雷公藤甲素減輕MRL/lpr狼瘡小鼠腎損傷的作用機(jī)制研究

段然，吳沅皞，劉維

（天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科，天津300193）

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus,SLE）是臨床常見的自身免疫性疾病，以自身免疫應(yīng)答紊亂、產(chǎn)生自身抗體異常并與相應(yīng)自身抗原形成免疫復(fù)合物為特征，可累及全身多個(gè)臟器并引起相應(yīng)的臨床表現(xiàn)[1]。腎臟是SLE 病情發(fā)展變化過程中常見的受累臟器，免疫復(fù)合物在腎臟沉積后引起狼瘡腎炎（lupus nephritis,LN），LN 不僅是影響SLE 預(yù)后的重要因素，也是引起終末期腎臟病的常見原因，需要進(jìn)行積極防治[2-3]。雷公藤甲素（Triptolide,TPL）是從中藥雷公藤中提取到的環(huán)氧化二萜內(nèi)酯化合物，具有免疫調(diào)節(jié)活性，在SLE、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病的治療中體現(xiàn)出一定價(jià)值[4]，多項(xiàng)研究報(bào)道了TPL 對(duì)SLE 小鼠腎功能的保護(hù)作用[5-6]，但具體的機(jī)制并未闡明。國(guó)內(nèi)施棟梁等[7]關(guān)于SLE 的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，TPL 對(duì)γ 干擾素（Interferon-gamma,IFN-γ）誘導(dǎo)的腎小球細(xì)胞炎癥具有緩解作用，且這一作用與抑制JAK1/STAT1 信號(hào)通路有關(guān)?；诖?，本實(shí)驗(yàn)深入探究TPL 調(diào)控JAK1/STAT1 通路，減輕MRL/lpr狼瘡小鼠腎損傷的作用及機(jī)制，旨在闡明TPL 用于LN防治的潛在價(jià)值及分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雌性C57BL/6 正常小鼠8 只及MRL/lpr 狼瘡小鼠32 只購(gòu)自蘇州賽業(yè)模式生物研究中心，8～10 周齡、體重20～25 g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（蘇）2018-0003。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

TPL 購(gòu)自上海柘智生物科技公司，過表達(dá)JAK1 的腺病毒購(gòu)自上海漢恒生物科技公司（濃度1×1011PFU/ml、-80℃保存），尿蛋白、血清肌酐（serum creatinine,Scr）、血尿素氮（blood urea,BUN）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成研究所，免疫熒光染色試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，IgG、C3 抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司，HE 染色試劑盒購(gòu)、RIPA 裂解液及BCA 蛋白定量試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司，γ 干擾素誘導(dǎo)蛋白-10（interferon-gamma induced protein 10, IP-10）、高遷移率族蛋白1（high mobility group box protein 1, HMGB1）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) （enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)公司，JAK1、STAT1一抗購(gòu)自德國(guó)CST 公司。正置顯微鏡購(gòu)自日本Nikon 公司，多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio Tek 公司，電泳儀及凝膠成像儀購(gòu)自上海天能公司。

1.3 方法

1.3.1 小鼠分組、模型復(fù)制及給藥8 只C57BL/6 正常小鼠作為對(duì)照組；32只MRL/lpr狼瘡小鼠隨機(jī)分為模型組、TPL 組、JAK1 組、TPL+JAK1 組，每組8只。模型組給予生理鹽水灌胃，連續(xù)9周；TPL 組給予0.125 mg/（kg·2 d）TPL 灌胃，連續(xù)9 周；JAK1 組給予JAK1 腺病毒懸液10 μl 單次尾靜脈注射；TPL+JAK1 組給予0.125 mg/（kg·2 d）TPL 灌胃，連續(xù)9周，以及JAK1腺病毒懸液10 μl單次尾靜脈注射。

1.3.2 尿蛋白及Scr、BUN 的檢測(cè)末次灌胃后開始收集24 h 尿，然后處死小鼠收集血清，檢測(cè)24 h尿蛋白及Scr、BUN 水平，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，配置反應(yīng)體系后在全自動(dòng)生化分析儀上檢測(cè)相應(yīng)指標(biāo)。

