某核心種豬場豬胸膜肺炎放線桿菌的分離鑒定與藥敏試驗(yàn)

王 迪，李澤偉，段倩倩，李 國，程家園，李 郁

（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，安徽 合肥 230036）

豬傳染性胸膜肺炎（Porcine contagious pleuropneumoniae, PCP）是由豬胸膜肺炎放線桿菌（Actinobczcillus pleuropeumonicze, APP）引致的豬的一種高度接觸性的呼吸道傳染病，對生豬生產(chǎn)的影響因APP血清型、環(huán)境和機(jī)體免疫因素不同等而異，主要臨診特征為急性出血性、纖維素性胸膜肺炎和慢性纖維素性、壞死性胸膜肺炎[1]。PCP呈世界性分布，傳播力強(qiáng)，尤其是近年隨著我國豬場規(guī)模化、集約化的發(fā)展及跨區(qū)頻繁引種，其發(fā)病率和死亡率均有上升，目前流行日漸嚴(yán)重，現(xiàn)已成為我國豬群中主要的細(xì)菌性呼吸道傳染病之一，造成了養(yǎng)豬業(yè)巨大經(jīng)濟(jì)損失。APP根據(jù)莢膜多糖（CPS）和脂多糖（LPS）抗原性差異，可分為15種血清型；依照生長是否需要煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD或V因子），又分為兩個(gè)生物型，即生物Ⅰ型（NAD依賴型）和生物Ⅱ型（非NAD依賴型），其中血清1～12型和15型歸為生物Ⅰ型，血清13型和14型歸為生物Ⅱ型。不同國家或地區(qū)流行血清型并非一致，相同血清型之間臨床致病力也不盡相同，且不同血清型之間交叉保護(hù)力較弱，尤其是目前市場上存在的商品化疫苗僅涉及血清1、3和7型，致使疫苗免疫效果常不確實(shí)或免疫失敗，從而使該病的防制難度進(jìn)一步增大。

2020年7月，某核心種豬場260～300日齡后備母豬出現(xiàn)體溫升高、呼吸困難、咳嗽等癥狀，發(fā)病率為100%，病死率為4%。剖檢后其肺呈紫紅色，伴有出血，且在肺的心葉、尖葉和隔葉出現(xiàn)病灶，與正常組織界線分明，胸腔存在積液。通過對病原的分離鑒定，確定該豬場存在APP感染，并根據(jù)藥敏試驗(yàn)篩選出高敏藥物，試驗(yàn)結(jié)果不僅為豬場臨床治療及有效防控提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)也為區(qū)域性APP流行動態(tài)調(diào)查提供相應(yīng)參考。

1 材料與方法

1.1 病料來源

病料為某種豬場4份260～300日齡病死后備母豬肺臟，相關(guān)試驗(yàn)于2020年7—8月在安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物傳染病實(shí)驗(yàn)室開展。

1.2 主要試驗(yàn)材料

0.6 %酵母浸膏胰酪胨大豆瓊脂（TSA-YE）、0.6%酵母浸膏胰酪胨大豆肉湯（TSB-YE）購自紹興天恒生物科技有限公司；新生小牛血清購自北京索萊寶科技有限公司；瓊脂糖、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；2×Taq PCR Master Mix、DL 2 000 DNA Marker購自天根生化科技有限公司；17種抗生素（環(huán)丙沙星、諾氟沙星、氟苯尼考、氧氟沙星、頭孢唑林、頭孢曲松、鏈霉素、慶大霉素、丁胺卡那、復(fù)方新諾明、多西環(huán)素、紅霉素、阿莫西林、氨芐西林、青霉素、卡那霉素和四環(huán)素）購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.3 質(zhì)控菌株

金黃色葡萄球菌CMCC 26112、大腸桿菌CMCC 44113均購自中國藥品生物制品檢定所。

1.4 細(xì)菌的分離培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察

無菌采取4份病死豬肺臟接種于TSA-YE培養(yǎng)基（含5%小牛血清及1.5% NAD），采用需氧、微需氧、厭氧3種培養(yǎng)方式，置37 ℃條件下培養(yǎng)18～24 h，觀察細(xì)菌的生長情況，并挑取單個(gè)可疑菌落進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢，觀察其形態(tài)特征。

1.5 引物合成

參照文獻(xiàn)[2-4]設(shè)計(jì)PCR鑒定APP及其血清型、毒力基因型引物（表1）。引物均由合肥通用生物科技有限公司合成。

1.6 分離菌株的PCR鑒定

利用煮沸法提取分離菌基因組DNA作為模板，用于PCR鑒定APP。PCR反應(yīng)體系（25 μL）：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，模板DNA 5 μL，ddH2O 5.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，57 ℃ 90 s，72 ℃ 1 min，3個(gè)循環(huán)；95 ℃ 20 s，57 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后在凝膠成像儀上進(jìn)行觀察，并記錄結(jié)果。

1.7 APP NAD依賴試驗(yàn)

將鑒定為APP的分離株分別接種于NAD陽性（含5%小牛血清及1.5% NAD）和NAD陰性（只含5%小牛血清，不含NAD）的TSA-YE培養(yǎng)基上。同時(shí)用金黃色葡萄球菌單個(gè)菌落在TSA-YE培養(yǎng)基（只含5%小牛血清，不含NAD）上劃一橫線，再將鑒定為APP的分離株垂直接種于橫線兩側(cè)，置37 ℃條件下培養(yǎng)24 h后觀察其生長情況。

表1 PCR鑒定APP及其血清型、毒力基因型引物序列

1.8 APP血清型鑒定

參照1.6提取APP模板DNA，用于PCR鑒定血清型。PCR反應(yīng)體系（25 μL）：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，模板DNA 5 μL，ddH2O 5.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃5 min；95 ℃ 50 s，62 ℃ 50 s ，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后在凝膠成像儀上進(jìn)行觀察，并記錄結(jié)果。

