人血液經(jīng)56℃孵育處理后溶血率及血型抗原抗體變化*

范亮峰 陸瓊 姜躍琴 王中英 向東

近期爆發(fā)的新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）疫情逐漸演變?yōu)槿蚬残l(wèi)生危機。它具有廣泛、快速的傳染性，且已造成嚴(yán)重后果。有研究報道該病毒可存在于新冠患者的血液中[1，2]，因此血液檢測存在感染的風(fēng)險。冠狀病毒對熱敏感[3]，人血液樣本56℃孵育30 min被認(rèn)為是有效滅活新冠病毒的簡易方法[4，5]，用于醫(yī)院輸血科、血站檢驗科等實驗室，對實驗人員的安全有一定防護作用，然而該處理嚴(yán)重偏離了實驗血樣的常規(guī)保存條件，且無同類數(shù)據(jù)可供參考。本文通過對血液樣本56 ℃孵育處理后，紅細(xì)胞溶血、表面抗原及血清抗體變化的研究，探討孵育過程對紅細(xì)胞ABO、RhD抗原及抗體的影響。

對象與方法

1 對象 從上海地區(qū)隨機抽取正常獻(xiàn)血者A型20例，B型20例，AB型10例，O型20例，均為RHD陽性；ABO亞型7例，D變異型6例（包含弱D型和部分D型，以下均簡稱Dv型）。以上均為新鮮抗凝全血。

2 儀器與試劑 ABO/Rh血型正定型卡、抗-IgG抗球蛋白反應(yīng)卡（奧森多醫(yī)療器械有限公司，批號分別為：ABR132F、IGC062F），單克隆抗-A、抗-B、IgM抗-D、IgG抗-D血型定型試劑、ABO反定型紅細(xì)胞、血型分析用稀釋液（上海血液生物醫(yī)藥，批號分別為：20190203、20190203、20181810、20180626、20205304、20196201），Ortho半自動血型分析儀（Ortho 工作站系統(tǒng)，奧森多醫(yī)療器械有限公司），Ortho全自動血型分析儀（OrthoVISION,奧森多醫(yī)療器械有限公司），游離血紅蛋白分析試劑盒（QuantiChrom），分光光度計系統(tǒng)（TECAN SPARK 10M），臺式離心機（KA2200，KUBOTA公司），56 ℃孵育箱（SSW型恒溫水槽，上海博迅醫(yī)療設(shè)備廠）。

3 方法

3.1 血樣樣本采集、保存、紅細(xì)胞懸液制備、血清倍比稀釋，抗原抗體中和試驗，ABO正反定型試驗，RHD定型試驗，抗體效價試驗方法均參考《全國臨床檢驗操作規(guī)程》[6]。Ortho半自動、全自動血型分析儀和游離血紅蛋白分析試劑盒均按照廠商操作說明執(zhí)行。將上述所有血樣的紅細(xì)胞和血漿分離，每一份再分為“未處理組（對照組）”和“處理組”兩組，其中“處理組”紅細(xì)胞及血漿分別置56 ℃孵育30 min，“未處理組”紅細(xì)胞及血漿分別置室溫30min。

3.2 溶血率檢測：血液樣本經(jīng)56 ℃孵育處理后，溶血情況不確定，是否可進(jìn)行血清學(xué)實驗并不明確。本研究首先評價56 ℃孵育處理后壓積紅細(xì)胞溶血率。若溶血率不高，血清學(xué)實驗是可進(jìn)行的，且結(jié)果可靠。血液溶血后會從紅細(xì)胞釋放出游離血紅蛋白進(jìn)入血漿中，通過測定血漿游離血紅蛋白量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，可計算溶血率。

將1 mL新鮮O型全血血樣（血樣離心壓積后，分別吸取400 μL壓積紅細(xì)胞和600 μL對應(yīng)血漿，即40%壓積紅細(xì)胞和60%血漿）置-80 ℃冰箱冰凍30 min，取出常溫復(fù)溫后紅細(xì)胞完全溶血，即得1 mL“溶血液”。取AB型血漿稀釋上述“溶血液”，1%至10%“溶血液”10個濃度梯度，使用血紅蛋白分析試劑盒，并使用TECAN分光光度計系統(tǒng)檢測OD值（400 nm），觀察游離血紅蛋白量，并繪制溶血標(biāo)準(zhǔn)曲線及公式。隨機取20名獻(xiàn)血者全血血樣，其中男性、女性10名，編成兩組：“未處理組”，“處理組”進(jìn)行實驗。標(biāo)記“未處理組”分別室溫放置30 min，再各取1 mL標(biāo)記“處理組”分別56 ℃孵育30 min后，均使用血紅蛋白分析試劑盒檢測“未處理組”與“處理組”血漿中游離血紅蛋白量。通過上述溶血標(biāo)準(zhǔn)曲線及換算公式計算得到“未處理組”與“處理組”紅細(xì)胞溶血率。

