基于抵當(dāng)湯減毒的鉤吻生物堿體內(nèi)外含量變化研究

王文義，檀興慧，王婉瑩，諶賽男，廖華軍，吳水生，李德森

福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122

抵當(dāng)湯出自《傷寒論》，由水蛭、大黃、桃仁、虻蟲組成，臨床多用于治療太陽蓄血證。研究表明，抵當(dāng)湯具有一定的抗腫瘤及解毒功效[1-4]。鉤吻Gelsemium elegans又名大茶藥、斷腸草、野葛、胡蔓藤等，為馬錢科胡蔓藤屬植物[5]，鉤吻生物堿是鉤吻的主要藥效物質(zhì)，現(xiàn)代研究主要涉及鉤吻素子、鉤吻素甲、鉤吻素己、鉤吻綠堿、胡蔓藤堿乙、胡蔓藤堿丙6 種生物堿。鉤吻素子、鉤吻綠堿、胡蔓藤堿乙均有報道與抗腫瘤[6]及鎮(zhèn)痛、抗炎、散瞳及增強(qiáng)免疫力[7-11]相關(guān)，鉤吻素己為主要毒性成分。鉤吻治療量與中毒量接近，導(dǎo)致臨床應(yīng)用困難。

中醫(yī)藥具有發(fā)酵[12]、炮制[13]、配伍[14]、“方證相關(guān)”[15]等多種減毒存效方法，能使有毒藥物安全用于臨床。立足于“方證相關(guān)”減毒理論，辨證應(yīng)用抵當(dāng)湯可降低鉤吻毒性。有研究顯示，抵當(dāng)湯聯(lián)合鉤吻應(yīng)用后中毒小鼠的存活時間顯著延長，小鼠肺泡腔滲出減少，肺組織局灶性實變消失[15]，表明抵當(dāng)湯對鉤吻中毒具有良好的解毒作用，但對于抵當(dāng)湯減鉤吻毒的具體作用機(jī)制尚不清晰。

基于本課題組前期研究，本研究進(jìn)一步探討抵當(dāng)湯減緩鉤吻毒性前后體內(nèi)外鉤吻生物堿化學(xué)成分的變化。采用UPLC-QDa 對鉤吻與抵當(dāng)湯混合前后生物堿成分的變化進(jìn)行檢測，并通過UPLC-MS/MS 檢測抵當(dāng)湯聯(lián)合鉤吻灌胃前后小鼠血漿鉤吻生物堿成分的含量變化，旨在揭示抵當(dāng)湯減緩鉤吻毒性的物質(zhì)基礎(chǔ)，為鉤吻在中醫(yī)理論指導(dǎo)下的臨床合理應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)。

1 儀器、試藥與動物

H-class 型超高效液相色譜儀、ACQUITY QDa 型質(zhì)譜儀，美國Waters 公司；LC1260 型高效液相色譜儀，美國Agilent 公司；GT-2120QTS 型智能超聲波清洗機(jī)，廣東固特超聲股份有限公司；AR223CN 型十萬分之一電子天平，奧豪斯儀器（上海）有限公司。

鉤吻采自福建省龍巖市胡蔓藤種植基地，抵當(dāng)湯飲片（大黃、水蛭、虻蟲、桃仁）購自福建中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂醫(yī)院，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)黃澤豪副教授鑒定，鉤吻為馬錢科胡蔓藤屬植物鉤吻Gelsemium elegansBenth.的干燥莖，大黃為蓼科植物掌葉大黃Rheum palmatumL.的干燥根及根莖，水蛭為水蛭科動物柳葉螞蟥Whitmania acranulataWhitman 的干燥全體，虻蟲為虻科昆蟲華虻A(chǔ)abanas mandarinus的干燥全體，桃仁為薔薇科植物桃Prunus persica（L.）Batsch的干燥成熟種子。士的寧（批號57-24-9），成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；鉤吻素甲（批號MUST-15071312，純度≥98%）、鉤吻素子（批號MUST-15062614，純度≥99%）、鉤吻素己（批號MUST-14100901，純度≥96%），成都曼思特生物科技開發(fā)有限公司；胡蔓藤堿丙（批號BBP02553，純度≥97.5%）、胡蔓藤堿乙（批號BBP02653，純度≥95%），云南西力生物科技有限公司；鉤吻綠堿對照品（批號P15A10S85857，純度≥95%），上海源葉生物科技有限公司。鉤吻6 種生物堿對照品化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。0.9%氯化鈉注射液（批號170807A41，福州海王福藥制藥有限公司），乙腈、甲醇、甲酸為色譜純，其余試劑為分析純。