1.3.3 腎臟HE染色及免疫熒光染色處死小鼠后解剖雙側(cè)腎臟，左側(cè)腎臟用4%多聚甲醛固定后進(jìn)行石蠟包埋，制作病理切片后行HE 染色，在顯微鏡下觀察腎臟的病理改變；另取腎臟病理切片行免疫熒光染色，IgG 和C3 一抗的稀釋比例為1∶300，染色后用抗熒光猝滅封片液封片，顯微鏡下觀察并計(jì)算免疫熒光強(qiáng)度。以上操作均按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.4 血清及腎臟中IP-10、HMGB1 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的檢測(cè)取血清樣本，采用ELISA 試劑盒檢測(cè)IP-10、HMGB1 質(zhì)量分?jǐn)?shù)。取右側(cè)腎臟組織，采用ELISA 試劑盒檢測(cè)IP-10、HMGB1 質(zhì)量分?jǐn)?shù)，計(jì)算每毫克腎臟蛋白對(duì)應(yīng)的IP-10、HMGB1 含量。以上操作均按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.5 腎臟中JAK1、STAT1表達(dá)水平的檢測(cè)取右側(cè)腎臟組織，用RIPA 裂解液提取組織中的蛋白，將30 μg 蛋白樣本加入SDS-PAGE 電泳后濕轉(zhuǎn)至NC膜，5%脫脂牛奶室溫封閉NC 膜1 h，用1∶2 000稀釋的JAK1、p-JAK1、STAT1、p-STAT1 一抗4℃孵育過夜；次日，洗膜3 遍后室溫孵育二抗1h，再次洗膜3 遍，采用BCA 試劑盒檢測(cè)蛋白。在凝膠成像系統(tǒng)中顯影得到蛋白條帶，用Image J 圖像處理軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度值分析，根據(jù)灰度值計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用SNK-q法，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠24 h尿蛋白及Scr、BUN水平

各組小鼠24 h 尿蛋白及Scr、BUN 比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。模型組較對(duì)照組高（P<0.05），TPL 組較模型組低（P<0.05），JAK1 組較模型組高（P<0.05），TPL+JAK1組較TPL 組高（P<0.05）。見表1。

2.2 各組小鼠腎臟病理變化

對(duì)照組小鼠腎臟大致正常，未出現(xiàn)明顯的病理變化；模型組腎小球毛細(xì)血管損傷，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯；TPL 組腎小球毛細(xì)血管損傷及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)均較模型組減輕，JAK1 組腎小球毛細(xì)血管損傷及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)均較模型組加重；TPL+JAK1 組腎小球毛細(xì)血管損傷及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)均較TPL 組減輕。見圖1。

表1 各組小鼠24 h尿蛋白及Scr、BUN水平比較 （n=8，±s）

表1 各組小鼠24 h尿蛋白及Scr、BUN水平比較 （n=8，±s）

注：①與對(duì)照組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與TPL組比較，P<0.05。

組別24 h尿蛋白/mg Scr/（μmol/L）BUN/（mmol/L）對(duì)照組模型組TPL組JAK1組TPL+JAK1組F值P值5.84±0.94 23.32±5.58①10.32±2.52②28.93±6.72②19.29±3.48③37.142 0.000 32.12±6.68 79.49±13.48①45.68±10.23②94.51±14.27②74.51±12.84③37.037 0.000 10.38±2.35 35.75±8.49①17.68±4.51②42.49±9.24②33.24±8.68③27.619 0.000

圖1 各組小鼠腎臟病理變化 （HE染色×200）

2.3 各組小鼠腎臟IgG及C3的免疫熒光強(qiáng)度比較

各組小鼠腎臟IgG 及C3 免疫熒光強(qiáng)度比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。模型組較對(duì)照組高（P<0.05），TPL 組較模型組低（P<0.05），JAK1 組較模型組高（P<0.05），TPL+JAK1組較TPL 組高（P<0.05）。見表2 和圖2、3。

2.4 各組小鼠血清及腎臟中IP-10、HMGB1 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

各組小鼠血清及腎臟中IP-10、HMGB1 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。模型組較對(duì)照組高（P<0.05），TPL 組較模型組低（P<0.05），JAK1 組較模型組高（P<0.05），TPL+JAK1 組較TPL 組高（P<0.05）。見表3。