3.3 A、B、D抗原檢測：使用抗原抗體中和試驗檢測計算A、B、D抗原處理前后變化情況。A、B、D抗原檢測（以A型D陽性為例）：將抗-A血型定型試劑用生理鹽水稀釋至凝膠卡檢測強度為“4+W”，制成“標(biāo)化抗A”試劑分別與“A型未處理組”及“A型處理組”3%紅細(xì)胞懸液室溫下中和反應(yīng)10分鐘，離心后取40 μL上清與ABO反定型試劑紅細(xì)胞在凝膠卡中反應(yīng)，使用設(shè)備為Ortho半自動血型分析系統(tǒng)。觀察并記錄兩組細(xì)胞吸收后標(biāo)化抗A分別與A、B、O型試劑紅細(xì)胞反應(yīng)的凝集強度，并轉(zhuǎn)化為相應(yīng)分值。O型紅細(xì)胞作為平行對照組。B型紅細(xì)胞與標(biāo)化抗B反應(yīng)；AB型紅細(xì)胞分別與標(biāo)化抗A、標(biāo)化抗B反應(yīng)，方法同上。

RhD抗原檢測：使用IgM抗-D定型試劑,用生理鹽水稀釋至凝膠卡檢測凝集強度約為“3+S”,分別與56 ℃處理及未處理組做中和試驗，中和后抗D與試劑O細(xì)胞反應(yīng)，方法同A、B抗原檢測。

3.4 抗原量-凝集強度轉(zhuǎn)化標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取多人份A型細(xì)胞、B型細(xì)胞、RhD陽性細(xì)胞分別混合后，配成3%紅細(xì)胞懸液，用生理鹽水稀釋成10個濃度梯度，使紅細(xì)胞濃度分別為3%，2.7%，2.4%，2.1%，1.8%，1.5%，1.2%，0.9%，0.6%，0.3%。用10個濃度梯度紅細(xì)胞分別與上述“標(biāo)化抗A”、“標(biāo)化抗B”、“標(biāo)化抗D”混合并吸收抗體。經(jīng)吸收后的標(biāo)化抗體與相應(yīng)試劑紅細(xì)胞反應(yīng)，記錄相應(yīng)凝膠卡實驗的凝集強度，并轉(zhuǎn)換為凝集分值。在Office Excel 軟件中繪制A、B、D抗原百分比與吸收后抗體凝集強度關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線及趨勢線。根據(jù)趨勢線公式將“未處理組”和“處理組”的相應(yīng)凝集分值轉(zhuǎn)化為抗原量的變化值。

亞型抗原檢測：使用抗-A、抗-B、IgM抗-D、IgG抗-D定型試劑（未經(jīng)稀釋）分別與相應(yīng)A亞型、B亞型及D變異性血樣反應(yīng)，所有血樣分為“處理組”和“未處理組”。分別讀取試管法及凝膠卡法結(jié)果。

3.5 血型抗體檢測：使用全自動血型分析儀（Ortho BioVue System）配合抗-IgG試劑微柱凝集卡法分別檢測“未處理組”和“處理組”血漿的抗-A、抗-B效價，O型血漿分別檢測抗-A及抗-B，以AB型血漿為對照組。

4 結(jié)果統(tǒng)計 以上所有凝集強度均使用計分法統(tǒng)計,實驗?zāi)瘡姸扰卸ǚ椒ê陀嫹謽?biāo)準(zhǔn)參照美國AABB Technical Manual 第十七版，對照表見表1。效價均取2n，以n值進(jìn)行計算。未處理組與處理組的差異性使用成對T檢驗，逐對比較，并根據(jù)t界值表得到P值。使用的T檢驗公式為：=逐對差值的均數(shù) ；

表1 凝集強度與凝集計分對照表

結(jié) 果

1 溶血標(biāo)準(zhǔn)曲線 制備1 mL“溶血液”，取AB型血漿稀釋上述“溶血液”，從0%，1%，2%，3%，4%，5%，6%，7%，8%，9%，10%的“溶血液”11個濃度梯度，使用血紅蛋白分析試劑盒和TECAN分光光度計系統(tǒng)檢測400 nm處的OD值。在Office Excel軟件中繪制溶血標(biāo)準(zhǔn)曲線及趨勢線公式。擬合趨勢線均接近于線性曲線，溶血標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=39.03x+0.2454，R2=0.9893。x代表100%（400 μL壓積紅細(xì)胞）溶血后各濃度梯度，y代表各濃度梯度下的檢得OD值，詳見圖1。

