羥基積雪草苷修復輻射誘導的小腸上皮細胞損傷

莫甘，游潔，楊頎

放射性腸損傷（Radiation-induced intestinal injury，RIII）是指放射治療盆腔、腹腔或腹膜后腫瘤所引起的腸道并發(fā)癥，可累及小腸、結腸和直腸［1］。盡管放療技術的進步使放療對靶區(qū)外組織的損傷大大減少，但90% 接受放療患者會出現(xiàn)腹瀉、腹痛、便血等急性癥狀，放射性腸損傷所引起的腸道炎性反應的愈合修復困難，會形成遷延不愈的癥狀［2］。目前國內外對放射性腸損傷的治療手段有限［3］，因此針對放射性腸損傷藥物的開發(fā)是非常必要的。近年來使用藥用植物調節(jié)炎癥為多種疾病的傳統(tǒng)治療策略提供了替代方案［4］。羥基積雪草苷，是傳統(tǒng)藥用植物積雪草提取物三萜皂苷的主要活性成分之一［5］，在積雪草中的含量比其他三萜系化合物成分的都高。已有研究表明，同積雪草一樣，羥基積雪草苷具有抗氧化［6］和抗炎［7］等多種藥理活性作用，然而其對于放射性腸損傷的作用尚不清楚。因此，本研究旨在通過體外實驗探討羥基積雪草苷對放射性腸損傷的治療作用并研究其潛在的作用機制，為羥基積雪草苷應用于臨床解決惡性腫瘤放射治療副作用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

IEC-6細胞購于美國ATCC公司，羥基積雪草苷購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，DMEM（Dulbecco's modified Eagle's medium）、胎牛血清、青霉素／鏈霉素、重組人胰島素和CAT檢測試劑盒均購于Sigma公司，CCK-8試劑盒、MAD檢測試劑盒、Gpx檢測試劑盒均購于上海碧云天生物技術研究所，TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10的ELISA試劑盒購于武漢華美生物公司，SOD檢測試劑盒購于Aabcam。SYBR? Premix Ex TaqTM GC試劑盒購自TaKaRa／寶生物，NLRP3引物和GAPDH引物設計與合成購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 RIII體外細胞模型構建及實驗分組 IEC-6細胞在添加10%胎牛血清、1%青霉素／鏈霉素和0.1 U／mL重組人胰島素的DMEM培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)箱條件設置為37℃、5%CO2。培養(yǎng)基隔天換液，當細胞融合率達到70%～80%時進行傳代培養(yǎng)。參照以往RIII體外模型構建方法［8］，采用直線加速器（Siemens PRIMUS）對IEC-6細胞進行10 Gy劑量的輻射，輻射速度為300 cGy／min。造模成功后，隨機將IEC-6細胞分為三組：正常對照組（Control）、輻射損傷組（IR）、輻射損傷組+治療組（IR+Madecassoside）。每組更換DMEM培養(yǎng)基，其中輻射損傷組+治療組加入羥基積雪草苷。

1.2.2 細胞活性檢測 為了確定后續(xù)實驗中羥基積雪草苷的最有效劑量，將IEC-6細胞在96孔板中以1×104個細胞／孔的密度接種24 h。在10 Gy劑量的輻射后，用無血清的DMEM培養(yǎng)基對IEC-6細胞進行換液，然后添加不同劑量的羥基積雪草苷（0μm／L，0.01μm／L，0.1μm／L，1.0μm／L，2.0μm／L）。干預處理后每個孔加入10μL的CCK-8，在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中再培養(yǎng)1 h，用酶標儀（Thermo Fisher，CA，USA）在450 nm處測定每個孔的吸光度。實驗重復3次。記錄輻射后7 d內的不同劑量處理的細胞活性。

1.2.3 氧化應激指標檢測 通過商業(yè)檢測試劑盒檢測細胞內氧化應激指標的水平，實驗步驟按照各試劑盒的說明書進行檢測。收集輻射處理后1、3、5和7 d的IEC-6細胞培養(yǎng)上清液，使用試劑盒對細胞培養(yǎng)上清液中的丙二醛（MDA）、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（Gpx）的活性進行檢測。

1.2.4 炎癥因子檢測 通過ELISA試劑盒檢測細胞炎癥因子的表達水平，按照試劑盒說明書進行檢測。收集輻射處理后1、3、5和7 d的IEC-6細胞培養(yǎng)上清液，使用ELISA試劑盒對細胞培養(yǎng)上清液中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6 IL-6）和白介素-10（IL-10）水平進行檢測。

