三種試劑對(duì)紅細(xì)胞表面CD38抗原去除效果的研究

邵林楠 張樹(shù)婷 王霓 周世航 于衛(wèi)建

多發(fā)性骨髓瘤（MM）是一種漿細(xì)胞克隆性增殖的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率占血液系統(tǒng)腫瘤的10%左右[1]。在骨髓瘤細(xì)胞表面CD38抗原高表達(dá)，然而在紅細(xì)胞、正常淋巴細(xì)胞和骨髓細(xì)胞上表達(dá)相對(duì)較弱，因此CD38分子已作為治療MM的新靶點(diǎn)[2]。當(dāng)MM患者通過(guò)抗-CD38單抗達(dá)雷妥尤（Daratumumab）治療時(shí)，達(dá)雷妥尤單抗與紅細(xì)胞表面CD38抗原結(jié)合，會(huì)造成患者血清（血漿）與幾乎所有人紅細(xì)胞間接抗人球蛋白試驗(yàn)（IAT）均弱陽(yáng)性的結(jié)果[3]。CHAPUY等[3]使用0.2 mol/L二硫蘇糖醇（DTT）破壞紅細(xì)胞表面CD38抗原，從而使這種干擾現(xiàn)象得到緩解，而使用1%胰蛋白酶法得到的結(jié)果稍遜色于DTT法。此外CHAPUY等推測(cè)使用二巰基乙醇（2-ME）同樣能達(dá)到緩解達(dá)雷妥尤帶來(lái)的干擾[4]，但未經(jīng)證實(shí)。由于我國(guó)實(shí)驗(yàn)室常用2-ME試劑，而且處理紅細(xì)胞用的酶試劑多為菠蘿蛋白酶及木瓜蛋白酶，胰蛋白酶相對(duì)使用較少[5]。因此結(jié)合國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室情況，本文我們參照CHAPUY等[3]報(bào)道的試劑濃度，研究了0.2 mol/L DTT、0.2 mol/L 2-ME及1%菠蘿蛋白酶對(duì)紅細(xì)胞表面CD38抗原去除的效果。

材料與方法

1 研究對(duì)象 血漿取自經(jīng)達(dá)雷妥尤單抗治療的MM患者（意外抗體篩查陽(yáng)性，抗體特異性為IgM性質(zhì)抗-Leb）；選取Leb抗原陰性的譜細(xì)胞及Leb抗原陰性的O型獻(xiàn)血者紅細(xì)胞各3份配成2%懸液。

2 試劑與儀器 抗人球蛋白試劑（抗IgG）購(gòu)自上海血液生物醫(yī)藥公司；2-ME購(gòu)自長(zhǎng)春博德生物科技有限公司；抗-Leb購(gòu)自CE-IMMUNDIAGNOSTIKA GmbH公司；抗-E購(gòu)自上海血液生物醫(yī)藥公司；DTT購(gòu)自美國(guó)Promega公司；菠蘿蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；譜細(xì)胞購(gòu)自Sanquin公司；KA-2200型離心機(jī)（日本久保田公司）；DK-600A型水浴箱（上海一恒儀器公司）。

3 試驗(yàn)方法 0.2 mol/L DTT配制方法參照CHAPUY[4]等。0.2 mol/L 2-ME和1%菠蘿蛋白酶配制方法參照《輸血技術(shù)學(xué)》[5]。紅細(xì)胞處理方法參照文獻(xiàn)[4]：上述溶液與紅細(xì)胞懸液按照體積比4∶1混合，于37℃孵育30 min，生理鹽水洗滌三次后配制成試驗(yàn)用紅細(xì)胞懸液。同時(shí)采用未經(jīng)處理的Leb抗原陰性的譜細(xì)胞及Leb抗原陰性的O型獻(xiàn)血者紅細(xì)胞懸液各3份作為對(duì)照。通常使用K+和E+紅細(xì)胞作為巰基試劑處理的對(duì)照細(xì)胞，其中K抗原可被巰基試劑破壞，而E抗原不會(huì)被破壞[4]。由于無(wú)法獲得抗-K血清，本實(shí)驗(yàn)中僅用E+紅細(xì)胞作為對(duì)照。將紅細(xì)胞懸液與含有達(dá)雷妥尤單抗的患者血漿進(jìn)行間接抗球蛋白實(shí)驗(yàn)（IAT）[5]，來(lái)評(píng)估去除CD38抗原的效果。凝集判斷標(biāo)準(zhǔn)參照《輸血技術(shù)學(xué)》[5]。