SPF 級KM 小鼠30 只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心購于上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（滬）2017-0005。飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心SPF 級屏障系統(tǒng)，溫度（24±2）℃，相對濕度50%～70%，12 h/12 h 光暗循環(huán)，自由攝食飲水，實驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。

圖1 鉤吻6 種生物堿對照品結(jié)構(gòu)圖

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜和質(zhì)譜條件

2.1.1 UPLC-QDa 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH-C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～0.5 min，12%A；0.5～8 min，12%～20%A；8～11 min，20%A；11～17 min，20%～30%A；17～22 min，30%～40%A；22～28 min，40%～70%A；28～30 min，70%A；30～31 min，70%～12%A；31～33 min，12%A）；進(jìn)樣量：10 μL；檢測波長：254 nm；柱溫：40 ℃；流速：0.25 mL/min。

2.1.2 UPLC-QDa 質(zhì)譜條件

檢測器：Waters QDA 質(zhì)譜檢測器；離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：正離子SIR 掃描；正離子模式毛細(xì)管電壓：0.8 kV；錐孔電壓：15 V；采樣速率：10 點(diǎn)/s；掃描質(zhì)量范圍：100～1000 Da。

2.1.3 UPLC-MS/MS 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC?BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相：0.1%甲酸水（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0.0～1.0 min，80%～80%A；1.0～3.0 min，80%～50%A；3.0～5.0 min，50%～20%A；5.0～6.0 min，20%～10%A；6.0～9.0 min，10%～10%A；9.0～9.5 min，10%～90%A；9.5～12.0 min，90%～90%A）；柱溫：45 ℃；流速：0.25 mL/min，進(jìn)樣量：2 μL。

2.1.4 UPLC-MS/MS 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源，正離子多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM），載氣為氮?dú)?，碰撞氣體為氬氣，離子源溫度150 ℃，毛細(xì)管電壓3.5 kV，脫溶劑氣流（N2）800 L/h，脫溶劑溫度500 ℃，錐孔氣流（N2）50 L/h，二級錐孔萃取電壓3.00 V，停留時間5 ms。6 種鉤吻生物堿及內(nèi)標(biāo)士的寧的質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。

表1 鉤吻6 種生物堿及內(nèi)標(biāo)質(zhì)譜測定條件

2.2 對照品溶液制備

2.2.1 UPLC-QDa 檢測對照品溶液

精密稱定適量的鉤吻素子、鉤吻素甲、鉤吻素己、胡蔓藤堿丙、鉤吻綠堿及胡蔓藤堿乙對照品，置于容量瓶中，加入甲醇，慢搖使其充分溶解，定容，得對照品母液。再用甲醇稀釋，得到鉤吻素子、鉤吻素甲、鉤吻素己、胡蔓藤堿丙、鉤吻綠堿、胡蔓藤堿乙的濃度分別為117.17、114.14、117.17、110.73、107.07、110.83 μg/mL 的混合對照品貯備液。

2.2.2 UPLC-MS/MS 檢測對照品溶液

精密稱取適量鉤吻素子、鉤吻素甲、鉤吻素己、鉤吻綠堿、胡蔓藤堿乙、胡蔓藤堿丙，置于容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，得到單一對照品貯備液，濃度分別為1160.0、1130.0、1160.0、1060.0、133.0、87.7 μg/mL，4 ℃冷藏保存，備用。分別取上述單一對照品貯備液適量，用50%甲醇稀釋成系列濃度的混合對照品溶液。精密稱取士的寧適量，置于容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，得到內(nèi)標(biāo)貯備液。取內(nèi)標(biāo)貯備液適量，用甲醇稀釋，得到士的寧濃度為14 ng/mL的內(nèi)標(biāo)溶液，4 ℃冷藏保存，備用。

