外泌體microRNA在結(jié)直腸癌診斷與治療中的研究進(jìn)展

徐智妍，馬志斌，朱學(xué)丹，裴陽，姚艷文

【提要】 結(jié)直腸癌是常見惡性腫瘤之一，結(jié)直腸癌治療的高成本和患者生活質(zhì)量的下降給每個(gè)國家都增加了社會(huì)經(jīng)濟(jì)和醫(yī)療負(fù)擔(dān)。為了能早期防治結(jié)直腸癌，開展液體活檢與靶向治療新技術(shù)在腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)療中顯現(xiàn)出巨大潛力；其中，關(guān)于外泌體microRNA（miRNA）的臨床前研究具有重要意義。miRNA是一類具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)控功能的短鏈非編碼RNA，是不同疾病特別是癌癥的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。外泌體是多種細(xì)胞分泌、介導(dǎo)細(xì)胞間通訊的微小囊泡。外泌體內(nèi)包含高水平的miRNA，是體液中miRNA的理想來源與天然納米級(jí)載體。眾多證據(jù)表明外泌體miRNA參與機(jī)體多種生理和病理過程，在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中產(chǎn)生重要作用，外泌體miRNA的獨(dú)特表達(dá)譜與聯(lián)合作用可能成為未來結(jié)直腸癌診斷與治療的關(guān)鍵手段。本文將外泌體miRNA在結(jié)直腸癌中早期診斷、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)、靶向治療與化療耐藥等方面臨床應(yīng)用的研究熱點(diǎn)進(jìn)行綜述。

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是全球第三大常見惡性腫瘤和第二大癌癥死亡原因［1］，是一種由遺傳和環(huán)境因素所致的異質(zhì)性疾?。?］。CRC的病理生理機(jī)制主要是基因表達(dá)的改變，導(dǎo)致多條信號(hào)通路和細(xì)胞因子表達(dá)的失調(diào)。晚期CRC聯(lián)合治療易產(chǎn)生抗藥性，使轉(zhuǎn)移成為死亡的主要原因，五年存活率約為60%［3］。早期診斷可明顯降低CRC死亡率，但大多數(shù)患者直到后期才出現(xiàn)癥狀。而常用的篩查方法結(jié)腸鏡是一種侵入性檢查，存在一定的操作不適、患者依從性低等問題［4］，確診時(shí)往往已錯(cuò)過最佳治療時(shí)機(jī)，導(dǎo)致治療難度加大、晚期化療耐藥、預(yù)后差等一系列問題。進(jìn)一步分析CRC發(fā)生、發(fā)展和擴(kuò)散機(jī)制，開發(fā)強(qiáng)有力的血液篩查等早期診斷方法及基因療法，有望降低其發(fā)病率和死亡率。許多研究已證明miRNA調(diào)控是驅(qū)動(dòng)CRC發(fā)生和發(fā)展的重要基本過程之一，參與CRC起始、進(jìn)展和凋亡的信號(hào)通路，可能作為CRC診斷、評(píng)估預(yù)后、療效的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)［5］。但體液中的miRNA易被核酸酶降解，限制了其檢測(cè)的準(zhǔn)確性和臨床藥物應(yīng)用［6］。近期研究結(jié)果顯示外泌體miRNA在腫瘤的早期診治中具有極其廣闊的應(yīng)用前景。外泌體是miRNA的天然富集體，可保護(hù)miRNA免受RNA酶活性的影響，而且具有免疫原性和細(xì)胞毒性低、穩(wěn)定性和生物相容性高等優(yōu)點(diǎn)［7］。外泌體miRNA的表達(dá)水平與癌癥進(jìn)展密切相關(guān)，可作為腫瘤診斷的非侵入性生物標(biāo)志物［8］。外泌體miRNA是腫瘤-宿主通訊的重要介導(dǎo)者，可作為安全有效的靶向給藥系統(tǒng)［9］。關(guān)于外泌體miRNA的研究可能很快就會(huì)應(yīng)用于腫瘤臨床治療，因?yàn)楹芏嘌芯空陂_發(fā)使用miRNA模擬物或拮抗劑遞送的新治療方法，正進(jìn)行多項(xiàng)關(guān)于使用miRNA治療CRC的臨床試驗(yàn)，且越來越受到生物制藥公司的關(guān)注［10］。因此，本文將外泌體miRNA在CRC診斷與治療中的應(yīng)用價(jià)值和最新研究熱點(diǎn)進(jìn)行綜述。

