TMV、TuMV、BBWV、CGMMV的檢出率分別為20.14%、7.98%、6.25%、4.17%、2.08%。其中CMV+TMV復(fù)合侵染4份，CMV+TMV+TuMV復(fù)合侵染3份，CMV+TMV+BBWV復(fù)合侵染1份，總體病毒檢出率為37.5%，復(fù)合侵染率為2.08%（表2）。臨高地區(qū)辣椒病毒檢出率最高，達(dá)到41.38%，瓊海地區(qū)檢出率達(dá)到39.73%，東方地區(qū)檢出率最小為21.05%。

櫻桃番茄樣本305份，來(lái)自?？谑?、澄邁縣、定安縣、文昌市、陵水縣。CMV、TMV、TuMV、BBWV、CGMMV的檢出率分別為11.48%、3.94%、3.61%、1.64%、0.66%，其中CMV+TMV復(fù)合侵染2份，CMV+BBWV復(fù)合侵染1份，總體病毒檢出率為20.33%，復(fù)合侵染率為0.98%。定安和陵水地區(qū)的櫻桃番茄病毒檢出率較高，分別達(dá)到25.61%和25.51%，文昌地區(qū)檢出率最低為8.33%，檢測(cè)部分結(jié)果見(jiàn)圖2。在檢測(cè)的5種病毒中，辣椒和櫻桃番茄的優(yōu)勢(shì)毒源均為CMV和TMV。采集的辣椒和櫻桃番茄樣本中，所有樣本均表現(xiàn)出病毒癥狀，但大部分樣本沒(méi)有檢測(cè)到病毒，可能與病毒檢測(cè)種類(lèi)不夠多、檢測(cè)方法及病毒變異有關(guān)。

表2 辣椒、櫻桃番茄dot-ELISA檢測(cè)結(jié)果Table 2 dot-ELISA test results of pepper and cherry tomato

3 討論

在檢測(cè)的5種目標(biāo)病毒中，辣椒和櫻桃番茄的優(yōu)勢(shì)毒源仍為CMV和TMV，與車(chē)海彥等［12］和嚴(yán)婉榮等［10］的檢測(cè)結(jié)果一致。在檢出率上，本研究辣椒和櫻桃番茄中CMV和TMV的檢出率遠(yuǎn)低于車(chē)海彥等［12］和嚴(yán)婉榮等［10］的檢出率。辣椒上BBWV的檢測(cè)情況卻完全相反，2015年檢出率只有0.04%，本次檢測(cè)結(jié)果高達(dá)4.17%。番茄上2015年BBWV的檢出率為2.77%，本次檢測(cè)結(jié)果為1.64%，呈下降趨勢(shì)?？赡芘c檢測(cè)方法、采樣地點(diǎn)及病毒逐年變化有關(guān)。省外地區(qū)，洛陽(yáng)辣椒中CMV的檢出率只有3.03%，番茄CMV的檢出率高達(dá)45.54%［16］，貴州地區(qū)辣椒中CMV、TMV、TuMV、BBWV的檢出率分別為18.58%、4.35%、0.40%、0.79%，番茄中CMV、TMV、TuMV、BBWV的檢出率分別為14.77%、0.57%、1.14%、1.14%，均未檢測(cè)到CGMMV,存在6種類(lèi)型的復(fù)合侵染［17］，除番茄中CMV的檢測(cè)結(jié)果高于本研究的檢測(cè)結(jié)果外，其他病毒的檢測(cè)均低于本研究的檢測(cè)結(jié)果，而且本研究CGMMV在辣椒和番茄中均有檢測(cè)到，為在海南地區(qū)的首次報(bào)道。在優(yōu)勢(shì)病毒上，于海龍等［18］在全國(guó)16個(gè)省市采集辣椒樣本，通過(guò)雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)（DAS-ELISA）對(duì)12種辣椒樣本進(jìn)行檢測(cè)，PMMoV和CMV為優(yōu)勢(shì)毒源，其中海南地區(qū)的7個(gè)樣本中也只檢測(cè)出2份PMMoV和2份CMV。廣西地區(qū)辣椒病毒病的優(yōu)勢(shì)毒源為ChiVMV、PVMV、CMV［19］。湖北地區(qū)茄科蔬菜上毒源復(fù)雜，CMV、番茄花葉病毒（Tomato mosaic virus,ToMV）和BBWV是主要毒源［20］。陳靈芝等檢測(cè)的甘肅辣椒中優(yōu)勢(shì)毒源為T(mén)MV，但未檢測(cè)到CMV［21］。山東辣椒上的優(yōu)勢(shì)毒源為PMMoV、CMV和甜菜西方黃化病毒（Beet western yellows virus，BWYV）［22］，河南省由煙粉虱傳播的TYLCV和ToCV在番茄主栽區(qū)普遍發(fā)生［14］。北京地區(qū)番茄上的優(yōu)勢(shì)毒源為T(mén)YLCV、TMV和CMV［23］。除CMV在全國(guó)各省普遍發(fā)生外，其他種類(lèi)的優(yōu)勢(shì)毒源各有特點(diǎn)，本研究中由于檢測(cè)種類(lèi)的局限性，大部分樣品表現(xiàn)病毒癥狀但并未檢測(cè)到病毒，針對(duì)全國(guó)已報(bào)道的各省優(yōu)勢(shì)毒源，下一步將擴(kuò)大病毒檢測(cè)范圍，除繼續(xù)監(jiān)測(cè)本研究中的幾種病毒外，加大對(duì)辣椒上ChiVMV、PVMV、PMMoV、ChiRSV以及番茄上TYLCV、ToCV、TSWV、ToMV的檢測(cè)。在檢測(cè)方法上，采用小RNA深度測(cè)序和RT-PCR相結(jié)合的技術(shù)繼續(xù)對(duì)海南地區(qū)辣椒和櫻桃番茄病毒發(fā)生情況進(jìn)行跟蹤調(diào)查和全面檢測(cè)，為有效藥劑的研發(fā)與篩選、抗病品種的選育、進(jìn)一步有針對(duì)性防控病毒病提供科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究調(diào)查了海南辣椒和櫻桃番茄病毒病總體發(fā)生情況，明確了辣椒和櫻桃番茄主要種植病毒病發(fā)生率和病情指數(shù)。通過(guò)dot-ELISA方法對(duì)病毒樣本進(jìn)行檢測(cè)，明確了288份辣椒樣本和305份櫻桃番茄樣本中5種病毒病的總體檢出率和復(fù)合侵染率。比較了2015年嚴(yán)婉榮等［10］通過(guò)DAS-ELISA方法和本次通過(guò)dot-ELISA對(duì)CMV、TMV、TuMV、BBWV 4種病毒檢測(cè)結(jié)果的異同。同時(shí)與全國(guó)各省市辣椒和番茄病毒病發(fā)生情況進(jìn)行了比較，明確了海南省與其他省市病毒檢出率、復(fù)合侵染以及優(yōu)勢(shì)毒源的異同。綜上所述，近2年海南省辣椒和和櫻桃番茄主產(chǎn)區(qū)病毒病為害十分嚴(yán)重，病毒種類(lèi)日趨增多，復(fù)合侵染現(xiàn)象日趨嚴(yán)重，病毒的檢測(cè)和優(yōu)勢(shì)毒源的預(yù)測(cè)可更好地為抗病品種的篩選、靶標(biāo)藥劑的研發(fā)及病毒病綜合防控提供策略。