2.3 供試品溶液制備

2.3.1 抵當(dāng)湯供試品溶液

參照前期研究[15]提取抵當(dāng)湯藥物，濃縮后得到濃度為3.5 g/mL 的抵當(dāng)湯母液，精密量取抵當(dāng)湯母液400 μL，置于2 mL 容量瓶中，用50%甲醇水稀釋至刻度，振搖均勻，精密量取200 μL，用20%甲醇水稀釋至0.14 g/mL，得抵當(dāng)湯供試品溶液。

2.3.2 鉤吻供試品溶液

稱取鉤吻樣品3 g，粉碎，置圓底燒瓶中，用90%乙醇浸泡1 h 后，回流提取2 次，每次1 h，合并2次提取液，減壓濃縮至無醇味，用超純水溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶中并稀釋至刻度，振搖均勻，得濃度為0.3 g/mL 的鉤吻母液（以鉤吻原藥材量計）。精密量取鉤吻母液90 μL，置2 mL 容量瓶中，用50%甲醇水稀釋至刻度，振搖均勻，精密量取200 μL，用20%甲醇水稀釋至2.7 μg/mL，得鉤吻供試品溶液。

2.3.3 混合供試品溶液

精密量取鉤吻母液90 μL、抵當(dāng)湯母液400 μL，置2 mL 容量瓶中，用50%甲醇水稀釋至刻度，振搖均勻，精密量取200 μL，用20%甲醇水稀釋至抵當(dāng)湯濃度為0.14 g/mL、鉤吻濃度為2.7 μg/mL，得混合供試品溶液。

2.3.4 血漿樣品制備

參照前期研究[15]將小鼠分為空白組、鉤吻組、抵當(dāng)湯＋鉤吻組，每組10 只，雌雄各半，給藥劑量參照前期研究，鉤吻1.5 g/kg，抵當(dāng)湯70 g/kg。小鼠灌胃給藥10 min 后，鉤吻組出現(xiàn)中毒癥狀，抵當(dāng)湯＋鉤吻組癥狀較輕或無中毒癥狀。各組小鼠摘眼球取血，置于含肝素鈉的采血管中，4000 r/min 離心15 min，取上清液，-20 ℃保存，備用。精密吸取100 μL 血漿于1.5 mL 離心管中，加400 μL 甲醇和100 μL 內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋1 min，14 000 r/min 離心10 min，取上清液，于離心濃縮儀中吹干，加20%甲醇100 μL 復(fù)溶，14 000 r/min 離心10 min，取上清液，進(jìn)樣分析，每組樣本平行分析3 次。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 UPLC-QDa 方法學(xué)考察

2.4.1.1 線性關(guān)系考察

取“2.2.1”項下對照品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件及“2.1.2”項下質(zhì)譜條件，測定鉤吻素子、鉤吻素甲、鉤吻素己、胡蔓藤堿丙、鉤吻綠堿、胡蔓藤堿乙的線性范圍，結(jié)果見表2。各成分在相應(yīng)范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

表2 鉤吻6 種生物堿成分線性關(guān)系考察結(jié)果

2.4.1.2 精密度試驗

取“2.2.1”項下混合對照品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件及“2.1.2”項下質(zhì)譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，計算鉤吻素子、鉤吻素甲、鉤吻素己、胡蔓藤堿丙、鉤吻綠堿及胡蔓藤堿乙的峰面積，結(jié)果RSD 分別為1.53%、0.45%、0.81%、1.65%、1.4%、1.53%，表明儀器精密度良好。

