益生菌發(fā)酵南瓜漿的研究

彭興興

（1.江門職業(yè)技術(shù)學(xué)院 材料技術(shù)系，廣東 江門 529030；2.廣東省綠色高性能新材料研發(fā)工程技術(shù)研究中心，廣東 江門 529030）

南瓜是一種葫蘆科蔓性植物，其營(yíng)養(yǎng)豐富，含有人體所需的氨基酸、多糖、類胡蘿卜素、礦質(zhì)元素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有輔助降血脂、輔助降血糖、抗腫瘤、抗氧化等多種藥用價(jià)值[1-5]。根據(jù)聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)庫(kù)，2014年我國(guó)南瓜總產(chǎn)量超過(guò)3 000萬(wàn)t，生產(chǎn)面積110萬(wàn)hm2，南瓜資源十分豐富[6]。益生菌廣泛存在于自然界中，是一類可以利用碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌總稱[7]。益生菌具有調(diào)節(jié)胃腸道菌群平衡，改善人體消化吸收系統(tǒng)，降低膽固醇等生物保健功能[8-11]?，F(xiàn)今，發(fā)酵果蔬汁飲料發(fā)展迅猛[12-13]，已有多款同類產(chǎn)品上市，并且深得廣大消費(fèi)者青睞，如豆樂(lè)奇。由于各種微生物胞內(nèi)的酶系統(tǒng)是不同的，代謝途徑和產(chǎn)物也不同，對(duì)環(huán)境的生存適應(yīng)能力也各不同，存在明顯的生理特性差異，而這些最終將影響到食品的風(fēng)味和口感[14]。開發(fā)功能性益生菌發(fā)酵飲品，可以提高南瓜的精深加工附加值，豐富南瓜的產(chǎn)品形式。因此，從眾多微生物中篩選出比較適用于南瓜發(fā)酵的菌種就顯得特別有意義。本實(shí)驗(yàn)以南瓜為原料進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)合活菌數(shù)、產(chǎn)酸速率、風(fēng)味和口感等方面對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行評(píng)價(jià)，篩選出適用于南瓜漿發(fā)酵的菌株，為開發(fā)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較好的發(fā)酵南瓜產(chǎn)品提供一定技術(shù)借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蜜本南瓜：市售；瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus，LH），腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides，LM），嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus，LA），鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnose，LR）：來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室；MRS固體培養(yǎng)基：廣州環(huán)凱生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SZX超凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；WH-2微型渦流混合儀：上海瀘西分析儀器廠；pHS-25型酸度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；JY2002型電子天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀表公司；Genex移液器：寶予德（中國(guó)）有限公司；YX-280高壓滅菌鍋：上海三申醫(yī)療器械有限公司；PYX-DHS隔水式保溫箱：上海博泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；JMS-500膠體磨：廊坊市廊通機(jī)械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 理化指標(biāo)測(cè)定

pH值：采用pHS-25型pH計(jì)進(jìn)行測(cè)定；可滴定酸度：參考GB/T 12456—2008《食品中總酸的測(cè)定》；活菌數(shù)：參考GB 4789.35—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》，采用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定；還原糖：參考GB/T 5009.7—2008《食品中還原糖的測(cè)定》，采用直接滴定法，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次。

1.3.2 感官評(píng)價(jià)

參考文獻(xiàn)[15]，并作適當(dāng)修改，選擇評(píng)分人員10人對(duì)發(fā)酵南瓜漿進(jìn)行打分，滿分5分，結(jié)果取平均值，感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

表1 發(fā)酵南瓜漿感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standards of fermented pumpkin pulp

1.3.3 南瓜漿發(fā)酵工藝流程及操作要點(diǎn)

