氣相液氮罐內(nèi)溫度差異對(duì)臍帶血造血干細(xì)胞保存質(zhì)量的影響

富浩軒 付華來(lái) 王捷 鄧剛

自1974年臍帶血中被發(fā)現(xiàn)含有豐富的造血干細(xì)胞以來(lái)，有關(guān)學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了深入的研究，1988年世界上第一次使用臍帶血造血干細(xì)胞移植治療范可尼貧血獲得成功[1，2]，引起了越來(lái)越多的專(zhuān)家及學(xué)者的重視。此后，臍帶血造血干細(xì)胞的冷凍及長(zhǎng)時(shí)間保存被廣泛關(guān)注，并已有了一套相對(duì)成熟的保存方式。液氮的物理溫度為-196 ℃，將臍帶血造血干細(xì)胞直接浸沒(méi)在液氮中保存能夠最大限度地保持干細(xì)胞的活性，同時(shí)液氮因性質(zhì)穩(wěn)定、價(jià)格低廉等特點(diǎn)被廣泛使用。

一份臍帶血造血干細(xì)胞在合格凍存前需要進(jìn)行相關(guān)的細(xì)菌及病毒檢測(cè)，檢測(cè)周期約為7 d左右。在此之前，各個(gè)未知檢測(cè)結(jié)果的臍帶血造血干細(xì)胞保存于同一液氮中。有報(bào)道指出，液氮可以像常見(jiàn)的液體（流水）一樣，可將病毒和細(xì)菌在保存的容器內(nèi)傳播，例如：1976年THOMAS SCHAEFER[3]等人在液氮中發(fā)現(xiàn)了感染性病毒，提出了保存在液氮中的標(biāo)本存在交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)，且已被證實(shí)一些微生物可以在深低溫環(huán)境下凍存并污染其他標(biāo)本[4]。在隨后的1995年，TEDDER[5]報(bào)告了從未感染過(guò)乙肝病毒的供者身上采集的骨髓干細(xì)胞，由于儲(chǔ)存在液氮中而被乙型肝炎病毒污染，并導(dǎo)致接受該份骨髓干細(xì)胞的受者發(fā)生HBV感染的案例。這表明保存在液氮中的標(biāo)本間存在交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)，因此需要一種更優(yōu)的保存標(biāo)本的方式。

現(xiàn)在有一種氣相液氮罐，其原理是利用低溫的液氮蒸汽對(duì)液氮罐內(nèi)環(huán)境進(jìn)行降溫達(dá)到一個(gè)近似于液氮溫度的深低溫環(huán)境，從而實(shí)現(xiàn)液氮與標(biāo)本的干濕分離而采取的一種保存方式。理論上來(lái)說(shuō)，在低于-79 ℃的環(huán)境中酶的生物活性處于基本停止?fàn)顟B(tài)，而在-196 ℃的環(huán)境中細(xì)胞的新陳代謝作用也處于基本停止?fàn)顟B(tài)，此時(shí)的細(xì)胞是可以長(zhǎng)期保存的[6]。而實(shí)際情況是氣相液氮罐由于受保溫工藝的限制，液氮罐內(nèi)液氮面以外位置的實(shí)際溫度達(dá)不到-196 ℃。本文將探究這種氣相液氮罐內(nèi)不同位置的溫度是否符合要求，以及保存在不同的溫度下臍帶血造血干細(xì)胞的凍存質(zhì)量是否有差異。

材料與方法

1 臍帶血樣本 臍帶血樣本來(lái)自于浙江省臍帶血造血干細(xì)胞庫(kù)合法采集的捐獻(xiàn)臍帶血。所有捐獻(xiàn)者均被充分告知其捐獻(xiàn)臍帶血的用途，填寫(xiě)健康調(diào)查表并簽署知情同意書(shū)。樣本總數(shù)為60份，分成3組。其中A組的20份臍帶血造血干細(xì)胞保存于液氮中，作為對(duì)照組。B組的20份臍帶血造血干細(xì)胞保存于氣相液氮罐內(nèi)溫度最低處、C組的20份臍帶血造血干細(xì)胞保存于氣相液氮罐內(nèi)溫度最高處，B組和C組為實(shí)驗(yàn)組。選取的60份標(biāo)本均采自2018年6月～10月，在浙江省內(nèi)多家醫(yī)院采集并通過(guò)相同的條件進(jìn)行運(yùn)輸、制備、檢測(cè)及程控降溫凍存的臍帶血造血干細(xì)胞，臍帶血采集完畢后均在24 h內(nèi)完成制備凍存，其過(guò)程均符合浙江省臍帶血造血干細(xì)胞庫(kù)質(zhì)量控制要求。分別在冷凍前及冷凍2年后，進(jìn)行有核細(xì)胞計(jì)數(shù)、CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)、有核細(xì)胞活性及CFU-GM培養(yǎng)等檢測(cè)（冷凍后的檢測(cè)結(jié)果來(lái)源于該份臍帶血參照留樣標(biāo)本臨床應(yīng)用前的檢測(cè)數(shù)據(jù)）。