結(jié) 果

1 DTT、2-ME及菠蘿蛋白酶對(duì)紅細(xì)胞表面E抗原處理結(jié)果 經(jīng)0.2 mol/L DTT和0.2 mol/L 2-ME處理過(guò)的E+對(duì)照紅細(xì)胞，使用直接離心法對(duì)紅細(xì)胞表面E抗原進(jìn)行檢測(cè)，凝集強(qiáng)度仍為4+，與處理前凝集強(qiáng)度無(wú)差異。同樣的，經(jīng)過(guò)1%菠蘿蛋白酶處理過(guò)的E+對(duì)照紅細(xì)胞，E抗原也與處理前無(wú)差異（凝集強(qiáng)度4+）。

2 患者血漿與DTT、2-ME及菠蘿蛋白酶處理后紅細(xì)胞間接抗人球蛋白試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)0.2 mol/L DTT、0.2 mol/L 2-ME及1%菠蘿蛋白酶處理過(guò)的紅細(xì)胞與患者血漿進(jìn)行IAT，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 患者血漿與備用紅細(xì)胞懸液進(jìn)行間接抗人球蛋白試驗(yàn)結(jié)果

由2-ME處理過(guò)的紅細(xì)胞IAT結(jié)果均為陰性，DTT處理過(guò)的紅細(xì)胞IAT結(jié)果1例獻(xiàn)血者紅細(xì)胞發(fā)生溶血，其余5例細(xì)胞結(jié)果均為陰性，而菠蘿蛋白酶處理的紅細(xì)胞進(jìn)行IAT過(guò)程中有3例發(fā)生溶血現(xiàn)象，而余下3例IAT結(jié)果為顯微鏡下弱陽(yáng)性。陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果為1+。

在進(jìn)行IAT期間發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)DTT、2-ME及菠蘿蛋白酶三種試劑處理過(guò)的紅細(xì)胞均發(fā)生不同程度的溶血現(xiàn)象，最嚴(yán)重的為1%菠蘿蛋白酶處理過(guò)的紅細(xì)胞，6例紅細(xì)胞中的3例發(fā)生完全溶血現(xiàn)象（見(jiàn)圖1）。

圖1 IAT實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，三種試劑處理過(guò)的紅細(xì)胞經(jīng)過(guò)三次洗滌后剩余紅細(xì)胞示意圖

討 論

2019年7月，用于治療復(fù)發(fā)難治性M M的抗-CD38單克隆抗體達(dá)雷妥尤在我國(guó)批準(zhǔn)上市。隨著達(dá)雷妥尤單抗治療的日益普及，輸血實(shí)驗(yàn)室接收到此類患者血液標(biāo)本的可能性也隨之增加。由于達(dá)雷妥尤單抗對(duì)IAT產(chǎn)生泛凝集干擾，將為輸血服務(wù)帶來(lái)重大挑戰(zhàn)。2016年美國(guó)血庫(kù)協(xié)會(huì)（AABB）曾發(fā)布公告，介紹使用DTT處理紅細(xì)胞表面CD38抗原進(jìn)而消除干擾的方法。

