應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)制備Sema4D基因條件性敲除小鼠模型

伍晴，羅銀河*，王孟清，馬曉萌

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007）

CRISPR/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated 9）是一種由RNA 指導(dǎo)Cas 核酸酶對(duì)靶向基因進(jìn)行特定DNA 修飾的技術(shù)［1］。CRISPR 是細(xì)菌和古細(xì)菌為應(yīng)對(duì)病毒和質(zhì)粒不斷攻擊而演化來的獲得性免疫防御機(jī)制。人工改造后的gRNA 與Cas9結(jié)合后，通過PAM 序列指導(dǎo)Cas9剪切DNA雙鏈，造成DNA雙鏈斷裂。

CRISPR/Cas9 只需合成一個(gè)gRNA 就能實(shí)現(xiàn)對(duì)基因的特異性修飾，Cas 蛋白不具特異性。編碼gRNA 的序列不超過100 bp，因此比構(gòu)建TALENs 更簡(jiǎn)單方便。每一對(duì)TALENs 都需要重新合成，而用于CRISPR 的gRNA 只需要替換20 個(gè)核苷酸就行。較短的gRNA 序列也避免了超長(zhǎng)、高度重復(fù)的TALENs 編碼載體帶來的并發(fā)癥，且廉價(jià)，可操作性強(qiáng)［2］。

支氣管哮喘的病理機(jī)制復(fù)雜，與氣道上皮細(xì)胞損傷、T 細(xì)胞亞群的改變、氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性、氣道重塑、神經(jīng)生長(zhǎng)因子等因素密切相關(guān)，近年來，神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫（Neuroendocrine-immune，NEI）網(wǎng)絡(luò)假說在哮喘發(fā)病機(jī)制研究中也逐漸得到重視。有研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)免疫信號(hào)蛋白4D（Sema4D）在神經(jīng)和免疫系統(tǒng)中表達(dá)且作用。在免疫系統(tǒng)中，Sema4D 在T 細(xì)胞表面被發(fā)現(xiàn)，并調(diào)節(jié)T 細(xì)胞啟動(dòng)。Sema4D 作為免疫性腦信號(hào)蛋白，參與多種免疫，在細(xì)胞間通訊、細(xì)胞遷移、免疫調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用，對(duì)氣道重塑也有一定的促進(jìn)作用［3-4］。此外，它還對(duì)巨噬細(xì)胞、DC 細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和中性粒細(xì)胞有刺激作用，并被定義為Th2 驅(qū)動(dòng)的肺病理和生理學(xué)的重要調(diào)節(jié)因子，導(dǎo)致氣道炎癥的產(chǎn)生［5］。由此可見，Sema4D 與哮喘病理密切相關(guān)，但具體機(jī)制尚不明確。

本研究擬利用CRISPR/Cas9 技術(shù)對(duì)小鼠Sema4D基因進(jìn)行靶向敲除，并從基因組對(duì)小鼠進(jìn)行鑒定和驗(yàn)證，以期構(gòu)建Sema4D 基因敲除小鼠哮喘模型，為進(jìn)一步研究Sema4D 在病毒誘發(fā)哮喘NEI 網(wǎng)絡(luò)紊亂中的作用提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用的清潔級(jí)小鼠為C57BL/6J，體質(zhì)量20～40 g，購自賽業(yè)生物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（蘇）2018-0003。小鼠飼養(yǎng)于賽業(yè)生物有限公司SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，恒溫恒濕，12 h 光照，12 h 黑暗，自由采食。PCR 試劑購自LongAmp 公司，Taq DNA（貨號(hào)：NEB M0323V）由Polymerase 提供，Qhick Ligase 連接酶和限制性內(nèi)切酶由NEB 提供，Trition X-100 由Amresco0694 提供，鼠尾裂解提取基因組使用TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0（Takara 9765）：Cat#9765-1。

1.2 方法

1.2.1 靶序列的選擇

從NCBI 小鼠基因組網(wǎng)站得到Sema4D 基因（NCBI參考序列：NM_013660.4）的序列和結(jié)構(gòu)信息。分析Sema4D 基因的結(jié)構(gòu)，該基因位于小鼠13 號(hào)染色體上，發(fā)現(xiàn)了16 個(gè)外顯子，其中ATG 起始密碼子在第3 外顯子中，TGA 終止密碼子在第16 外顯子中（轉(zhuǎn)錄本：Sema4D-201 ENSMUST00000021900.13）。實(shí)驗(yàn)選擇第4 外顯子作為條件敲除區(qū)域，該區(qū)域的缺失會(huì)導(dǎo)致小鼠Sema4D基因功能的喪失。見圖1。