2 實(shí)驗(yàn)儀器 XN-1000血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀購(gòu)自日本Sysmex公司，F(xiàn)ACSCalibur流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司，SANYO MCO-20AIC CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher公司，1892P-190AF-GB液氮罐購(gòu)自美國(guó)MVE公司，CU-600恒溫水浴箱購(gòu)自上海一恒公司，7451程控降溫儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司。

3 實(shí)驗(yàn)試劑 WNR染液、WNR溶血素、WDF染液、WDF溶血素、SLS溶血素、DCL稀釋液等計(jì)數(shù)儀相關(guān)試劑均購(gòu)自日本Sysmex公司，單克隆抗體CD45-FITC、單克隆抗體CD34-PE、小鼠IgG1-PE、7-AAD、溶血素等流式儀相關(guān)試劑均購(gòu)自美國(guó)BD公司，甲基纖維素培養(yǎng)基購(gòu)自加拿大StemCell公司，RPMI-1640培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司。

4 方法

4.1 有核細(xì)胞計(jì)數(shù)：利用WNR染液（Fluorocell WNR）對(duì)臍帶血樣本進(jìn)行熒光染色并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)的方法對(duì)樣本中所有血細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)側(cè)向熒光（SFL）和前向散射光（FSC）的強(qiáng)弱讀取單位標(biāo)本量中所含有核細(xì)胞數(shù)量從而計(jì)算得出樣本中有核細(xì)胞的濃度。

4.2 CD34+%和有核細(xì)胞活性檢測(cè)：根據(jù)ISHAGE（International Society for Hematotherapy and Graft Engineering）標(biāo)準(zhǔn)，利用CD45及CD34單克隆抗體對(duì)臍帶血標(biāo)本進(jìn)行室溫避光孵育標(biāo)記，再通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)分析。根據(jù)造血干祖細(xì)胞的特征：1.CD45弱陽(yáng)性；2.CD34陽(yáng)性；3.低側(cè)向散射光（SSC）；4.前向散射光（FSC）與淋巴細(xì)胞相似，圈選出造血干祖細(xì)胞在有核細(xì)胞中所占的比例。有核細(xì)胞活性的檢測(cè)則是利用7-AAD染液對(duì)有核細(xì)胞進(jìn)行染色后通過(guò)流式細(xì)胞儀分析測(cè)定，根據(jù)7-AAD結(jié)果陰性為活細(xì)胞，7-AAD結(jié)果陽(yáng)性為死細(xì)胞，圈選出活細(xì)胞在有核細(xì)胞中所占的比例。

4.3 CFU-GM培養(yǎng)：通過(guò)將單位數(shù)量的有核細(xì)胞接種到半固體甲基纖維素培養(yǎng)基后在CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行一定周期培養(yǎng)，正常的造血干祖細(xì)胞具有增殖分化能力并最終成為成熟的血細(xì)胞集落。通過(guò)計(jì)數(shù)培養(yǎng)孔內(nèi)生長(zhǎng)的集落數(shù)，推斷該份臍帶血造血干細(xì)胞的造血能力。理論上來(lái)說(shuō)，培養(yǎng)板上生長(zhǎng)的集落數(shù)占接種有核細(xì)胞數(shù)的比例應(yīng)與CD34+%一致，但受細(xì)胞活性等因素影響，實(shí)際生長(zhǎng)的集落數(shù)量無(wú)法達(dá)到理論值，因此可以通過(guò)集落的生長(zhǎng)情況側(cè)面反映出一份臍帶血造血干細(xì)胞的質(zhì)量。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組均數(shù)比較采用方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 氣相液氮罐內(nèi)不同位置的溫度 由于本實(shí)驗(yàn)使用的液氮罐是利用液氮?dú)饣蟮纳畹蜏氐獨(dú)膺M(jìn)行標(biāo)本保存，因此保存溫度是無(wú)法達(dá)到-196 ℃的，測(cè)量結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 氣相液氮罐內(nèi)不同位置的溫度

由此可知距離液氮平面越遠(yuǎn)溫度越高，而該氣相液氮罐內(nèi)距離液氮平面最遠(yuǎn)和最近位置的溫度分別為：-188 ℃和-195 ℃。保存的標(biāo)本則是從下到上放置在標(biāo)本架上并垂直放置于-195℃～-188℃，距離液氮平面越近的臍帶血造血干細(xì)胞所處的溫度將越接近理想的保存溫度（-196 ℃），反之則越遠(yuǎn)。