隨機取20名獻(xiàn)血者全血血樣，其中男性、女性10名。上海地區(qū)獻(xiàn)血者平均紅細(xì)胞比容45%左右，獻(xiàn)血者全血中含有10%的血液抗凝劑，故獻(xiàn)血者全血中真實壓積紅細(xì)胞為40%左右。因紅細(xì)胞比容在人群中偏差較大，為了實驗數(shù)據(jù)便于觀察計算，將20名獻(xiàn)血者全血離心壓積，分別吸取800 μL壓積紅細(xì)胞和1200 μL對應(yīng)血漿，各配成2 mL“全血”進(jìn)行下述實驗。各取1 mL（40%壓積紅細(xì)胞和60%血漿）標(biāo)記“未處理組”分別室溫放置30 min，再各取1 mL標(biāo)記“處理組”分別56℃孵育30 min后，使用血紅蛋白分析試劑盒和TECAN分光光度計系統(tǒng)檢測“未處理組”與“處理組”血漿中游離血紅蛋白在400 nm處的OD值。與上述全血溶血標(biāo)準(zhǔn)曲線的OD值對比得到溶血率，考慮到“處理組”中壓積細(xì)胞部分溶血后，血漿量增大，導(dǎo)致游離血紅蛋白濃度降低，測得OD值偏小，故按照如下公式轉(zhuǎn)化OD值。公式如下：X=（y-0.2454）/（39.03-2/3 y）。按照處理前原有壓積紅細(xì)胞400 μL和血漿600 μL計算。X代表400 μL壓積紅細(xì)胞經(jīng)處理后的溶血率，y代表實驗檢測到的OD值。計算紅細(xì)胞溶血率平均1.87%±2.02%，處理后溶血最嚴(yán)重的溶血率為：8.59%。詳見表2。

圖1 溶血標(biāo)準(zhǔn)曲線

表220例溶血率匯總表

2 抗-A、抗-B、抗-D試劑的標(biāo)化 經(jīng)效價檢測，分別用生理鹽水將抗-A、抗-B稀釋至“4+W”，均為128倍稀釋；將抗-D至“3+S”，為稀釋64倍。

3 抗原凝集分值-抗原量百分比標(biāo)準(zhǔn)曲線 Office Excel 軟件中繪制A抗原、B抗原、D抗原凝集分值-抗原量百分比標(biāo)準(zhǔn)曲線及趨勢線。擬合趨勢線均接近于二次項式曲線，A抗原趨勢線公式：y= -5.11x2-3.53x+11.27，R2=0.995；B抗原趨勢線公式：y=2.66x2-10.02x+11.07，R2=0.965；D抗原趨勢線公式：y= -1.51x2-8.29x+11.07，R2=0.984，以上y代表“凝集分值”，x代表“抗原量%”。將各型“未處理組”和“處理組”反應(yīng)凝集強度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線趨勢線公式，得到處理前后兩組抗原濃度百分比值，計算得抗原孵育前后抗原變化百分率，詳見圖2。

血液樣本經(jīng)過56℃孵育處理后，紅細(xì)胞表面A、B抗原濃度表達(dá)平均減弱，20例A型A抗原量百分比平均減弱43.8%±23%（表示為：±SD，下文同）；10例AB型的A抗原量百分比平均減弱35.8%±28%；20例B型的B抗原量百分比平均減弱45.0%±25%；10例AB型的B抗原量百分比平均減弱26.7%±36%。孵育后紅細(xì)胞表面D抗原濃度表達(dá)平均增強，20例A型、20例B型、10例AB型、6例O型的D抗原量百分比平均減弱增強111.6%±147%。詳見表3。

4 收集研究7例ABO亞型分別：A3、B3、B3、Bx、AB3、AB3、ABmh（AB型類孟買型），以上全部ABO亞型抗原未經(jīng)孵育前均可在ABO血型正定型卡中被檢出。56 ℃孵育后A、B抗原凝集均減弱,其中A抗原（2例）抗原凝集分值平均減弱19.3%±13%；B抗原（6例）抗原凝集強度平均減弱40.1%±30%。其中1例Bx亞型血樣在56℃孵育后，正定型B抗原變得不可測得，其他亞型血樣在孵育后依然可被正定型試驗檢出。6例Dv型D抗原凝集分值平均減弱29.6%±22%，其中3例Dv型為IgM抗-D鹽水介質(zhì)減弱型，3例Dv型為IgM抗-D鹽水介質(zhì)陰性反應(yīng)，使用IgG抗-D試劑在抗球蛋白法中被檢出，以上6例Dv型在56 ℃孵育后D抗原表達(dá)均減弱，且均可被測得。詳見減弱數(shù)值可見表4。

5 56℃孵育處理后的血清中抗-A、抗-B效價及計分值均減弱，其中計分值以2n中n值進(jìn)行抗體效價計算，其中抗-A（B型）處理后血漿、抗-A（O型）處理后血漿、抗-B（A型）處理后血漿、抗-B（O型）處理后血漿的n值分別減弱3.19%、5.49%、3.12%、9.62%。詳見表5。