圖1 小鼠Sema4D基因靶序列的選擇

1.2.2 Cas9/gRNA的設(shè)計(jì)

基于gRNA的設(shè)計(jì)原則，在靶位點(diǎn)區(qū)域共設(shè)計(jì)4條gRNA。gRNA1（matching forward strand of gene）：TATTTTGAGCCTACAGTGGGTGG；gRNA2 （matching reverse strand of gene）：TGTCTTTAACCACCCACTG?TAGG；gRNA3（matching forward strand of gene）：CG?TAATTGAGCACAAGGAGATGG； gRNA4 （matching forward strand of gene）：TAAAGACGTAATTGAGCA?CAAGG。

1.2.3 載體構(gòu)建

按照已設(shè)計(jì)gRNA 序列合成引物，合成gRNA 引物后退火，退火產(chǎn)物與基本載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)，涂平板過夜培養(yǎng)，挑取單菌落，菌落PCR 篩選陽性克隆，鑒定的陽性克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序正確，說明已成功構(gòu)建CRISPR載體獲得最終載體。

1.2.4 質(zhì)粒制備

準(zhǔn)備質(zhì)粒制備所需試劑及物品，載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，搖菌提取適量質(zhì)粒，質(zhì)粒純化試劑盒純化質(zhì)粒，測(cè)序驗(yàn)證質(zhì)粒。

1.2.5 RNA的制備

準(zhǔn)備轉(zhuǎn)錄所需試劑及物品，PX330質(zhì)粒線性化，體外轉(zhuǎn)錄試劑盒把線性化的DNA 轉(zhuǎn)錄成RNA，PCR 擴(kuò)增gRNA，膠回收PCR 產(chǎn)物，體外轉(zhuǎn)錄試劑盒把PCR 產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄成RNA，電泳鑒定轉(zhuǎn)錄的RNA 是否降解，電泳合格的RNA用RNA純化試劑盒純化，電泳鑒定純化后的RNA，純化后的RNA用于后續(xù)受精卵注射。

1.2.6 RNA注射

從交配后0.5 d的供體母鼠子宮內(nèi)獲取受精卵，安裝顯微注射設(shè)備，準(zhǔn)備所需試劑及物品，挑選形態(tài)良好、發(fā)育狀態(tài)適中的受精卵，轉(zhuǎn)移至注射皿的培養(yǎng)基內(nèi)，將待注射RNA 進(jìn)行稀釋，吸入注射針，將其逐個(gè)注射入細(xì)胞核。

1.2.7 代孕鼠制備及胚胎移植

選取適齡的母鼠與結(jié)扎公鼠合籠，獲取代孕母鼠，將注射RNA 的受精卵移植入代孕母鼠的子宮內(nèi)，將代孕母鼠放在干凈的籠盒中，并保溫待其清醒后放回籠架飼養(yǎng)，受精卵移植完成，小鼠出生，待1 周齡左右剪小鼠腳趾送檢PCR，編號(hào)，3周后進(jìn)行分籠。

1.2.8 F0小鼠鑒定

基因組DNA 提取，Triton X-100 和蛋白酶混合物裂解液，裂解樣品過夜，次日，高溫滅活蛋白酶，離心收集上清，作為PCR 模板，PCR 擴(kuò)增及電泳檢測(cè)，膠回收PCR 片段及測(cè)序鑒定，分析測(cè)序結(jié)果，記錄陽性鼠標(biāo)號(hào)。

1.2.9 F1小鼠繁殖

陽性鼠出生滿8 周，與8 周齡鼠合籠，出生小仔放入新的籠盒，并進(jìn)行編號(hào)，待1 周齡左右剪小鼠腳趾送檢PCR，進(jìn)行鑒定。

1.2.10 F1小鼠鑒定

基因組DNA 提取，Triton X-100 和蛋白酶混合物裂解液，裂解樣品過夜，次日，高溫滅活蛋白酶，離心收集上清，作為PCR 模板，PCR 擴(kuò)增及電泳檢測(cè)，膠回收PCR 片段及測(cè)序鑒定，分析測(cè)序結(jié)果，記錄陽性鼠標(biāo)號(hào)。

1.2.11 Southern Blot驗(yàn)證

通過對(duì)F1 代動(dòng)物尾部DNA 樣本的Southern Blot分析，確定正確的基因定位，Southern Blot 分析策略如下所示。

Southern Blot預(yù)期的片段大小：

5'Probe-BglII：10.76 kb-WT，2.39 kb-MT

3'Probe-SspI：4.14 kb-WT，2.70 kb-MT

Primers for 5'Probe：

5' Probe forward primer：5'-AGCAGGCAG?GTTCAGACAGGATAGA-3'