1 miRNA

1.1 miRNA的生物學(xué)功能

miRNA是單鏈非編碼RNA，大約由18～25個(gè)核苷酸組成［11］。miRNA與目標(biāo)信使RNA（Messenger RNA，mRNA）序列的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）互補(bǔ)結(jié)合，抑制［12］mRNA的翻譯或誘導(dǎo)其降解而發(fā)揮作用，參與多細(xì)胞生物體中基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)［13］。miRNA具有多靶點(diǎn)潛能，單個(gè)miRNA可與多個(gè)靶點(diǎn)相互作用，miRNA通過調(diào)控不同的靶點(diǎn)產(chǎn)生致癌或抑癌作用［14］。miRNA不僅影響腫瘤細(xì)胞，還可以調(diào)控促腫瘤的基質(zhì)細(xì)胞，如成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞［15］。此外，miRNA是CRC代謝重編程的重要調(diào)節(jié)因子，通過促進(jìn)或抑制某些效應(yīng)因子介導(dǎo)癌癥代謝改變［16］。

1.2 miRNA與CRC的研究

miRNA廣泛分布于全身各處，miRNA表達(dá)譜能區(qū)分組織類型和疾病狀態(tài)，表現(xiàn)出組織特異性［17］。Marcuello等［18］研究發(fā)現(xiàn)一組血漿miRNA標(biāo)志物可以區(qū)分CRC、結(jié)直腸腺瘤患者和健康人，將多個(gè)血漿標(biāo)志物與糞便血紅蛋白濃度聯(lián)合檢測(cè)可提高CRC篩查準(zhǔn)確度。有研究證明CRC組織中的miR-888可以作為CRC診斷的潛在標(biāo)志物，也可評(píng)估患者分化程度、浸潤深度的預(yù)后效果［19］。

miRNA可以在轉(zhuǎn)錄后水平阻止蛋白表達(dá)并影響與癌癥相關(guān)的通路，幾乎在CRC的發(fā)病、進(jìn)展到轉(zhuǎn)移的所有階段都有作用［20］。Li等［21］研究發(fā)現(xiàn)miR-574-3p的上調(diào)可能通過靶向癌基因Cyclin D2抑制CRC細(xì)胞的增殖和遷移，促進(jìn)CRC細(xì)胞的凋亡。一些學(xué)者證實(shí)抑癌基因P53通過促進(jìn)miR-374b并抑制AKT1蛋白對(duì)DNA損傷的反應(yīng)，以調(diào)節(jié)博來霉素化療誘導(dǎo)的CRC細(xì)胞凋亡［22］。在CRC中，一些已知的基因經(jīng)常失活（APC、TGFBR2、TP53、SMAD4、PTEN）、組成性激活（KRAS）或過表達(dá)（MYC）。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miRNA介導(dǎo)的這些基因調(diào)節(jié)CRC細(xì)胞轉(zhuǎn)化的特征，而許多miRNA也在這些因子的下游發(fā)揮作用［23］。

miRNA因其在腫瘤中的獨(dú)特表達(dá)譜和關(guān)鍵調(diào)控作用，在CRC的診斷、預(yù)后、預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)、藥物反應(yīng)和靶向治療方面顯示出重要的應(yīng)用前景［24］。