1.2.5 RNA提取與實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRTPCR）將處于對數(shù)期的各組細胞進行處理后加入1 mL Trizol試劑提取總RNA，按照試劑盒說明書進行cDNA合成。反轉錄后，以SYBR Green作為熒光標記，GAPDH作為內參對照，在20μL反應體系中加入1μL cDNA。擴增條件為95℃30 s，1個循環(huán)，95℃5 s，60℃30 s，40個循環(huán)，95℃15 s，60℃60 s，1個循環(huán)。2-ΔΔCt法計算mRNA的相對表達量。引物序列如下：GAPDH-Forward（5'-AGGAGCGAGACCCCACT AA CA-3'），GAPDH-Reverse（5'-AGGGGGGCTAAGCAGTTG GT-3'）；NLRP3-Forward（5'-GTGGTGACCCTCTGTGAGGT-3'），NLRP3-Reverse（5'-TCTTCCTGGAGCGCTTCTAA-3'）。

1.2.6 統(tǒng)計學方法 實驗均重復3次，取均值。應用SPSS 21.0和GraphPad Prism 8軟件進行數(shù)據的處理及統(tǒng)計分析。所得結果用平均值（ˉx）±標準偏差（SD）表示，采用二向方差分析（two-way analysis of variance，ANOVA），進行兩組均數(shù)比較。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 羥基積雪草苷提高了輻射IEC-6細胞的細胞活性

輻射后的IEC-6細胞活性顯著下降（圖1，P＜0.05）。用劑量為0μm／L，0.01μm／L，0.1μm／L，1.0μm／L，2.0μm／L的羥基積雪草苷處理輻射IEC-6細胞，發(fā)現(xiàn)羥基積雪草苷不同程度地提高了輻射IEC-6細胞活性（圖1，P＜0.05）。其中1.0μmol／L是提高輻射IEC-6細胞活性的最有效劑量，此濃度將被用于后續(xù)的實驗。

圖1 不同劑量的羥基積雪草苷對輻射IEC-6細胞生長狀態(tài)的影響 輻射后第1、3、5和7天，用CCK-8檢測細胞活性，與空白對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

2.2 羥基積雪草苷可減輕輻射IEC-6細胞的氧化應激反應

為了探索羥基積雪草苷對氧化應激的影響，我們用比色法檢測了培養(yǎng)液中SOD、Gpx、CAT和MDA的表達水平。雖然輻射導致過氧化指標MDA水平的增加，但這種增加被羥基積雪草苷所緩解（圖2，P＜0.05）。此外，與輻射組相比，用羥基積雪草苷處理輻射IEC-6細胞，可顯著提高內源性抗氧化酶（SOD、Gpx和CAT）的活性（圖2A，圖2B，圖2C，P＜0.05）并顯著降低過氧化指標MDA的水平（圖2D，P＜0.05）。這些數(shù)據表明，羥基積雪草苷在輻射IEC-6細胞中發(fā)揮了抗氧化作用。

圖2 羥基積雪草苷對輻射IEC-6細胞氧化應激的影響 輻射后第1、3、5和7天，檢測了細胞培養(yǎng)液中（A）SOD、（B）Gpx、（C）CAT和（D）MDA的活性，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

2.3 羥基積雪草苷可抑制輻射IEC-6細胞的炎癥反應。

為了探索羥基積雪草苷對輻射IEC-6細胞的炎癥反應的影響，我們評估了培養(yǎng)液中促炎癥細胞因子和抗炎因子的水平。實驗結果顯示，輻射顯著增加了促炎因子（TNF-α、IL-1β和IL-6）的水平，降低了抗炎因子IL-10的水平，而羥基積雪草苷的干預則顯著降低TNF-α、IL-1β和IL-6的活性（圖3A，圖3B，圖3C，P＜0.05），且顯著提高了抗炎因子IL-10的活性（圖3D，P＜0.05），這表明羥基積雪草苷可抑制輻射誘導的IEC-6細胞炎癥反應并顯著提升抗炎水平。

圖3 羥基積雪草苷對輻射IEC-6細胞炎癥反應的影響 輻射后第1、3、5和7天，檢測了細胞培養(yǎng)液中（A）TNF-α、（B）IL-1β、（C）IL-6和（D）IL-10的活性，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

2.4 羥基積雪草苷干預抑制NLRP3 mRNA的表達

為了進一步揭示羥基積雪草苷修復放射性腸損傷的潛在分子機制，我們使用qRT-PCR進一步檢測各組細胞中NLRP3炎癥小體的mRNA表達情況。如圖4所示，我們的結果表明與輻射損傷組（IR）對比，治療組（IR+Madecassoside）中的NLRP3的mRNA水平得到明顯的抑制（P＜0.000 1）。