5' Probe reverse primer：5'-AACACTACCAC?CAGGGCCAAGAAC-3'

Primers for 3'Probe：

3' Probe forward primer：5'-GTCCCAGAACAT?GAGGAAGCCCTAA-3'

3' Probe reverse primer：5'-GGCTCTTTGTACGT?GCGGTCAATTA-3'

1.2.12 后代小鼠繁殖

將F1 靶向小鼠與組織特異性Sftpc-CreERT2 刪除小鼠雜交，生成F2 代小鼠，該F2 代小鼠為靶向等位基因雜合和Cre 轉(zhuǎn)基因半雜合/雜合，自交擴(kuò)繁后得到F3 代純合子小鼠和雜合子、Cre+小鼠，得到F4 flox/flox，Sftpc-CreERT2 小鼠雌雄共31 只，見圖2。

圖2 擴(kuò)繁后的F4代小鼠基因型

1.2.13 他莫昔芬誘導(dǎo)

Cre-ERT 位于廣譜型啟動(dòng)子或組織特異性啟動(dòng)子下游，他莫昔芬可以在蛋白水平激活它。將Cre-ERT小鼠與flox小鼠進(jìn)行交配繁殖，再使用他莫昔芬便可以實(shí)現(xiàn)特定時(shí)間的基因敲除。小鼠腹腔注射他莫昔芬40 mg/kg，連續(xù)注射5 d。

1.2.14 RT-qPCR檢測(cè)

經(jīng)他莫昔芬誘導(dǎo)后成功建立C57BL/6J小鼠Sema4D條件性剔除模型，取3 只誘導(dǎo)后的敲除小鼠模型、2 只flox 小鼠模型的肺組織做量化條件敲除區(qū)的基因組拷貝數(shù)表達(dá)并進(jìn)行比對(duì)，本實(shí)驗(yàn)以小鼠TERT基因作為參考基因，用引物進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)，見圖3。

圖3 RT-qPCR檢測(cè)的引物設(shè)計(jì)

2 結(jié)果

2.1 CRISPR載體的構(gòu)建

利用高保真度Taq DNA 聚合酶從BAC 克隆中擴(kuò)增出含有同源臂（HAs）和條件敲除（CKO）區(qū)域的小鼠基因組片段，并將其與重組位點(diǎn)和選擇標(biāo)記一起序列組裝成靶向載體。最終確認(rèn)目標(biāo)載體被限制性內(nèi)切酶消化，下面的單位都是千堿基對(duì)（kb），見圖4。

圖4 酶切的最終載體

2.2 F1代小鼠基因型鑒定

在F0 代陽性小鼠中用胚胎測(cè)序篩選出穩(wěn)定遺傳的founder。讓founder 與同品系的野生型雜交得到F1代，提取F1 代小鼠基因組DNA，經(jīng)PCR 擴(kuò)增后用瓊脂糖凝膠電泳鑒定，通過PCR 篩選（引物信息見圖5），F(xiàn)1動(dòng)物15、16 和30 被鑒定為陽性，獲得2 雄1 雌共3 只flox雜合子（見圖6）。并對(duì)F1代小鼠進(jìn)行基因組測(cè)序，其中小鼠15的測(cè)序結(jié)果見圖7。

圖5 引物信息

圖6 F1代小鼠組織DNA PCR擴(kuò)增后的基因型電泳鑒定結(jié)果

圖7 F1代小鼠DNA基因組的測(cè)序結(jié)果

2.3 F1代小鼠Southern Blot結(jié)果

通過對(duì)3 只F1 代動(dòng)物（15、16 和30）尾部DNA 樣本的Southern Blot 分析，確定了正確的基因定位，證實(shí)F1 代flox 雜合子構(gòu)建成功，可用于后續(xù)分析，結(jié)果見圖8。

圖8 F1代小鼠Southern blot結(jié)果

2.4 F4代小鼠PCR篩選結(jié)果

通過PCR 引物（Annealing Temperature 60.0 °C）：F1：5'-CATGTTGCCAAGCCTAATGCTC-3'，R1：5'-TTAGTGTAAGCTACCTCAATTCCCC-3' 得到F4 代flox/flox 小鼠篩選結(jié)果的結(jié)果見圖9；通過對(duì)Sftpc-CreERT2 轉(zhuǎn)基因PCR （Annealing Temperature 60.0 °C）：Sftpc-M-F：TGCTTCACAGGGTCGGTAG Sftpc-M-R：ACACCGGCCTTATTCCAAG Sftpc-W-R：CATTACCTGGGGTAGGACCA 得到篩選結(jié)果見圖10。綜上所知，經(jīng)PCR 篩選后可知F4 代flox/flox，Sftpc-CreERT2 小鼠雌雄共31 只。