2 外泌體概述

2.1 外泌體的生物學(xué)特性

外泌體是直徑在40～150 nm之間的胞外小泡，可由多種細(xì)胞產(chǎn)生、分泌，包含miRNA、mRNA、DNA和蛋白質(zhì)等，有一層脂質(zhì)雙層膜［25］。外泌體也存在于各種生物體液中，包括血液、尿液、唾液、支氣管肺泡灌洗液、腹水等［26］。在細(xì)胞膜內(nèi)陷形成內(nèi)體轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒於嗄遗菪◇w（multivesicular body，MVB）的過程中，內(nèi)體膜向腔內(nèi)出芽形成腔內(nèi)囊泡（intraluminal vesicle，ILV），同時(shí)將miRNA等成分吞沒并封閉在小囊泡中，MVB與細(xì)胞膜融合將ILV釋放到細(xì)胞外，即形成外泌體［27］。外泌體可吞噬細(xì)胞，或通過脂質(zhì)的融合過程與受體細(xì)胞結(jié)合，介導(dǎo)細(xì)胞間通訊［28］。外泌體是蛋白質(zhì)、核酸和其他生物活性化合物的有效載體，參與腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和免疫反應(yīng)等多種生物學(xué)事件［29］。

2.2 外泌體介導(dǎo)的腫瘤微環(huán)境調(diào)控

腫瘤微環(huán)境由異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞和多種宿主細(xì)胞等構(gòu)成，各成分之間相互作用，以促進(jìn)疾病的發(fā)展。腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體是正常健康細(xì)胞的10倍以上，通過對(duì)腫瘤分泌的外泌體及其內(nèi)容物分析可以提供有關(guān)腫瘤動(dòng)態(tài)環(huán)境的大量信息［30］。癌癥衍生的外泌體有助于腫瘤微環(huán)境的形成和重新編程，操縱局部及全身環(huán)境，調(diào)節(jié)腫瘤血管生成，幫助癌癥生長(zhǎng)和擴(kuò)散［31］。外泌體也可以對(duì)免疫系統(tǒng)進(jìn)行編程，以引發(fā)抗腫瘤反應(yīng)［28］。外泌體內(nèi)包含高水平的miRNA，miRNA以癌細(xì)胞調(diào)控分子為靶標(biāo)參與癌細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境之間復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，通過外泌體分泌影響癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，共同參與細(xì)胞間直接信號(hào)和旁分泌信號(hào)傳遞［32］。

3 外泌體、miRNA與CRC

3.1 外泌體miRNA在CRC中作為標(biāo)志物的價(jià)值

腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體因包含miRNA等特異性標(biāo)志物，可能具有篩查、監(jiān)測(cè)腫瘤的價(jià)值。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)miR-146a-5p是CRC干細(xì)胞外泌體中的主要miRNA，通過靶向調(diào)控CRC細(xì)胞中的Numb蛋白而促進(jìn)干細(xì)胞樣特性和致癌性，血清外泌體miR-146a-5p可作為診斷CRC、治療前動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)的生物標(biāo)志物［33］。Liu等［34］實(shí)驗(yàn)證實(shí)CRC患者血漿外泌體miR-139-3p的表達(dá)水平與健康對(duì)照組相比顯著下調(diào)，轉(zhuǎn)移性CRC患者血漿外泌體miR-139-3p水平明顯低于非轉(zhuǎn)移性CRC患者，且與浸潤深度、生存期有關(guān)，提示血漿外泌體miR-139-3p含量可能與CRC進(jìn)展負(fù)相關(guān)，是CRC的新型標(biāo)志物。Fu等［35］分析人原代CRC細(xì)胞系SW480和高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系SW620分泌的外泌體miRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)CRC患者外周血外泌體中miR-17-5p和miR-92a-3p的高表達(dá)水平與患者的病理分期和分級(jí)顯著相關(guān)。循環(huán)外泌體miRNA有望成為CRC初期診斷、動(dòng)態(tài)檢測(cè)、預(yù)后及治療效果評(píng)價(jià)的無創(chuàng)性標(biāo)志物。

3.2 外泌體miRNA在CRC中的靶向治療通路

Mizoguchi等［36］研究發(fā)現(xiàn)miR-8073存在于外泌體中且主要從CRC細(xì)胞分泌，將合成的miR-8073模擬物引入異種移植小鼠結(jié)直腸腫瘤中可以抑制腫瘤的生長(zhǎng)，它可以直接靶向調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、增殖和抗凋亡的多個(gè)因子（FOXM1、MBD3、CCND1、KLK10和CASP2），共同發(fā)揮抗腫瘤增殖作用。一些學(xué)者實(shí)驗(yàn)表明，miR-128-3p可以通過外泌體傳遞到CRC細(xì)胞系HCT-116和SW480細(xì)胞，通過直接抑制其下游靶基因FOXO4激活轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β／Smad和JAK／Stat3信號(hào)來促進(jìn)CRC細(xì)胞上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT），干擾外泌體miR-128-3p和過表達(dá)FOXO4可抑制CRC細(xì)胞的存活、遷移與侵襲，從而達(dá)到治療CRC目的［37］。