2.4.1.3 穩(wěn)定性試驗

取同一份鉤吻及混合供試品溶液，分別于制備后2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣測定，鉤吻供試品中鉤吻素子、鉤吻素甲、鉤吻素己、胡蔓藤堿丙、鉤吻綠堿及胡蔓藤堿乙含量RSD 分別為0.87%、0.73%、0.65%、0.97%、1.09%、1.78%，混合供試品中鉤吻素子、鉤吻素甲、鉤吻素己、胡蔓藤堿丙、鉤吻綠堿及胡蔓藤堿乙含量RSD 分別為1.14%、1.02%、1.52%、0.45%、0.68%、0.64%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.1.4 重復(fù)性試驗

稱取同一批抵當(dāng)湯及鉤吻樣品，按“2.3.1”“2.3.2”“2.3.3”項下方法制備鉤吻、抵當(dāng)湯及混合供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件及“2.1.2”項下質(zhì)譜條件分別進(jìn)樣測定，計算鉤吻供試品中鉤吻素子、鉤吻素甲、鉤吻素己、胡蔓藤堿丙、鉤吻綠堿及胡蔓藤堿乙的平均含量RSD 分別為2.68%、1.33%、2.75%、2.95%、2.39%、2.13%，混合供試品中鉤吻素子、鉤吻素甲、鉤吻素己、胡蔓藤堿丙、鉤吻綠堿及胡蔓藤堿乙的平均含量RSD 分別為2.21%、2.10%、2.10%、0.94%、1.27%、1.02%，結(jié)果表明本方法重復(fù)性良好。

2.4.1.5 加樣回收率試驗

稱取同一批鉤吻樣品1.5 g，各3 份，加入與供試品待測成分含量近似相等的對照品，按“2.3.2”“2.3.3”項下方法制備鉤吻及混合供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件及“2.1.2”項下質(zhì)譜條件分別進(jìn)樣分析，結(jié)果表明，鉤吻素子、鉤吻素甲、鉤吻素己、胡蔓藤堿丙、鉤吻綠堿及胡蔓藤堿乙的加樣回收率（RSD）分別為98.01%（0.86%）、95.53%（1.96%）、103.35%（1.32%）、97.28%（2.30%）、102.17%（1.46%）、97.88%（1.58%），表明加樣回收率良好。

2.4.2 UPLC-MS/MS 方法學(xué)考察

2.4.2.1 線性關(guān)系考察

按“2.1.3”“2.1.4”項下條件測定空白血漿中鉤吻素子、鉤吻素甲、鉤吻素己、鉤吻綠堿、胡蔓藤堿乙、胡蔓藤堿丙線性范圍，結(jié)果見表3。各成分在相應(yīng)范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

表3 血漿中鉤吻6 種生物堿成分線性關(guān)系考察結(jié)果

2.4.2.2 穩(wěn)定性試驗

取3 份空白血漿各100 μL，分別加入高、中、低濃度混合對照品貯備液，按“2.3.4”項下方法處理，分別于制備后0、2、4、6、8、10、12、24 h 進(jìn)樣分析，計算空白血漿樣品中鉤吻素子、鉤吻素甲、鉤吻素己、鉤吻綠堿、胡蔓藤堿乙、胡蔓藤堿丙的峰面積，結(jié)果RSD分別為7.13%、7.05%、5.02%、5.82%、6.19%、7.07%，表明血漿樣品在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.2.3 精密度試驗

取高、中、低濃度的含有對照品血漿樣品，按“2.3.4”項下方法處理，進(jìn)樣分析。日內(nèi)平行測定6次，計算日內(nèi)精密度；連續(xù)測定6 d，計算日間精密度。結(jié)果表明，鉤吻素子、鉤吻素甲、鉤吻素己、鉤吻綠堿、胡蔓藤堿乙、胡蔓藤堿丙的日內(nèi)精密度RSD分別為3.03%、2.37%、1.58%、2.00%、1.89%、1.92%，日間精密度RSD 分別為6.63%、5.78%、7.60%、5.45%、7.80%、7.25%，表明儀器精密度良好。

2.4.2.4 提取回收率與基質(zhì)效應(yīng)