南瓜→清洗→去皮、去囊→切片→打漿→滅菌→冷卻→接種→發(fā)酵→成品

南瓜漿的制備：選擇成熟度高的新鮮南瓜，用清水沖洗后，先將南瓜去皮去囊，然后切成條狀，之后再切成片狀；按照南瓜∶水=1∶1（g∶mL）的料液比進(jìn)行打漿，過(guò)膠體磨至果肉無(wú)明顯顆粒。取100 mL分裝于250 mL經(jīng)滅菌處理的潔凈錐形瓶中，硅膠塞密封，制備32瓶。

南瓜漿加熱殺菌：在90～95 ℃、10～15 min的條件下進(jìn)行滅菌處理，以殺滅南瓜漿中有害微生物。

接種、發(fā)酵：將滅菌后的南瓜漿冷卻至37 ℃左右，于無(wú)菌操作臺(tái)分別接種LA、LM、LH、LR各8瓶，初始活菌數(shù)控制為106CFU/mL，在37 ℃恒溫條件下發(fā)酵48 h。

2 結(jié)果與分析

2.1 各菌種在南瓜漿發(fā)酵過(guò)程中活菌數(shù)的變化

根據(jù)文獻(xiàn)資料[16-17]和實(shí)驗(yàn)室條件，選擇LA、LM、LH和LR這4種單菌菌株在相同的條件下發(fā)酵南瓜，并進(jìn)行對(duì)比分析。從接種開始計(jì)為0 h，發(fā)酵過(guò)程中間隔取樣，分別測(cè)定活菌數(shù)變化，結(jié)果如圖1 所示。由圖1可以看出，LH發(fā)酵較快，調(diào)整期非常短，迅速就進(jìn)入了對(duì)數(shù)期，菌體數(shù)目呈幾何級(jí)增長(zhǎng)，在整個(gè)對(duì)數(shù)期內(nèi)，LH的活菌數(shù)對(duì)數(shù)值由最初的6.1增長(zhǎng)至8.4，至發(fā)酵12 h后，開始進(jìn)入穩(wěn)定期。與LH不同，LR、LA和LM在發(fā)酵的前4 h內(nèi)處于調(diào)整期，菌體數(shù)變化不大。有研究表明，調(diào)整期的長(zhǎng)短與菌種、菌齡、培養(yǎng)條件等密切相關(guān)[18]。LM、LA在4～12 h處于菌體細(xì)胞數(shù)目高速增長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期，而后進(jìn)入穩(wěn)定期。從整個(gè)變化曲線來(lái)看，LR的發(fā)酵特性較其他3種表現(xiàn)得更有優(yōu)良，在經(jīng)過(guò)4 h的調(diào)整期后，菌體開始迅速增長(zhǎng)，至發(fā)酵結(jié)束，菌體數(shù)最多，菌體數(shù)對(duì)數(shù)值增長(zhǎng)至9.0，是初始活菌的1 000倍左右。

圖1 南瓜漿發(fā)酵過(guò)程中活菌數(shù)的變化Fig.1 Change of viable count during pumpkin pulp fermentation

