c-Met抑制劑聯(lián)合氟尿嘧啶對結(jié)直腸癌細(xì)胞SW620增殖及凋亡的影響

陳婷婷，劉 偉，武 偉，來衛(wèi)東，劉琳琳*

(1山東醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，山東 臨沂 276000；2山東醫(yī)專附屬醫(yī)院；3臨沂市中心醫(yī)院)

結(jié)直腸癌具有發(fā)病隱匿、發(fā)展速度快、惡性程度高等特點，目前其臨床療法主要包括手術(shù)、化療、放療，然而不佳。20世紀(jì)中期以來，臨床普遍將氟尿嘧啶(5-FU)用做該病的基本化療藥物，但其單藥方案療效有限。c-Met為肝細(xì)胞生長因子(HGF)的受體，能夠與分泌自間質(zhì)細(xì)胞的HGF結(jié)合，使下游偶聯(lián)的諸多不同信號途徑活化，由此加速腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移與浸侵[1]。結(jié)直腸癌患者c-Met陽性表達(dá)率隨著病情加重而升高，故采用合適的c-Met抑制劑可實現(xiàn)治療的作用。但目前尚無c-Met抑制劑聯(lián)合5-FU對結(jié)直腸癌的研究。為此，本研究將c-MET抑制劑SU11274與5-FU聯(lián)合用于人結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW620，觀察對其增殖與凋亡的影響，旨在為臨床早期治療結(jié)直腸癌提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞分組及給藥方法 將SW620細(xì)胞分為對照組(C組)、5-FU組( F組)、c-MET抑制劑SU11274組(S組)、5-FU和SU11274聯(lián)合組(FS組)。F組、S組、FS組分別加入5-FU、SU11274、5-FU+SU11274，均為1μmol/L。

1.2細(xì)胞增殖觀察 對數(shù)生長期細(xì)胞胰酶消化處理，把0.1 mL(含細(xì)胞量為5×103個)懸液向96孔板內(nèi)接種，待細(xì)胞貼壁，將藥物添加至對應(yīng)的組內(nèi)。3 d后將0.02 mL、5 mg/mL的MTT添加至各孔，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，10 min離心處理(轉(zhuǎn)速為1200 r/min)，將上清倒掉，向各孔添加0.2 ml的DMSO，0.5 h混合處理，使結(jié)晶徹底溶解。530 nm波長下采用酶標(biāo)儀測量其OD值。計算細(xì)胞存活率。3次重復(fù)。

細(xì)胞存活率(%) = [吸光度(實驗組-空白組) /吸光度(對照組-空白組)]×100%。

1.3凋亡細(xì)胞檢測 6孔板接種1×105個對數(shù)生長期細(xì)胞，培養(yǎng)1 d。待貼壁，倒掉原培養(yǎng)液，將相關(guān)藥物相應(yīng)添加至各組。經(jīng)過3 d，先胰酶消化，再將所有細(xì)胞收集至試管(5 mL)，5 min離心處理(轉(zhuǎn)速為1500 r/min)，將上清倒掉，用生理鹽水洗滌。加入Binding Buffer(1×)，使細(xì)胞濃度呈1×106/mL，0.1 ml(1×105個細(xì)胞)并移入另一試管(5 mL)。各管內(nèi)加入5 μL的FITC和5 μL的PI，室溫、避光15 min。上機前添加Binding Buffer(1×)0.4 ml，60 min內(nèi)借助流式細(xì)胞儀對細(xì)胞凋亡狀況進(jìn)行觀察。重復(fù)3遍。

1.4細(xì)胞MMP，Hes1，Notch1蛋白檢測 6孔板接種細(xì)胞，待密度達(dá)對數(shù)生長期細(xì)胞后，對各組加藥干預(yù)2 d，0℃裂解細(xì)胞，0.5 h離心處理(轉(zhuǎn)速12000 r/min、溫度4℃)，收集每組蛋白裂解液，借助BCA法定量蛋白。取30～40 μg蛋白，SDS-PAGE(8%～10%)電泳分離處理，轉(zhuǎn)印至NC膜上，用5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗孵育4℃過夜，TBST洗膜 10 min×3次，二抗室溫?fù)u床孵育1 h，用TBST進(jìn)行5次洗膜，每次用時5 min，顯色、曝光成像處理。蛋白相對表達(dá)量即為目標(biāo)蛋白同內(nèi)參蛋白兩者間灰度值之比。

2 結(jié)果

2.1各組細(xì)胞存活率及凋亡率情況 各組細(xì)胞存活率及凋亡率比較有統(tǒng)計學(xué)意義，兩兩比較顯示：FS組細(xì)胞存活率最低(q=13.98～32.30，P<0.05)，凋亡率最高(q=5.3～75.22，P<0.05)。

表1 各組細(xì)胞存活率及凋亡率情況

2.2各組細(xì)胞MMP、Hes1及Notch1蛋白的表達(dá) 各組在MMP、Notch1與Hes1表達(dá)水平上有統(tǒng)計學(xué)意義，兩兩比較顯示：FS組均低于其他 各 組

(q=4.20～20.09，P<0.05)，F(xiàn)組與S組之間的MMP、Hes1表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 各組細(xì)胞中MMP，Hes1，Notch1蛋白表達(dá)情況(電泳圖)

表2 各組細(xì)胞中MMP、Hes1、Notch1蛋白表達(dá)的比較

3 討論

有研究表明，MMP在宮頸癌、胃癌、食管癌、膠質(zhì)瘤等組織中異常激活[2]。hes1與hath1均屬于前神經(jīng)元堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子家族。研究證實，hes1能夠經(jīng)由信號途徑pten/pi3k/akt/mtor使p53此抑癌基因表達(dá)下調(diào)，由此阻止細(xì)胞凋亡。有研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)結(jié)直腸癌組織內(nèi)notch1、hes1為高表達(dá)，同時有著較好的一致性[3]。

本研究將SU11274聯(lián)合5-FU作用于結(jié)直腸癌細(xì)胞SW620，結(jié)果顯示，F(xiàn)S組細(xì)胞存活率最低、凋亡率最高；FS組MMP、Hes1及Notch1蛋白相對表達(dá)量均低于其他各組。由此可見，二者聯(lián)合能夠?qū)︼@著抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，表明c-Met抑制劑可使5-FU對結(jié)直腸癌細(xì)胞SW620的敏感性提升。

Notchl信號途徑與生命機體諸多過程密切相關(guān)，包括器官形成、胚胎發(fā)育等，同時顯著影響諸多疾病的形成，包括癌癥、動脈粥樣硬化、糖尿病腎病等[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，對Notchl進(jìn)行抑制可使人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖減弱，反之，使其活化，會加速增殖[5]。此次研究發(fā)現(xiàn)，c-Met抑制劑可能通過作用Notchl信號途徑，從而對細(xì)胞增殖侵襲活性產(chǎn)生影響。