抗-D免疫球蛋白預防RhD血型不合胎兒新生兒溶血病的研究進展*

范秀 肖軍 李翠瑩

RhD母嬰血型不合新生兒溶血?。╤emolytic disease of the fetus and newborn，HDFN）發(fā)生率僅次于ABO血型不合，但其病情重，并發(fā)癥風險高，出生前易致流產(chǎn)、死胎、胎兒水腫等，出生后易并發(fā)重度貧血、高膽紅素血癥、膽紅素腦病等，因此HDFN的預防愈顯重要。預防HDFN的策略包括：盡量避免胎兒紅細胞進入母體、降低母親致敏機會、減少母體抗體的產(chǎn)生和對產(chǎn)生抗體者設法中和抗體、防止抗原抗體結(jié)合等。目前認為最有效的預防方法是使用抗-D免疫球蛋白（anti-D immune globulin，抗-D Ig）防止母親致敏，現(xiàn)將其研究進展做一綜述。

1 抗-D免疫球蛋白預防HDFN的機制 應用抗-D Ig預防抗-D抗體引起的HDFN效果顯著，目前認為抗-D Ig預防HDFN的作用機制是抗體介導的免疫抑制機制（antibody-mediated immune suppression，AMIS）[1]。近一個世紀的研究中，基于不同機制的AMIS作用在不同的動物模型中不斷被發(fā)現(xiàn)，其中與抗-D Ig相關(guān)的機制主要有以下幾個方面。

1.1 紅細胞清除：在免疫系統(tǒng)識別前，抗-D Ig即能促進單核吞噬系統(tǒng)（尤其是巨噬細胞）吞噬和清除母體循環(huán)中的來源于胎兒的RhD抗原陽性紅細胞（RhD+紅細胞）[2]。在紅細胞表面結(jié)合的IgG與效應細胞表面IgG Fc段受體（FcγR）結(jié)合后引發(fā)吞噬作用中，抗-D Ig起到免疫調(diào)理作用（圖1）。雖然IgG還可通過促進紅細胞表面的補體激活，導致紅細胞溶解或補體受體介導的吞噬作用加速紅細胞清除，但抗-D Ig本身并不激活補體。這說明FcγR介導的吞噬作用可能是抗-D Ig引導的紅細胞清除的主要機制[3]。

圖1 抗-D Ig介導的RhD+紅細胞清除作用

1.2 表位封閉/空間位阻：在綿羊紅細胞（SRBC）免疫的小鼠模型研究中有大量證據(jù)表明，表位封閉/空間位阻可能在介導AMIS作用中起主要作用[4,5]。表位封閉/空間位阻假說認為IgG掩蔽抗原表位從而阻止抗原被特異性B細胞受體（BCR）識別[6]。當使用抗-D Ig時，抗-D Ig與RhD+ RBC結(jié)合后，能有效抑制RhD+ RBC被特異性B細胞識別，從而抑制免疫引起的溶血反應（圖2A）。

1.3 FcγRⅡB受體介導B細胞抑制：抗體Fc段受體（Fc gamma receptor，F(xiàn)cγR）屬于免疫球蛋白超家族，是一類與免疫球蛋白Fc段結(jié)合的主要表達于白細胞表面的糖蛋白，在功能上分為活化性受體和抑制性受體兩類。人類FcγR系統(tǒng)相對復雜，主要包括FcγRⅠ、FcγRⅡ和FcγRⅢ三個亞群，每個亞群又可分為多種亞型，同時存在多個異構(gòu)體?；罨訤cγR受體種類較多，如FcγRⅠA、FcγRⅡA和FcγRⅢA，主要通過偶聯(lián)含有免疫受體酪氨酸激活基序（ITAM）的γ二聚體傳遞激活信號，介導免疫反應。在人體內(nèi)抑制性FcγR只有一種，即Fc段受體ⅡB（Fc gamma receptor ⅡB，F(xiàn)cγRIIB），F(xiàn)cγRⅡB通過自身分子胞漿區(qū)的免疫受體酪氨酸基抑制基序（ITIM）傳遞抑制信號。人類FcγRⅡB 存在兩種主要異構(gòu)體分子FcγRⅡB1和B2。FcγRⅡB1主要表達于B細胞表面，抑制B細胞激活、增殖、產(chǎn)生抗體；FcγRⅡB2主要由單核細胞和中性粒細胞表達，參與調(diào)節(jié)炎癥反應，具有較強的吞噬復合物功能，并調(diào)控細胞因子釋放。FcγRⅡB介導的B細胞抑制理論指出，抗-D Ig與紅細胞抗原形成免疫復合物時，抗體Fc段與其B細胞表面的受體結(jié)合，其中抑制性受體FcγRⅡB1與BCR交聯(lián)，該受體位于胞漿區(qū)的ITIM與BCR的ITAM近距離接觸時，該復合物傳遞抑制信號，進而以抗原特異性的方式抑制B細胞激活、增殖和產(chǎn)生抗體（圖2B）。