2 60份臍血造血干細(xì)胞冷凍前后的凍存質(zhì)量分析按照浙江省臍帶血造血干細(xì)胞庫(kù)的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程分別對(duì)A組、B組、C組共60份臍帶血進(jìn)行造血干細(xì)胞的提取和凍存；分別對(duì)冷凍前及解凍后臍帶血造血干細(xì)胞質(zhì)量參數(shù)進(jìn)行檢測(cè)和計(jì)算：①有核細(xì)胞回收率：（解凍后有核細(xì)胞數(shù)/冷凍前有核細(xì)胞數(shù)）×100%；②活性變化率：[（冷凍前細(xì)胞活性-解凍后細(xì)胞活性）/冷凍前細(xì)胞活性]×100%；③集落回收率：（解凍后集落數(shù)/冷凍前集落數(shù)）×100%；④CD34+細(xì)胞回收率：（解凍后CD34+細(xì)胞%/冷凍前CD34+細(xì)胞%）×100%。

在對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總整理后可以發(fā)現(xiàn)用于檢測(cè)A、B、C三組代表標(biāo)本凍存質(zhì)量的項(xiàng)目（有核細(xì)胞回收率，活性變化率，集落回收率以及CD34+細(xì)胞回收率）其F值分別為0.982、0.828、1.573、0.859，P值均大于0.05，說(shuō)明各組均值差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果詳見(jiàn)表2。提示因保存標(biāo)本的位置不同造成的略高于液氮溫度的環(huán)境并沒(méi)有對(duì)臍帶血造血干細(xì)胞的保存質(zhì)量產(chǎn)生影響。

3 樣本冷凍前與復(fù)蘇后檢測(cè)結(jié)果對(duì)比 通過(guò)對(duì)各項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果的圖譜進(jìn)行比對(duì)，圖1為利用血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀對(duì)樣本進(jìn)行白細(xì)胞五分類(lèi)計(jì)數(shù)的對(duì)比情況，由圖1可知細(xì)胞分類(lèi)并未見(jiàn)明顯異常。圖2為流式細(xì)胞儀檢測(cè)樣本CD34+以及有核細(xì)胞活性的對(duì)比情況，圖2中未見(jiàn)明顯區(qū)別。圖3為樣本CFU-GM集落培養(yǎng)情況對(duì)比，如圖3所示各細(xì)胞集落生長(zhǎng)情況正常。

表2 各組臍帶血造血干細(xì)胞凍存質(zhì)量參數(shù)比較

圖1 有核細(xì)胞計(jì)數(shù)

討 論

《臍帶血造血干細(xì)胞庫(kù)技術(shù)規(guī)范》規(guī)定：臍帶血冷凍保存溫度不高于-135℃，AABB（美國(guó)血庫(kù)協(xié)會(huì)）要求：臍帶血冷凍保存溫度不高于-150℃，我們使用的氣相罐內(nèi)最高溫度約為-188℃，高于以上標(biāo)準(zhǔn)，符合要求。同時(shí)由結(jié)果可知：保存在液相和氣相中的臍帶血造血干細(xì)胞的凍存質(zhì)量沒(méi)有差異，這表明：氣相液氮罐內(nèi)保存臍帶血能夠達(dá)到與在液氮中保存相同的效果，相對(duì)于傳統(tǒng)的浸沒(méi)在液氮中的保存而言，氣相保存方式減少了在標(biāo)本存取時(shí)產(chǎn)生液氮迸濺的可能，對(duì)操作人員更加的安全；同時(shí)還能避免因液氮的介質(zhì)作用而造成標(biāo)本間的交叉污染。

圖2 CD34+及有核細(xì)胞活性

圖3 CFU-GM培養(yǎng)結(jié)果

通過(guò)本次研究還表明：在低于-188℃的溫度范圍內(nèi)，保存于氣相罐內(nèi)不同位置臍帶血的凍存質(zhì)量也無(wú)差異，這也為臍帶血的凍存方式和質(zhì)量管理提供了重要的數(shù)據(jù)支持。

本研究還值得進(jìn)一步深入探索，由于長(zhǎng)期在液氮中凍存的臍帶血造血干細(xì)胞樣本的質(zhì)量已被證實(shí)不會(huì)存在差異[7]，而本研究所使用的冷凍樣本均是凍存時(shí)間未超過(guò)兩年的，通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知：在這個(gè)時(shí)期內(nèi)，保存于氣相罐內(nèi)不同位置臍帶血的凍存質(zhì)量無(wú)差異，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，其保存效果是否仍無(wú)差異，需要我們做一個(gè)長(zhǎng)期的觀察和統(tǒng)計(jì)。另外，在液氮罐的氣相環(huán)境中，是否可以真正避免標(biāo)本間的交叉污染還需要繼續(xù)通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突