取高、中、低濃度的混合對照品溶液進(jìn)行測定，得相應(yīng)峰面積A；取6 份空白血漿100 μL，加入對照品溶液，分別制得高、中、低濃度樣品，按“2.3.4”項下方法制備血漿樣品并進(jìn)樣測定，得到相應(yīng)峰面積B；另取6 份空白血漿100 μL，按“2.3.4”項下方法處理后加入相應(yīng)濃度的混合對照品溶液，使終濃度與前者濃度相對應(yīng)，進(jìn)樣測定，得峰面積C。提取回收率（%）＝B/C×100%，基質(zhì)效應(yīng)（%）＝C/A×100%。鉤吻6 種生物堿成分高、中、低濃度的提取回收率見表4，基質(zhì)效應(yīng)見表5。

表4 鉤吻6 種生物堿成分提取回收率（%）

表5 鉤吻6 種生物堿成分基質(zhì)效應(yīng)（%）

2.4.2.5 專屬性試驗

取空白血漿加對照品混合液、內(nèi)標(biāo)溶液，采用UPLC-MS/MS 檢測條件進(jìn)行測定，同時做空白血漿、給藥血漿的對照試驗，分析比較三者的色譜圖，結(jié)果見圖2?？梢钥闯?，士的寧、鉤吻素子、鉤吻素甲、鉤吻素己、鉤吻綠堿、胡蔓藤堿乙、胡蔓藤堿丙的出峰時間分別約為3.25、3.46、2.77、3.82、3.80、4.30、3.08 min。UPLC-MS/MS 檢測結(jié)果顯示，在上述色譜條件下，空白血漿中未出現(xiàn)明顯色譜峰，表明空白血漿中內(nèi)源性雜質(zhì)不干擾鉤吻成分的測定；且抵當(dāng)湯中各成分也不干擾鉤吻成分的測定，分離效果良好，本方法專屬性良好。

圖2 鉤吻6 種生物堿成分及內(nèi)標(biāo)專屬性試驗色譜圖

2.5 樣品含量測定

按“2.1”項下條件采用UPLC-QDa、UPLC-MS/MS檢測鉤吻、抵當(dāng)湯、混合供試品及鉤吻組、鉤吻＋抵當(dāng)湯組血漿樣品，依次進(jìn)樣并記錄峰面積，按標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計算鉤吻素子、鉤吻素甲、鉤吻素己、胡蔓藤堿丙、鉤吻綠堿及胡蔓藤堿乙含量。采用SPSS23.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用配對樣本t檢驗，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

UPLC-QDa 檢測結(jié)果顯示，與抵當(dāng)湯混合后，鉤吻6 種生物堿成分均呈下降趨勢，鉤吻素子、鉤吻素甲、鉤吻綠堿、胡蔓藤堿乙含量較鉤吻樣品明顯降低（P＜0.01），見表6。UPLC-MS/MS 檢測結(jié)果顯示，與鉤吻組比較，抵當(dāng)湯＋鉤吻組小鼠血漿鉤吻素子、鉤吻素甲、鉤吻素己、鉤吻綠堿、胡蔓藤堿乙、胡蔓藤堿丙均明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見表7。抵當(dāng)湯聯(lián)合鉤吻后，鉤吻6 種生物堿成分的體內(nèi)外變化趨勢相同，可以初步判斷抵當(dāng)湯對鉤吻減毒作用機(jī)制與降低這6 種生物堿成分含量相關(guān)。