討 論

圖2 A、B、D抗原凝集分值-抗原量百分比標(biāo)準(zhǔn)曲線

表3 各血型抗原孵育處理前后凝集濃度變化匯總表

表4 ABO亞型及D變異型抗原凝集濃度變化匯總表

表5 血漿抗體孵育前后效價與凝集評分值

根據(jù)實驗數(shù)據(jù)，血液樣本經(jīng)56℃孵育后,紅細(xì)胞溶血率平均1.87%±2.02%（按照400 μL壓積紅細(xì)胞計算），最嚴(yán)重溶血為8.59%，可以認(rèn)為56 ℃孵育處理對血液樣本溶血影響并不嚴(yán)重，處理后的血液樣本可以進(jìn)行血清學(xué)抗原抗體檢測實驗。

實驗證明血液樣本經(jīng)56℃孵育后，正常獻(xiàn)血者A、B抗原凝集強度與抗-A、抗-B效價均有減弱。A抗原凝集濃度百分率減弱至56.2%及64.2%，B抗原凝集濃度百分率減弱至55.0%及73.3%。正常獻(xiàn)血者中單個紅細(xì)胞上A、B抗原表達(dá)量均為10.5×105位點/細(xì)胞，而A2型個體紅細(xì)胞上A抗原表達(dá)量為2.2×105位點/細(xì)胞[7]，目前市售的所有抗-A、抗-B血型定型試劑與各廠商血型正反定型卡正定型卡中抗-A，抗-B試劑效價與親和力國家有嚴(yán)格要求，保證與A、B抗原表達(dá)量20至100萬時，反應(yīng)強度可達(dá)“4+”。經(jīng)過56℃孵育后的常規(guī)A、B抗原與市售的正定型試驗試劑或反應(yīng)卡均可達(dá)“4+”反應(yīng)強度。我們實驗中的正常獻(xiàn)血者A型20例，B型20例，AB型10例經(jīng)56℃孵育后，正定型試驗反應(yīng)性均達(dá)到“4+”，實驗結(jié)果所示A、B抗原凝集減弱均不足以干擾實驗室常規(guī)血型正定型試驗。

ABO亞型的A、B抗原表達(dá)量（＜1.0×105位點/細(xì)胞）[7]遠(yuǎn)低于正常A、B、AB型的抗原表達(dá)，我們直接選用試管法正定型檢測抗原表達(dá)變化。85.7%（6/7例）亞型56℃孵育后抗原凝集計分值雖減弱，但依然可以在正定型試驗中被測得。孵育處理后有1例Bx型B抗原（＜0.1×105位點/細(xì)胞）在正定型試驗中從弱陽性轉(zhuǎn)為無法測得，僅觀察正定型試驗可被誤判為O型，但其反定型抗B抗體凝集不強則提示B亞型可能。56℃孵育處理亞型血樣在極限低抗原表達(dá)下無法測得，可通過其他輔助實驗檢出亞型抗原，比如吸收放散試驗，基因分型技術(shù)等 。血樣孵育處理后，正常獻(xiàn)血者D陽性抗原凝集分值增強111.6%，D陽性血樣抗原凝集強度增強，具體原因尚不明確，筆者猜測可能是熱作用下更多D抗原位點被暴露所致。Dv型D抗原凝集分值減弱，6例Dv型孵育處理后均可被IgM抗-D試劑或（或和）IgG抗-D試劑檢出。56℃孵育處理對D陽性，D變異型鑒定不受影響。

血樣56℃孵育后，66例血樣血漿中抗-A（B型22例，O型22例），抗-B（A型22例，O型22例）效價2n中n值降低均不超過10%，所有血樣孵育處理后均可測得抗體，實驗結(jié)果顯示孵育處理后抗體減弱，但對血型反定型結(jié)果影響不大。見圖3。

圖3 血漿抗體效價孵育前后計分值對比圖

新冠肺炎病毒疫情在全球蔓延，并持續(xù)惡化。有報道該病毒存在于新冠患者的血液中，尚未報道病毒經(jīng)血傳播。我們免疫血液學(xué)實驗室，醫(yī)院輸血科等血清學(xué)實驗室一般生物安全防護級別較低，一般為P1實驗室或參照P2實驗室，普遍不具備直接檢測含病毒血樣能力。我國將新冠肺炎病毒列為二類傳染病，管理上按照甲類傳染病進(jìn)行管理，處置該類樣本需要負(fù)壓或加強型P2實驗室。疫情之下，各類血型血清學(xué)實驗室可能會接收大量未明確是否有病毒抗原的血液樣本，將血樣置于56 ℃孵育30分鐘可有效滅活病毒，在不影響血型血清學(xué)結(jié)果情況下，保護實驗人員生物安全。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突