2.2 各菌種對(duì)南瓜漿發(fā)酵過(guò)程中pH值的影響

發(fā)酵過(guò)程中pH值的變化如圖2所示。由圖2可以看出，這4種菌的pH值變化趨勢(shì)基本相同，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，pH逐漸下降，最后則趨于平緩，這一變化與發(fā)酵過(guò)程中活菌數(shù)的變化是相互對(duì)應(yīng)的，也與丘裕等[19]的研究結(jié)果相類似，可把這一過(guò)程大致分為發(fā)酵初期、發(fā)酵旺盛期和發(fā)酵末期。在發(fā)酵初期，pH值變化緩慢，發(fā)酵速度相對(duì)較慢；發(fā)酵進(jìn)入旺盛期，pH值下降很快，發(fā)酵達(dá)到高峰；至發(fā)酵末期，pH值變化又趨緩。在發(fā)酵開始的前4 h內(nèi)，LA、LM、LR由于處于調(diào)整期，增長(zhǎng)緩慢，所以生成乳酸的量較少，pH值變化不明顯。在發(fā)酵4 h之后，LA、LM、LR進(jìn)入對(duì)數(shù)期，菌體細(xì)胞數(shù)呈幾何增加，微生物開始大量消耗南瓜漿中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，利用碳水化合物發(fā)酵生成大量乳酸，使得內(nèi)部環(huán)境pH值快速下降。24 h后，菌體處于穩(wěn)定期，可發(fā)酵糖含量已經(jīng)大量減少，微生物增殖率和死亡率趨于平衡，活菌數(shù)基本保持不變，pH值的下降趨勢(shì)開始變得緩慢。LH由于處于調(diào)整期的時(shí)間短，迅速地就進(jìn)入了對(duì)數(shù)期，所以，在發(fā)酵的前4 h，pH值下降速度要比其他3種益生菌快，至發(fā)酵12 h后，菌體數(shù)基本維持不變，pH值下降趨勢(shì)開始變得緩慢。

圖2 南瓜漿發(fā)酵過(guò)程中pH值的變化Fig.2 Change of pH value during pumpkin pulp fermentation

2.3 各菌種對(duì)南瓜漿發(fā)酵過(guò)程中酸度的影響

圖3 南瓜漿發(fā)酵過(guò)程中酸度的變化Fig.3 Change of acidity during pumpkin pulp fermentation

發(fā)酵過(guò)程中酸度的變化如圖3所示。從圖3可知，一方面，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，南瓜漿的酸度不斷增大，產(chǎn)酸量不斷增多，這一變化與pH值的不斷下降是相互對(duì)應(yīng)的。另一方面，不同菌種的產(chǎn)酸量和產(chǎn)酸速率并不一相同，這說(shuō)明各菌種的產(chǎn)酸能力存在差異性，而這本身與菌種理化特性不同是有關(guān)系的。發(fā)酵前12 h內(nèi)，LH產(chǎn)酸速度快于其他菌株，產(chǎn)酸量增加了近10倍（由0.037 g/100 g增加至0.33 g/100 g），發(fā)酵至32 h后，產(chǎn)酸量趨于穩(wěn)定，這與后期pH值的變化是一致的。在發(fā)酵剛開始的前4 h內(nèi)，LR、LM、LA的產(chǎn)酸量基本保持不變，這與它們處于調(diào)整期相吻合。發(fā)酵至8 h后，LA、LR和LM產(chǎn)酸速度快于LH，其中又以LA的產(chǎn)酸速度最快，到發(fā)酵48 h時(shí)，產(chǎn)酸量達(dá)到由最初的0.032 g/100 g增加至1.24 g/100 g，是最初的40倍。LH在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)酸趨勢(shì)與LM類似，發(fā)酵至32 h后，產(chǎn)酸量也趨于穩(wěn)定，分別增長(zhǎng)了25倍和19倍。而LR在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)酸趨勢(shì)與LA相似，到發(fā)酵結(jié)束時(shí)，產(chǎn)酸量增長(zhǎng)了32倍。從整個(gè)產(chǎn)酸量來(lái)看，LA和LR的產(chǎn)酸量要高于LM和LH。