表6 抵當(dāng)湯混合鉤吻前后6 種生物堿含量比較（，μg/mL，n＝3）

表6 抵當(dāng)湯混合鉤吻前后6 種生物堿含量比較（，μg/mL，n＝3）

注：與鉤吻樣品比較，*P＜0.05，**P＜0.01

表7 2 組小鼠血漿中6 種鉤吻生物堿含量比較（，ng/mL，n＝3）

表7 2 組小鼠血漿中6 種鉤吻生物堿含量比較（，ng/mL，n＝3）

注：與鉤吻組比較，**P＜0.01

3 討論

鉤吻為劇毒藥，以外用為主，具有殺蟲止癢、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗腫瘤等作用[16-18]，具有“止痛不成癮”特點(diǎn)[19]，其毒性雖大，卻有潛在藥用價值。因此，通過減毒存效的方法，在降低其毒性同時保留其藥理活性是研究的重點(diǎn)[20-22]。抵當(dāng)湯是太陽蓄血證經(jīng)典方劑，本課題組前期將之用于鉤吻減毒研究，發(fā)現(xiàn)鉤吻與抵當(dāng)湯聯(lián)合給藥后，中毒小鼠死亡率降低，死亡時間延長，但其中化學(xué)成分變化尚不清楚。本研究建立UPLC-QDa 及UPLC-MS/MS 檢測方法，通過體內(nèi)外檢測鉤吻與抵當(dāng)湯聯(lián)用后鉤吻生物堿成分變化，初步闡明抵當(dāng)湯減緩鉤吻毒性的物質(zhì)基礎(chǔ)。對于鉤吻生物堿成分結(jié)構(gòu)是否發(fā)生變化，以及是否有新物質(zhì)生成，后續(xù)研究將進(jìn)一步探討。

因鉤吻生物堿含量比抵當(dāng)湯中物質(zhì)的含量低，在色譜圖中不明顯，且抵當(dāng)湯中所含物質(zhì)較多，基線難以分離，故選用UPLC-QDa 技術(shù)測定鉤吻與抵當(dāng)湯混合前后鉤吻生物堿含量，與傳統(tǒng)分析方法相比，具有分離速率快、分離效果好、準(zhǔn)確度高、精密度好等特點(diǎn)。在UPLC-QDa 的SIR 模式中，各化合物采用不同的離子通道，互不干擾，適用于測定鉤吻與抵當(dāng)湯混合前后鉤吻生物堿成分的含量變化。此外，由于血漿中鉤吻生物堿成分含量低，響應(yīng)小，HPLC-MS 無法對其進(jìn)行測定，故本研究采用UPLC-MS/MS 測定給藥前后小鼠血漿鉤吻生物堿成分含量。

本研究考察了不同流動相配比對6 種鉤吻生物堿成分分離度的影響，結(jié)果表明，UPLC-QDa 流動相采用乙腈-0.1%甲酸水梯度洗脫，UPLC-MS/MS 流動相采用甲醇-0.1%甲酸水梯度洗脫時，6 種鉤吻生物堿能達(dá)到較好的分離效果。

UPLC-QDa 檢測結(jié)果顯示，與鉤吻樣品比較，鉤吻與抵當(dāng)湯混合樣品中6 種鉤吻生物堿成分含量均有所下降；UPLC-MS/MS 檢測結(jié)果表明，鉤吻與抵當(dāng)湯混合給藥后，小鼠血漿中6 種鉤吻生物堿成分較鉤吻單獨(dú)給藥小鼠均明顯降低，與體外實驗結(jié)果相吻合。體內(nèi)外實驗相互佐證，提示鉤吻與抵當(dāng)湯聯(lián)用后發(fā)生了化學(xué)變化，導(dǎo)致鉤吻生物堿含量降低，從而降低了鉤吻的毒性。具體涉及哪些變化，仍需進(jìn)一步研究。

本研究體內(nèi)實驗采用動物血漿進(jìn)行檢測。前期實驗顯示，在該劑量下，小鼠灌胃鉤吻的中毒死亡時間約為15 min，在10 min 左右出現(xiàn)中毒癥狀，故采血時鉤吻組選擇給藥10 min 出現(xiàn)中毒癥狀的小鼠，其余組在給藥10 min 時采血。對于抵當(dāng)湯是否影響鉤吻生物堿的藥代動力學(xué)變化，本研究未涉及，將在后續(xù)研究中進(jìn)一步探討。

本研究以鉤吻生物堿成分為指標(biāo)考察鉤吻與抵當(dāng)湯聯(lián)用前后6 種生物堿類成分的體內(nèi)外含量變化，可為在抵當(dāng)湯減毒基礎(chǔ)上的鉤吻減毒存效機(jī)制提供依據(jù)。

致謝：本項目在福建中醫(yī)藥大學(xué)方藥分析實驗室（二級）[Herb & Formula Analysis Lab（2）]完成。