圖9 F4代flox/flox小鼠PCR篩選結(jié)果

圖10 F4代Sftpc-CreERT2小鼠PCR篩選結(jié)果

2.5 Sema4D基因敲除成功后的qPCR結(jié)果

mTert 基因熔解曲線和mSema4D 基因熔解曲線見圖11，曲線上有一個(gè)單一且尖銳的峰，這表明引物具有很強(qiáng)的特異性，不存在非特異性條帶或二聚體。以小鼠mTert 基因?yàn)閰⒖蓟颍飉Sema4D-qPCRF1/R1 進(jìn)行RT-qPCR 檢測(cè)。比較CT 法，又稱2-△△CT法，用于定量mSema4D 的基因表達(dá)。尾部樣本分別以野生型樣本5-7 作為基因表達(dá)的內(nèi)對(duì)照，我們采用2-△△Ct方法分析mSema4D 條件敲除區(qū)的相對(duì)基因組拷貝數(shù)，結(jié)果顯示敲除鼠的基因拷貝數(shù)降低，說明小鼠的Sema4D 基因含量較flox 小鼠低，提示Sema4D 基因敲除成功，見表1。

表1 條件敲除區(qū)的相對(duì)基因組拷貝數(shù)

圖11 熔解曲線

3 討論

Sema4D 是軸突導(dǎo)向分子Semaphorin 第Ⅳ家族的成員之一，CD72 和Plexin-B1 是Sema4D 的兩個(gè)主要受體，分別在淋巴組織和非淋巴組織優(yōu)勢(shì)表達(dá)。高親和力的受體Plexin-B1 與Sema4D 結(jié)合可以抑制單核細(xì)胞、樹突細(xì)胞，在內(nèi)皮細(xì)胞中，還可通過促進(jìn)組裝成熟的粘聯(lián)復(fù)合物（focal adhensions）和脯氨酸酪氨酸激酶2（Pyk2）導(dǎo)致磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、蛋白激酶B（Akt）和蛋白激酶1/2（Erk1/2）的激活，是促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的重要環(huán)節(jié)，提示Sema4D 通過PI3-K 通路可能與哮喘的氣道重塑有關(guān)［6-7］。有研究發(fā)現(xiàn)Sema4D 和肺組織中的基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloprotein-2，MMP-2）、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（αsmooth muscle actin，α-SMA）蛋白表達(dá)呈現(xiàn)相同的作用趨勢(shì)，說明Sema4D可能通過使MMP-2、α-SMA表達(dá)上調(diào)，從而參與氣道重塑的形成，Sema4D 可能成為治療哮喘氣道重塑的新靶點(diǎn)［4］。Sema4D 廣泛分布于人體內(nèi)，在人類多種組織中都有表達(dá)，主要分布在神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)中。在免疫系統(tǒng)中，受體CD72 以其低親和力作用于B 細(xì)胞，對(duì)B 細(xì)胞的發(fā)育和分化起反向調(diào)控作用，Sema4D 與受體CD72結(jié)合可以消除CD72的抑制作用，說明Sema4D的參與增強(qiáng)、激化B細(xì)胞，提高B 細(xì)胞的聚集和生存能力［8-9］。當(dāng)前研究也顯示Sema4D 對(duì)T 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫有活化作用，可以增強(qiáng)T 細(xì)胞應(yīng)答，也可以通過提高樹突狀細(xì)胞的活性來實(shí)現(xiàn)抗原特異性的T 細(xì)胞的進(jìn)一步分化。研究表明，Sema4D 可刺激炎癥因子的產(chǎn)生，引起Th1/Th2 失衡，加重哮喘癥狀［10］。提示Sema4D 可能通過介導(dǎo)多種免疫功能參與了哮喘的發(fā)病。Sema4D 還顯示對(duì)巨噬細(xì)胞、DC、NK 細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞的刺激功能，這些細(xì)胞都參與哮喘病理，可知Sema4D在過敏氣道反應(yīng)中起著關(guān)鍵的非冗余調(diào)節(jié)作用［5］。近幾年，有研究不斷發(fā)現(xiàn)Sema4D 基因與哮喘的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。哮喘發(fā)病時(shí)，Sema4D 還可促進(jìn)NGF 的表達(dá)，加重哮喘發(fā)展［11］。Sema4D 可能通過刺激大鼠腦內(nèi)c-fos 蛋白的表達(dá)及SP 的釋放而進(jìn)一步抑制機(jī)體HPA 軸內(nèi)分泌激素的釋放，從而加重哮喘［12］。