已有研究證實(shí)外泌體miRNA通過介導(dǎo)多種信號(hào)通路在CRC血管生成中發(fā)揮作用，調(diào)控腫瘤形成、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移過程中的腫瘤纖維化和血管生成。高表達(dá)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1的腫瘤外泌體可以觸發(fā)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化，促進(jìn)腫瘤血管生成和腫瘤進(jìn)展［38］。Zhang等［39］的研究用轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1處理CRC細(xì)胞HCT-116，外泌體miR-200b的水平以劑量依賴的方式增加，miR-200b靶向降低細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子（p27／kip1）的表達(dá)水平，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。p27／kip1在HCT-116細(xì)胞中的過表達(dá)可有效抑制外泌體miR-200b誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞增殖。Shang等［40］發(fā)現(xiàn)來源于CRC細(xì)胞HT29的外泌體miR-183-5p通過靶向下調(diào)FOXO1，使人微血管內(nèi)皮細(xì)胞株（HMEC-1）細(xì)胞的增殖、遷移和成管能力顯著增強(qiáng)，從而促進(jìn)了CRC的發(fā)生，F(xiàn)OXO1過表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)外泌體miR-183-5p誘導(dǎo)的血管生成相關(guān)蛋白的上調(diào)。Hu等［41］研究表明CRC細(xì)胞分泌的外泌體miR-1229通過介導(dǎo)HIPK2／VEGF通路促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的愈合遷移和跨孔遷移，從而促進(jìn)腫瘤的血管生成，外泌體miR-1229抑制劑可有效抑制裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)和血管生成。外泌體miRNA可能成為一種抑制腫瘤血管生成的治療靶點(diǎn)。

遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是CRC主要死亡原因，放、化療成為晚期CRC主要治療方案，由此產(chǎn)生化療耐藥、副反應(yīng)等問題，研究其轉(zhuǎn)移、耐藥機(jī)制，為晚期患者開發(fā)更具個(gè)性化治療方案。Wang等［42］首次闡明了來自高轉(zhuǎn)移性CRC細(xì)胞系HT-29的外泌體可以顯著增加低轉(zhuǎn)移性CRC細(xì)胞系Caco-2在小鼠肝臟的轉(zhuǎn)移負(fù)荷和分布，機(jī)制可能與SDF-1／CXCR4生物軸有關(guān)，外泌體可能通過影響CRC細(xì)胞的遷移而促進(jìn)轉(zhuǎn)移。一些學(xué)者研究結(jié)果顯示衍生自轉(zhuǎn)移CRC細(xì)胞系SW620的外泌體miR-335-5p通過靶向Ras p21蛋白激活因子1（RASA1）促進(jìn)EMT，從而促進(jìn)CRC細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，RASA1過表達(dá)可阻斷外泌體miR-335-5p對(duì)CRC細(xì)胞遷移、侵襲和EMT的促進(jìn)作用，RASA1可能成為CRC轉(zhuǎn)移的潛在治療靶點(diǎn)［43］。Webber等［44］報(bào)道一組含有miR-21-5p、miR-1246、miR-1229-5p和miR-96-5p的血清外泌體miRNA可以明顯區(qū)分晚期CRC患者和化療耐藥患者，并且靶向下調(diào)這些miRNA可增加對(duì)5-氟尿嘧啶和奧沙利鉑的化療敏感性，可以作為提高晚期CRC化療藥物療效及預(yù)測(cè)能力的生物標(biāo)志物。Xu等［45］表明外泌體miR-46146通過靶向凋亡相關(guān)蛋白PDCD10作為奧沙利鉑化療耐藥的重要介導(dǎo)物，有可能成為提高CRC細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑敏感性的潛在靶點(diǎn)。