圖2 其他抗-D Ig介導的免疫抑制機制

1.4 抗-D免疫球蛋白糖基化：抗-D Ig介導人紅細胞的清除作用受FcγRⅢ多態(tài)性影響。除FcγRⅢ自身遺傳變異外，抗-D Ig每個Cγ2區(qū)域谷氨酰胺（Asn）297位點的N-糖基化修飾水平對抗-D Ig與Fc段受體（FcγR）的相互作用產(chǎn)生影響。去除Fc段糖成分后，抗-D Ig與Fc段受體間相互作用被抑制，這同時與補體激活及抗體依賴性細胞毒作用（ADCC）相關(guān)?？?D Ig的多糖結(jié)構(gòu)被認為在實現(xiàn)AMIS中發(fā)揮關(guān)鍵效能。由于抗-D Ig Fc段Asn297位點處的多糖僅能與FcγRⅢAsn162位點處的多糖產(chǎn)生相互作用，故抗-D Ig Fc段發(fā)生核心巖藻糖基化對抗-D Ig與FcγRⅢA和FcγRⅢB的結(jié)合有特異性影響，但對其他Fcγ受體無明顯作用。由于無核心巖藻糖基化抗體與FcγRⅢA結(jié)合能力明顯增強，故核心巖藻糖基化缺失顯著促進IgG介導的ADCC作用。而抗-D Ig的Fc段核心巖藻糖基化水平已被證明與HDFN嚴重程度相關(guān)，巖藻糖基化水平越低HDFN越嚴重。因此，認識抗-D Ig的Fc段糖基化修飾水平對于確定HDFN嚴重程度及了解疾病的潛在機制是至關(guān)重要的[7，8]。

1.5 其他假說：除上述免疫學機制外還有其他一些假說試圖解釋抗-D Ig作用的機理，如免疫漂移、細胞因子效應及T細胞抑制等[9，10]。最近有證據(jù)表明，抗原調(diào)變可能是AMIS發(fā)生的另一機制，此反應不依賴于RBC清除，而是RBC表面抗原表位減少或丟失，使循環(huán)中的RBC持續(xù)呈抗原陰性，從而避免免疫系統(tǒng)識別和殺傷[1，11]。但該反應只在RBC表達單一外源性抗原的小鼠模型中被發(fā)現(xiàn)，尚不清楚RBC同時表達多個抗原時，抗原調(diào)變反應能否實現(xiàn)[12-14]。未來的研究仍需將重點放在進一步確定抗-D IgG相關(guān)的AMIS作用，并確保產(chǎn)生有效的治療。

2 使用抗-D免疫球蛋白的臨床指征 孕婦懷有RhD+胎兒是否產(chǎn)生抗-D抗體、是否發(fā)生HDFN, 首先取決于胎兒紅細胞進入母體循環(huán)的時間、數(shù)量、概率，以及母體對胎兒紅細胞的免疫反應性, 因此檢測胎-母出血量是診斷、預防RhD HDFN的基礎。妊娠過程中，胎兒紅細胞通過胎盤進入母親體內(nèi)稱為胎母出血（fetal-to-maternal hemorrhage，F(xiàn)MH）[15]?？?D Ig預防的目的是減少胎母出血刺激母體產(chǎn)生抗-D抗體使母親致敏的幾率。凡是能引起胎兒紅細胞進入母體的事件均需要進行抗-D Ig預防，包括產(chǎn)前致敏事件（如羊膜穿刺術(shù)、葡萄胎吸引術(shù)、宮內(nèi)手術(shù)等）、RhD+胎兒分娩后、人工剝離、胎兒宮內(nèi)死亡及產(chǎn)婦紅細胞回收回輸?shù)?。同時為避免懷有RhD抗原陰性（RhD－）胎兒的RhD－母親進行不必要的抗-D Ig預防治療，需對RhD－孕婦進行胎兒RHD基因的無創(chuàng)性產(chǎn)前檢查（Non-invasive prenatal testing，NIPT），即檢測孕婦外周血中的胎兒游離DNA （Cell-free fetal DNA，cff DNA）[16-18]。有研究表明引入胎兒RHD基因的無創(chuàng)性產(chǎn)前檢查，僅對懷有RhD+胎兒的孕婦進行預防后，抗-D Ig的使用量減少約25.3%[19]、29%[20]。