DTT和2-ME是巰基還原劑，可以通過(guò)破壞紅細(xì)胞胞外區(qū)的二硫鍵，進(jìn)而使紅細(xì)胞表面CD38抗原變性，阻止抗-CD38與紅細(xì)胞結(jié)合[4]；而酶處理的作用是切割紅細(xì)胞表面CD38抗原[6]。本文通過(guò)對(duì)比三種試劑對(duì)獻(xiàn)血者新鮮紅細(xì)胞、試劑紅細(xì)胞表面CD38抗原的去除效果，發(fā)現(xiàn)三種試劑均能去除紅細(xì)胞表面CD38抗原，獻(xiàn)血者的新鮮紅細(xì)胞和試劑紅細(xì)胞之間區(qū)別不大。CHAPUY等[3]通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)2%胰蛋白酶可將達(dá)雷妥尤與CD38抗原陽(yáng)性HL-60細(xì)胞的結(jié)合率降低40%，而使用10 mmol/L DTT則可使結(jié)合率降低92%，說(shuō)明DTT去除CD38抗原的效果要優(yōu)于酶處理法，本文的試驗(yàn)結(jié)果與這一報(bào)道相一致。由于在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中1%菠蘿蛋白酶處理過(guò)的紅細(xì)胞溶血最為嚴(yán)重，因此不建議使用菠蘿蛋白酶試劑處理紅細(xì)胞去除CD38抗原。目前國(guó)外通常采用0.2 mmol/L DTT處理紅細(xì)胞來(lái)解決達(dá)雷妥尤的干擾，本文結(jié)果顯示0.2 mmol/L DTT與0.2 mmol/L 2-ME去除紅細(xì)胞表面CD38抗原效果基本一致，無(wú)DTT試劑時(shí)可以用2-ME替代。本文中三種試劑處理紅細(xì)胞后，雖然紅細(xì)胞表面CD38抗原得到破壞，但是同時(shí)使紅細(xì)胞變得脆弱，相對(duì)于未經(jīng)處理的紅細(xì)胞更容易發(fā)生溶血現(xiàn)象。但溶血現(xiàn)象也與實(shí)驗(yàn)過(guò)程中操作有關(guān)，如洗滌時(shí)生理鹽水對(duì)紅細(xì)胞的沖擊力過(guò)強(qiáng)、重懸紅細(xì)胞時(shí)震蕩過(guò)于猛烈等。如果使用微柱凝膠卡法，可以有效規(guī)避上述手工操作對(duì)處理紅細(xì)胞造成的不良影響。

HUGAN等[7]報(bào)道0.2 mol/L DTT處理的譜細(xì)胞，在12 d內(nèi)雖然會(huì)發(fā)生溶血現(xiàn)象但不影響檢測(cè)性能，但溶血可能導(dǎo)致DTT處理的譜細(xì)胞數(shù)量減少。而LALLY等[8]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)DTT處理的篩選細(xì)胞，在9天內(nèi)可檢測(cè)到細(xì)胞表面具有臨床意義的抗原（Kell除外），但對(duì)于某些同種抗體的反應(yīng)強(qiáng)度卻降低了一到兩個(gè)等級(jí)。LORENZEN等[9]對(duì)DTT處理方法進(jìn)行了改良，按照紅細(xì)胞與0.2 mol/L DTT體積比為30∶25的比例處理紅細(xì)胞，經(jīng)處理紅細(xì)胞與未經(jīng)處理紅細(xì)胞的溶血程度相同，而且可以保存33 d，此期間內(nèi)反應(yīng)強(qiáng)度沒(méi)有下降。此外應(yīng)該注意的是，DTT是有刺激性氣味的有害物質(zhì)，部分試驗(yàn)應(yīng)該在通風(fēng)柜下操作[5]。

DTT處理紅細(xì)胞可解決達(dá)雷妥尤干擾，但是此類含巰基試劑處理存在一些不足：首先會(huì)對(duì)紅細(xì)胞造成破壞，導(dǎo)致后續(xù)試驗(yàn)中紅細(xì)胞更加容易溶血。其次在破壞CD38抗原的同時(shí)也會(huì)使Kell、Yt、JMH、Cartwright（Yta）、Scianna、Lutheran、LW、Cromer、Indian、Dombrock、Knops、Some Diego、MER2、Ge3等抗原變性或減弱[10]，在抗體鑒定、篩查或交叉配血試驗(yàn)中存在漏檢抗體的風(fēng)險(xiǎn)。

本文的不足之處是只評(píng)估了三種試劑的一種工作濃度對(duì)紅細(xì)胞表面CD38抗原的清除能力，這是因?yàn)槭芟抻诨颊呤Ｓ嘌獫{量。今后在條件允許的情況下，將會(huì)使用微柱凝膠卡法進(jìn)一步評(píng)估三種試劑不同濃度對(duì)CD38抗原的處理效果。綜上所述，三種試劑均能去除紅細(xì)胞表面CD38抗原，但0.2 mol/L DTT、0.2 mol/L 2-ME去除效果優(yōu)于1%菠蘿蛋白酶，而且0.2 mol/L 2-ME可以作為0.2 mol/L DTT的替代品使用。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突