圖4 NLRP3 mRNA相對表達水平的情況 不同細胞處理后使用qRT-PCR檢測NLRP3 mRNA表達情況，***P＜0.001，****P＜0.000 1

3 討論

放射性腸損傷是盆腹腔腫瘤放射治療時最棘手的并發(fā)癥之一，在臨床表現(xiàn)為嘔吐、惡心、腹瀉、消化不良和細菌感染，嚴重者可造成敗血性休克導致患者死亡［9-10］。目前，放射性腸損傷發(fā)病機制的研究尚不深入且缺乏有效的防治手段。盡管已有藥物如氨磷汀等被證明具有放射保護作用［11］，但由于其毒性較高所以使用較為局限［12］。因此亟需開發(fā)一種有效的治療方法用于放射性腸損傷。

電離輻射造成的腸損傷主要表現(xiàn)在腸隱窩細胞喪失增殖能力、腸絨毛減少，從而導致腸屏障功能破壞，細菌入侵和炎癥［10，13］。近年來的大量研究顯示天然藥用植物具有良好的抗炎抗氧化作用［14］，因此從天然藥用植物中尋找一種安全有效的抗輻射劑具有重要的臨床意義。我們通過大量的文獻調研發(fā)現(xiàn)積雪草相關化合物具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、神經保護和免疫調節(jié)等多種藥理作用［15-22］。隨著分子生物學技術在天然藥用植物研究中的廣泛應用，積雪草中的主要成分羥基積雪草苷已被證實具有強效的抗炎、抗氧化以及抗腫瘤作用［5，23］。進一步明確羥基積雪草苷在放射性腸損傷的相關作用機制將有助于積雪草的藥用價值開發(fā)。我們的研究證明了羥基積雪草苷通過抑制輻射后的IEC-6細胞的氧化應激和炎癥反應，從而對減輕性腸損傷帶來的不良反應，這提示了我們羥基積雪草苷可能成為治療放射性腸損傷的一種安全有效的手段。

氧化應激是放射性腸損傷的重要機制，輻射誘導的氧化應激可誘發(fā)并加重小腸黏膜上皮細胞損傷、增加腸黏膜通透性并導致小腸上皮屏障功能障礙［24-26］，組織中的SOD、Gpx、CAT和MDA含量是反應氧化應激程度的指標。抑制氧化應激能夠減輕放射性腸損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，羥基積雪草苷的干預可以提高SOD、Gpx、CAT的水平、降低MDA的水平，從而保護IEC-6細胞免受氧化應激的損傷。

促炎細胞因子和抗炎細胞因子的平衡對腸道維持正常功能起著重要作用，炎癥過程中產生的促炎細胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6和抗炎因子IL-10，這些是炎癥反應和組織損傷的重要介質，而放射性腸損傷可導致促炎性疾?。?7］。在本實驗中，我們驗證了10Gy輻射增加了IEC-6細胞培養(yǎng)液中促炎細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表達水平，降低抗炎因子IL-10的表達水平，而證明羥基積雪草苷的干預抑制了NF-α、IL-1β、IL-6的表達量，增加了IL-10的表達，這證明羥基積雪草苷能夠減少炎癥過程中產生的不良反應。

放射性腸損傷的機制較為復雜，主要表現(xiàn)在腸黏膜淋巴組織損傷、血管內皮細胞損傷、腸干細胞凋亡及菌群失調等［28］，目前關于輻射誘導腸細胞損傷的具體機制仍不清晰，因此，研發(fā)一種新型天然藥物具有一定的理論意義和臨床意義。本研究顯示，羥基積雪草苷可通過抑制氧化應激和炎癥反應來修復輻射損傷的小腸隱窩上皮細胞，可作為潛在的惡性腫瘤放射治療輻射防護劑。結合既往文獻報道，我們可以了解到羥基積雪草苷可通過抑制ERK1／2、p38、TLR4、MyD88和NF-κB的信號通路從而減輕細胞炎癥反應［29-30］，通過激活Nrf2／HO-1信號通路，減少細胞氧化應激和凋亡程度［31］，從而發(fā)揮其抗炎、抗氧化的功能，這在分子機制層面上解釋了羥基積雪草苷對放射性腸損傷的保護作用。此外，既往研究也廣泛報道炎癥因子的產生與NLRP3炎癥小體的激活密切相關［32-33］，在本次實驗中，我們使用qRT-PCR進一步檢測各組細胞中NLRP3炎癥小體的mRNA表達情況。我們的結果顯示羥基積雪草苷能夠顯著抑制NLRP3的基因表達，這一發(fā)現(xiàn)提示羥基積雪草苷可能通過抑制NLRP3炎癥小體信號通路來修復放射性腸損傷。然而，我們的研究僅停留在細胞模型層面，具有一定的局限性，未來對于羥基積雪草苷在輻射損傷修復中的調控機制將是腸道輻射防護研究的重要方向，其在放射性腸損傷中具體的作用通路和分子機制有待于進一步的研究。