中醫(yī)中藥在支氣管哮喘的治療上積累了大量經(jīng)驗(yàn)，有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)?！兜は姆āご摗肥讓ⅰ跋边M(jìn)行命名，把支氣管哮喘稱之為哮病。哮喘發(fā)病因素有內(nèi)因和外因，內(nèi)因?yàn)轶w質(zhì)特稟、正虛痰伏，外因多為外邪侵犯、氣候驟變、飲食不當(dāng)、情志刺激、活動(dòng)過度等。內(nèi)因?yàn)榘l(fā)病基礎(chǔ)，外因?yàn)橄l(fā)作條件，外因作用于內(nèi)因，引動(dòng)伏痰，導(dǎo)致肺失宣肅，痰氣相搏，阻塞氣道，氣道痙攣，升降失司，以致呼吸困難，喉間痰吼嘯鳴，發(fā)為哮喘。西醫(yī)機(jī)制與之對(duì)應(yīng)即為激活神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫（NEI）“大網(wǎng)絡(luò)”，受病毒侵襲，損傷Th1 的保護(hù)作用，激活T 細(xì)胞，Sema4D 表達(dá)增強(qiáng)，Th1/Th2 平衡被打破，刺激Th2 釋放炎癥因子，使支氣管肥大細(xì)胞脫粒、組胺釋放及嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，引起氣道水腫、痰液積聚，誘發(fā)哮喘。

由上可知，Sema4D與哮喘發(fā)作的中醫(yī)機(jī)制過程密不可分，要探知哮喘發(fā)病時(shí)，Sema4D 在肺部炎癥的具體發(fā)病機(jī)制，需要通過研究基因敲除技術(shù)構(gòu)建氣道上皮Sema4D表達(dá)缺失的小鼠模型。

CRISPR/Cas9 技術(shù)因其操作簡(jiǎn)便、效率高而成為最熱門的基因編輯技術(shù)，本研究選擇小鼠Sema4D基因轉(zhuǎn)錄起始密碼子附近第4 個(gè)外顯子作為敲除區(qū)域，并將gRNA、Cas9 mRNA 和含有l(wèi)oxP 位點(diǎn)的供體載體混合物注入受精卵移植進(jìn)同品系與雄鼠交配后超排的母鼠內(nèi)。利用CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的非同源末端連接途徑獲得的敲除小鼠，由于非同源末端連接DNA 修復(fù)的結(jié)果是隨機(jī)發(fā)生的，因此筆者通過PCR 及Southern Blot結(jié)果進(jìn)行篩選，最終獲得3 只陽性F0 代founder 小鼠，F(xiàn)0 代雌雄小鼠之間不能相互交配，為了確保產(chǎn)生的突變并穩(wěn)定遺傳，將其與同背景的野生型小鼠進(jìn)行交配，最終生產(chǎn)3 只雌雄混合的F1 代雜合小鼠。將F1 靶向flox 雜合小鼠與組織特異性Sftpc-CreERT2 工具鼠雜交，生成F2 代小鼠，該F2 代小鼠對(duì)于目標(biāo)等位基因是雜合的，而對(duì)于Cre 轉(zhuǎn)基因是陽性的。F2 代自交擴(kuò)繁后得到F3 代的CKO（flox/flox，Sftpc-CreERT2）純合子雄性小鼠和flox/+、flox/flox、flox/+Sftpc-CreERT2雌性小鼠交配后，得到31 只雌雄混合的F4 代CKO（flox/flox，Sftpc-CreERT2）小鼠。再經(jīng)他莫昔芬的誘導(dǎo)敲除目標(biāo)條件基因后，qPCR 檢測(cè)mSema4D 的含量確認(rèn)目標(biāo)基因敲除成功，成功建立C57BL/6J 小鼠Sema4D條件性敲除模型。

Sema4D 基因敲除小鼠的模型的建立為研究Sema4D 表達(dá)缺失與哮喘氣道免疫炎癥的相關(guān)性提供了重要工具，也為深入研究Sema4D相關(guān)機(jī)制提供了較好的模型，對(duì)后續(xù)的中醫(yī)治療整體實(shí)驗(yàn)具有重要且深遠(yuǎn)的意義。