2.5 各組小鼠腎臟中JAK1、STAT1蛋白相對(duì)表達(dá)量

各組小鼠腎臟中p-JAK1、p-STAT1 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。模型組較對(duì)照組高（P<0.05），TPL 組較模型組低（P<0.05），JAK1 組較模型組高（P<0.05），TPL+JAK1 組較TPL 組高（P<0.05）。見表4和圖4。

表2 各組小鼠腎臟IgG和C3的熒光強(qiáng)度比較 （n=8，±s）

表2 各組小鼠腎臟IgG和C3的熒光強(qiáng)度比較 （n=8，±s）

注：①與對(duì)照組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與TPL組比較，P<0.05。

組別C3 IgG對(duì)照組模型組TPL組JAK1組TPL+JAK1組F 值P 值0.89±0.18 6.29±1.07①1.88±0.35②8.04±1.22②5.77±0.86③105.498 0.000 1.02±0.24 6.68±0.94①2.21±0.45②8.20±1.32②5.96±1.02③95.341 0.000

圖2 各組小鼠腎臟IgG的熒光強(qiáng)度 （免疫熒光染色×400）

圖3 各組小鼠腎臟C3的熒光強(qiáng)度 （免疫熒光染色×400）

表3 各組小鼠血清及腎臟中IP-10、HMGB1的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比較 （n=8，pg/mg，±s）

表3 各組小鼠血清及腎臟中IP-10、HMGB1的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比較 （n=8，pg/mg，±s）

注：①與對(duì)照組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與TPL組比較，P<0.05。

血清腎臟組別對(duì)照組HMGB1 2.77±0.52 IP-10 8.39±1.32 HMGB1 20.38±5.58 IP-10 1.84±0.35模型組TPL組JAK1組TPL+JAK1組F 值P 值8.21±1.32①4.02±0.77②11.28±1.94②8.33±1.42③57.591 0.000 26.58±4.52①13.47±2.44②34.28±7.69②24.57±5.56③36.801 0.000 65.85±12.12①31.38±8.38②80.28±15.52②59.49±11.74③39.418 0.000 5.58±0.89①3.02±0.65②7.35±1.24②5.34±0.81③54.325 0.000

表4 各組小鼠腎臟中p-JAK1、p-STAT1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （n=8，±s）

表4 各組小鼠腎臟中p-JAK1、p-STAT1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （n=8，±s）

注：①與對(duì)照組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與TPL組比較，P<0.05。

組別p-JAK1 p-STAT1對(duì)照組模型組TPL組JAK1組TPL+JAK1組F 值P 值0.45±0.08 0.78±0.14①0.54±0.10②1.08±0.16②0.84±0.17③27.766 0.000 0.67±0.11 0.83±0.16①0.54±0.08②1.14±0.22②0.79±0.13③18.366 0.000

圖4 各組小鼠腎臟JAK1、STAT1、p-JAK1、p-STAT1蛋白的表達(dá)

3 討論

腎臟是SLE 常見的受累臟器，腎臟局部補(bǔ)體過度激活、炎癥細(xì)胞因子異常分泌、免疫復(fù)合物沉積是引起腎臟損傷的主要病理因素[8-10]。在臨床實(shí)踐中，LN 是造成SLE 預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素，也是終末期腎臟病的常見病因，在SLE 的病情發(fā)展變化過程中對(duì)腎損傷進(jìn)行積極防治具有積極的臨床意義[11-13]。