因此，可通過靶向調(diào)控外泌體miRNA介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，開發(fā)新型基因靶向療法。

3.3 外泌體miRNA在CRC中的遞送系統(tǒng)

當(dāng)miRNA 作為抗癌作用藥物被運(yùn)送時(shí)，血清中的miRNA不穩(wěn)定且無法穿過生物膜。為了避免miRNA被血液清除、酶降解和細(xì)胞內(nèi)捕獲，有必要使用輸送系統(tǒng)以增強(qiáng)保護(hù)作用和特定的細(xì)胞靶向性，需要開發(fā)有效的體內(nèi)傳遞工具［31］。外泌體不僅是miRNA的理想來源，也是細(xì)胞間通訊的天然納米載體。外泌體從細(xì)胞中自然衍生出來，通過分子生物學(xué)特性獲得腫瘤靶向能力。相對(duì)于人工納米載體，外泌體在循環(huán)中的時(shí)間更長(zhǎng)，在血清中更穩(wěn)定，靶向深層腫瘤細(xì)胞的機(jī)會(huì)顯著增加［46］。外泌體內(nèi)特有的蛋白質(zhì)在其表面表達(dá)細(xì)胞識(shí)別分子，有助于選擇性地靶向并被受體細(xì)胞攝?。?7］。外泌體遞送miRNA是細(xì)胞間信號(hào)交流的重要途徑，外泌體與細(xì)胞膜融合，將miRNA直接釋放到細(xì)胞質(zhì)中，使其免受細(xì)胞外RNA酶或環(huán)境因素的破壞［48］。因此，外泌體miRNA可作為安全有效的靶向給藥系統(tǒng)。

一些學(xué)者將miR-128-3p轉(zhuǎn)染人正常結(jié)直腸黏膜細(xì)胞，miR-128-3p可高效表達(dá)并且被包裹到外泌體中，外泌體將miR-128-3p遞送到奧沙利鉑耐藥的CRC細(xì)胞中，并通過Bmi1和MRP5基因的負(fù)調(diào)控增強(qiáng)CRC細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑化療藥敏感性［49］。Yao等［50］實(shí)驗(yàn)研制了一種基于人胚胎腎細(xì)胞系HEK293T的外泌體miRNA遞送囊泡，外泌體包裹抑癌因子miR-204-5p，有效地抑制了CRC細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，逆轉(zhuǎn)化療耐藥。Liang等［51］利用基因工程改造外泌體將化療藥5-氟尿嘧啶和miR-21小分子抑制劑共同傳遞至耐藥CRC細(xì)胞，可促進(jìn)耐藥細(xì)胞株對(duì)5-氟尿嘧啶的攝取，并能顯著下調(diào)耐藥細(xì)胞株中miR-21的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞增殖。天然納米級(jí)載體外泌體有望克服傳遞系統(tǒng)的生物障礙，靶向運(yùn)輸miRNA模擬物或拮抗劑，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡或抑制轉(zhuǎn)移的信號(hào)通路，協(xié)同治療CRC。

4 小結(jié)與展望

目前外泌體miRNA在CRC中的臨床應(yīng)用仍然面臨許多因素的挑戰(zhàn)，如提純、檢測(cè)方法缺乏標(biāo)準(zhǔn)化與臨床實(shí)用性，篩查指標(biāo)敏感性及特異性不足，未完全闡明外泌體miRNA與CRC細(xì)胞間通訊、靶向、表達(dá)及調(diào)控等作用機(jī)制，遞送藥物的安全高效性還有待證實(shí)。因此，運(yùn)用靈敏可靠的測(cè)量方法全面篩選外泌體miRNA，精確分析相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及分子機(jī)制，以及選擇正確有效的標(biāo)志物、治療靶點(diǎn)和遞送系統(tǒng)是今后研究的重點(diǎn)。我們相信對(duì)外泌體miRNA的不懈探索將會(huì)開創(chuàng)更廣闊的應(yīng)用前景，在CRC診斷與治療等領(lǐng)域中取得突破性進(jìn)展。