2.4 各菌種對(duì)南瓜漿發(fā)酵過(guò)程中還原糖含量的影響

糖代謝對(duì)益生菌具有重要的生理學(xué)價(jià)值，益生菌最常用的糖類就是葡萄糖和果糖[20]，多糖和葡萄糖是南瓜的主要糖類物質(zhì)，而在發(fā)酵過(guò)程中大部分活性多糖能被保留下來(lái)，葡萄糖則被微生物消耗利用[21]。因此，研究發(fā)酵過(guò)程中其還原糖的變化情況顯得很有必要。發(fā)酵過(guò)程中還原糖的變化結(jié)果如圖4所示。從圖4可以看到，在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，還原糖含量隨著發(fā)酵的進(jìn)行是逐漸降低的，這是由于益生菌代謝消耗南瓜漿中某些糖類物質(zhì)，轉(zhuǎn)化成乳酸等產(chǎn)物所導(dǎo)致的結(jié)果。發(fā)酵前期，由于微生物快速增長(zhǎng)繁殖，菌株消耗還原糖的速率加快，到了發(fā)酵后期，由于微生物數(shù)量保持不變，還原糖消耗量減少變慢。發(fā)酵前12 h內(nèi)，LR還原糖的消耗量快于其他菌株，還原糖的含量下降了37.21%（由3.01 g/100 g下降至1.89 g/100 g）。發(fā)酵至24 h后，LA、LM、LR、LH還原糖含量下降趨勢(shì)開始變緩，這與菌體處于穩(wěn)定期是有關(guān)系的。至發(fā)酵48 h，還原糖含量分別下降了56.48%、52.82%、48.17%、44.85%。

圖4 南瓜漿發(fā)酵過(guò)程中還原糖的變化Fig.4 Change of reducing sugar during pumpkin pulp fermentation

2.5 不同菌種發(fā)酵南瓜漿的感官評(píng)定

圖5 不同菌種發(fā)酵南瓜漿感官評(píng)定結(jié)果Fig.5 Sensory evaluation results of fermented pumpkin pulp by different strains

發(fā)酵南瓜漿的感官評(píng)分結(jié)果如圖5所示。從顏色和光澤方面看，LH和LR評(píng)分高于LA和LM。從組織狀態(tài)方面看，4種菌株發(fā)酵的南瓜漿數(shù)據(jù)相差較小，無(wú)顯著性差異。從氣味方面看，LR的評(píng)分是最高的，達(dá)4.8分，其次是LH和LA，分別是4.6分和3.9分，LM的評(píng)分是最低的，只有3.6分。原因是評(píng)定員認(rèn)為它沒(méi)有了南瓜清香味，反而帶來(lái)一股異味，令人不悅。從滋味上看，最好的是LH，其次是LR，LA和LM的評(píng)分較低。所以，從總體上來(lái)看，LH、LR較LA和LM更適合發(fā)酵南瓜。

3 結(jié)論

發(fā)酵過(guò)程中，瑞士乳桿菌調(diào)整期并不明顯，接種后便迅速進(jìn)入對(duì)數(shù)期，發(fā)酵速度要快于其他菌株。而鼠李糖乳桿菌在發(fā)酵過(guò)程中，其活菌數(shù)對(duì)數(shù)值最高，達(dá)9.0 lg（CFU/mL）。

發(fā)酵初期，pH值變化不是特別大；進(jìn)入旺盛期，pH值下降明顯；發(fā)酵末期，pH值變化趨緩。另外，在產(chǎn)酸量和產(chǎn)酸速率上不同菌株存在差異性，發(fā)酵前期，瑞士乳桿菌產(chǎn)酸速率和產(chǎn)酸量較快。至發(fā)酵結(jié)束，嗜酸乳桿菌和鼠李糖乳桿菌整體產(chǎn)酸量要多于瑞士乳桿菌和腸膜明串珠菌。在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，菌株利用還原糖的能力存在個(gè)體差異，嗜酸乳桿菌和鼠李糖乳桿菌優(yōu)于瑞士乳桿菌和腸膜明串珠菌。此外，活菌數(shù)、pH、還原糖含量和酸度之間的變化存在一定內(nèi)在聯(lián)系。

四種發(fā)酵火南瓜漿的感官評(píng)價(jià)表明，瑞士乳桿菌、鼠李糖乳桿菌總體評(píng)分高于其他兩種，更適合發(fā)酵南瓜漿。所以從產(chǎn)酸、活菌數(shù)、感官等方面綜合考慮，最終確定發(fā)酵菌種為瑞士乳桿菌、鼠李糖乳桿菌。