目前，臨床上治療SLE 的主要藥物包括糖皮質(zhì)激素、羥氯喹、環(huán)磷酰胺等，起效迅速但毒副反應(yīng)相對(duì)較多，并且缺乏治療LN 的有效藥物。雷公藤是具有清熱解毒、祛風(fēng)通絡(luò)作用的中藥，TPL是雷公藤中重要的活性成分，已被證實(shí)能夠用于SLE、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等多種自身免疫性疾病的治療[14-15]，也有研究報(bào)道TPL 在腎小球腎炎治療中的價(jià)值[16-17]。近些年，陸續(xù)有國(guó)內(nèi)學(xué)者報(bào)道了TPL 在腎臟疾病治療中的價(jià)值，秦登優(yōu)等[5]和劉玉芳等[6]的研究分別以MRL/lpr 狼瘡小鼠和Pristane 誘導(dǎo)的狼瘡小鼠為研究對(duì)象，給予TPL 灌胃后觀察到小鼠的腎損傷明顯改善。本實(shí)驗(yàn)參照秦登優(yōu)等[5]的研究，使用MRL/lpr 狼瘡小鼠進(jìn)行研究，并給予TPL 灌胃干預(yù)，通過生化指標(biāo)及腎臟病理改變、免疫熒光染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)24 h 尿蛋白、Scr、BUN 減少，腎臟病理改變減輕，IgG 及C3 的熒光強(qiáng)度減弱，表明TPL 干預(yù)使MRL/lpr 狼瘡小鼠的腎損傷減輕，表現(xiàn)為腎功能的改善、局部免疫復(fù)合物及補(bǔ)體沉積的減少，這與既往關(guān)于TPL 改善狼瘡小鼠腎功能的報(bào)道一致[5-6]，提示TPL 可能在LN 防治中具有積極作用。

雖然越來越多的研究證實(shí)TPL 在SLE、LN 治療中的價(jià)值，但是其分子機(jī)制尚不十分清楚。腎小球系膜是LN 病理?yè)p傷主要累及的部位，施棟梁等[7]、陳硯凝等[18]及XU 等[19]以腎小球系膜細(xì)胞為研究對(duì)象進(jìn)行了細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，通過IFN-γ刺激的方式模擬SLE發(fā)病過程中腎損傷的病理特征，觀察到細(xì)胞中JAK1/STAT1 通路過度激活、下游促炎細(xì)胞因子IP-10 及HMGB1 的表達(dá)增加，IP-10、HMGB1 能夠在局部招募免疫細(xì)胞，引起免疫應(yīng)答紊亂，促進(jìn)免疫復(fù)合物沉積，進(jìn)而造成腎損害的發(fā)生。由此推測(cè)，JAK1/STAT1通路激活后IP-10、HMGB1表達(dá)增加可能參與SLE發(fā)病過程中的腎損害。而在IFN-γ刺激的同時(shí)予以TPL 干預(yù)后，JAK1/STAT1 通路的激活及下游IP-10、HMGB1 的表達(dá)均受到抑制，由此提示TPL 對(duì)JAK1/STAT1 通路的激活具有抑制作用，這也可能是TPL發(fā)揮治療作用的分子機(jī)制。

LN 相關(guān)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，LN 動(dòng)物腎臟中JAK1/STAT1 通路活化[20-22]，抑制該通路能夠減輕LN 的腎損害[23]。本實(shí)驗(yàn)在闡明TPL對(duì)狼瘡小鼠腎功能的改善作用后，進(jìn)一步分析了JAK1/STAT1 通路在TPL 改善腎功能中的作用。狼瘡小鼠血清、腎臟中IP-10、HMGB1 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)及腎臟中p-JAK1、p-STAT1 的表達(dá)水平均明顯升高，表明狼瘡小鼠腎組織JAK1/STAT1通路過度激活，與IFN-γ刺激后腎小球系膜細(xì)胞中JAK1/STAT1 通路過度激活的趨勢(shì)一致；采用TPL 對(duì)狼瘡小鼠進(jìn)行干預(yù)后，血清、腎臟中IP-10、HMGB1 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)及腎臟中p-JAK1、p-STAT1 蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯降低，表明TPL 能夠抑制狼瘡小鼠腎臟中JAK1/STAT1 通路的激活，這可能是TPL 減輕腎損傷的分子機(jī)制。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了過表達(dá)JAK1 的腺病毒，尾靜脈注射腺病毒后進(jìn)行TPL干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TPL減輕腎損傷、減少免疫復(fù)合物及補(bǔ)體沉積、降低IP-10 及HMGB1 的作用明顯被削弱，由此證實(shí)抑制JAK1/STAT1 通路是TPL 減輕狼瘡小鼠腎損傷的分子機(jī)制，TPL 能夠通過抑制JAK1/STAT1減輕狼瘡小鼠腎臟的病理改變。

綜上所述，TPL 減輕MRL/lpr 狼瘡小鼠腎損傷的分子機(jī)制可能是抑制JAK1/STAT1 通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，未來TPL 有望成為治療SLE、預(yù)防LN 的候選藥物。