3 抗-D免疫球蛋白的臨床應用 抗-D Ig的應用經(jīng)歷了產(chǎn)后預防，產(chǎn)前出血預防及常規(guī)產(chǎn)前預防。未應用抗-D免疫球蛋白之前，懷有ABO血型與母體相容、RhD+的胎兒時，RhD－孕婦致敏產(chǎn)生抗-D的概率是16%；懷有ABO血型與母體不相容、RhD+的胎兒時，RhD－孕婦致敏產(chǎn)生抗-D的概率是2%；總體來看，懷有RhD+胎兒的RhD－孕婦致敏產(chǎn)生抗-D的概率是13.2%[21]?，F(xiàn)最新《BCSH guideline for the use of anti-D immunoglobulin for the prevention of haemolytic disease of the fetus and newborn》（英國血液學標準委員會預防HDFN抗-D Ig應用指南）英國指南[22]：建議對孕齡＜12周的異位妊娠、葡萄胎、治療性終止妊娠以及子宮反復出血、大量出血或伴有腹痛的出血的RhD－孕婦預防注射，注射劑量≥250 IU。對孕齡12～20周發(fā)生致敏事件的孕婦注射≥250 IU 抗-D Ig，均不需做FMH檢測；孕齡20周后發(fā)生致敏事件后注射≥500 IU抗-D Ig，未致敏的RhD－孕婦發(fā)生了致敏事件均做FMH檢測，必要時追加注射適量抗-D Ig[23]。

所有未致敏的RhD－孕婦均做常規(guī)產(chǎn)前抗-D預防（routine antenatal anti-D prophylaxis，RAADP）注射，采用28周的單劑量1500 IU方案或28周和34周的雙劑量各500 IU方案均可；孕后期進行RAADP后，RhD－孕婦致敏產(chǎn)生抗-D的概率是0.37%[24]。嬰兒出生后采集臍血做ABO和RhD血型鑒定，一旦證實嬰兒為RhD+，所有此前未致敏的RhD－產(chǎn)婦均應在產(chǎn)后72 h內(nèi)注射≥500 IU 抗-D Ig，產(chǎn)婦做FMH檢測，并根據(jù)試驗結(jié)果決定是否追加注射；產(chǎn)后72 h內(nèi)應用合適劑量的抗-D Ig后，RhD－孕婦致敏產(chǎn)生抗-D的概率是1%～2% 。注射抗-D Ig時間為致敏事件發(fā)生＜72 h內(nèi)，因故錯過該時限，≤10 d內(nèi)注射仍有一定的保護作用。500 IU劑量的標準抗-D Ig最高保護4 mL胎兒紅細胞，1250 IU最高保護10 mL，1500 IU最高保護12 mL。按每1 mL胎兒紅細胞給予125 IU的公式計算額外的抗-D免疫球蛋白劑量，將出生后已給予的抗-D Ig計算在內(nèi)，為避免不同批次產(chǎn)品的免疫暴露，應選擇和已使用標準劑量抗-D Ig統(tǒng)一批次的產(chǎn)品。

4 問題與展望 新生兒溶血病的發(fā)病機制通常與母嬰血型不合相關(guān)，其中，Rh血型不合引起的新生兒癥狀最為嚴重，尤其是抗原性最強的D抗原，可引起嚴重的溶血反應。目前預防HDFN最有效的方式是產(chǎn)前、產(chǎn)后和常規(guī)使用抗-D Ig，能明顯降低胎兒和新生兒溶血病的風險。如何有效評估胎兒是否存在發(fā)生HDFN的風險，并及時應用抗-D Ig預防治療，是現(xiàn)階段最需要注意的問題。胎兒血型產(chǎn)前基因診斷對HDFN的預防和治療具有重要意義。但仍存在以下局限性：①國內(nèi)外雖然在無創(chuàng)檢測胎兒血型基因方面取得了一定進展，仍缺乏提取孕婦血漿中cff DNA的統(tǒng)一標準，cff DNA提取含量低導致檢測假陰性，需通過同時檢測內(nèi)部對照物加以校正，如RHD陰性男胎的Y染色體基因序列（sry、dby和ttty2）和胎兒基因的短串聯(lián)重復序列及低甲基化啟動子序列等內(nèi)部對照物已被有效地用于胎兒內(nèi)部標記物；②不同種族之間的RHD基因存在異質(zhì)性，國外適用的RHD基因的擴增方法不一定適合國人，需設計出符合我國人群血型基因的引物；③由于母體或胎兒遺傳背景中存在無活性的假基因（RHDψ或雜交RHD-CE-D），檢測結(jié)果可能會呈假陽性，避免攜帶RHDψ或雜交RHD-CE-D基因的個體出現(xiàn)假陽性結(jié)果，使用外顯子4或5中的RHD特異性引物辨別RHDψ或雜交RHD-CE-D個體中的野生型RHD核苷酸序列和單核苷酸多態(tài)性（SNPs）[25]。針對RHD血型不合HDFN的診療關(guān)鍵是及早檢查、及時確診并使用抗-D Ig預防治療。越早進行基因檢測，越能有效預防HDFN的發(fā)生。利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突