1.9 APP毒力基因鑒定

參照1.6提取APP模板DNA，用于PCR鑒定4種毒力基因（ApxⅡ、ApxⅢ、ApxⅣ和Omp2）。ApxⅡ、ApxⅢ、Omp2基因PCR反應(yīng)體系：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，模板DNA 5 μL，ddH2O 5.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。ApxⅣ基因PCR反應(yīng)體系如下：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃ 10 min；94 ℃ 1 min、54.8 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后在凝膠成像儀上進(jìn)行觀察，并記錄結(jié)果。

1.10 APP毒力基因分析

將含目的基因片段的PCR產(chǎn)物純化后測序，采用MEGA 6.02軟件對獲得的毒力基因序列進(jìn)行序列同源性分析，并用Maximum Likeihood tree方法分別構(gòu)建APP的毒力基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。

1.11 藥物敏感性試驗(yàn)

采用Kirby-Bauer紙片法。將APP分離株培養(yǎng)物用0.5麥?zhǔn)媳葷峁苄Ｕ簼舛群?，在MHA培養(yǎng)基（含5%小牛血清及1.5% NAD）表面均勻涂布接種100 μL，室溫干燥5 min后，選擇17種藥敏紙片貼于瓊脂表面，置37 ℃條件下培養(yǎng)18～24 h后觀察結(jié)果。結(jié)果根據(jù)美國臨床試驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會（CLSI/NCCLS）2016版執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察

自每份病死豬肺臟中均分離1株細(xì)菌，共計(jì)4株。分離菌在TSA-YE培養(yǎng)基（含5%小牛血清及1.5% NAD）上培養(yǎng)24 h后，均呈圓形、表面光滑、灰白色半透明的水株樣菌落。厭氧培養(yǎng)與需氧培養(yǎng)時(shí)，細(xì)菌生長較快，微需氧培養(yǎng)次之；經(jīng)涂片染色鏡檢，分離菌為革蘭陰性短桿菌，兩端鈍圓，具有典型的多形性，呈細(xì)小短桿狀，少數(shù)為長絲狀，符合APP的形態(tài)學(xué)特征。

2.2 分離菌株的PCR鑒定

利用APP特異性引物對4株分離菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳檢測，陽性對照出現(xiàn)342 bp擴(kuò)增條帶、陰性對照無條帶出現(xiàn)，試驗(yàn)結(jié)果成立。4株分離菌PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與陽性片段大小均相符，確定為APP，分別命名為HB1、HB2、HB3和HB4（圖1）。

圖1 4株分離菌的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.3 APP NAD依賴試驗(yàn)

HB1、HB2、HB3和HB4菌株在NAD陽性的TSA-YE培養(yǎng)基上均生長良好，在NAD陰性的TSAYE培養(yǎng)基上均不生長。在金黃色葡萄球菌周圍均呈典型“衛(wèi)星現(xiàn)象”生長，愈靠近金黃色葡萄球菌菌落生長愈大，反之愈小，甚至不見菌落生長，均符合生物Ⅰ型APP特征。

2.4 APP血清型鑒定

利用8對不同血清型的APP引物對HB1、HB2、HB3和HB4菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，該4株生物Ⅰ型APP均獲得977 bp目的片段，與預(yù)期片段的大小相符，確定為血清8型（圖2）。

圖2 4株APP的血清型PCR鑒定結(jié)果

2.5 APP毒力基因鑒定

對HB1、HB2、HB3和HB4菌株的ApxⅡ、ApxⅢ、ApxⅣ和Omp2毒力基因進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果顯示，該4株APP均出現(xiàn)750 bp的Omp2目的條帶（圖3）和1 200 bp的ApxⅣ目的條帶（圖4），與預(yù)期結(jié)果一致，進(jìn)一步通過測序后上傳GenBank進(jìn)行比對，分別確定為Omp2和ApxⅣ毒力基因。但4株菌均未檢測到ApxⅡ和ApxⅢ毒力基因。

圖3 Omp2毒力基因的PCR鑒定

圖4 ApxⅣ毒力基因的PCR鑒定

2.6 APP毒力基因分析

序列同源性分析結(jié)果表明，HB1、HB2、HB3和HB4菌株之間的Omp2基因核苷酸序列的相似度為100%，高度同源，與11株APP參考菌株的相似度在98.6%～100%之間，其中與2株丹麥株（登錄號：U86677.1和U86681.1）、3株日本株（登錄號：AB007586.1、AB007585.1和AB007578.1）的相似度達(dá)100%，同源性很高（圖5）。HB1、HB2、HB3和HB4菌株之間的ApxⅣ基因核苷酸序列的相似度也為100%，高度同源，與9株APP參考菌株的相似度在96.4%～99.5%之間，其中與1株德國株（登錄號：CP001091.1）的相似度達(dá)99.8%，同源性也很高（圖6）。構(gòu)建的Omp2和ApxⅣ基因系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，HB1、HB2、HB3和HB4菌株的Omp2基因序列處于同一分支且與2株丹麥株（登錄號：U86677.1和U86681.1）、3株日本株（登錄號：AB007586.1、AB007585.1和AB007578.1）聚為同一分支（圖7）；ApxⅣ基因序列處于同一分支且與1株德國株（登錄號：CP001091.1）位于同一分支，遺傳關(guān)系均密切（圖8）。

圖5 Omp2毒力基因核苷酸序列的同源性比較

圖6 ApxⅣ毒力基因核苷酸序列的同源性比較

圖7 Omp2毒力基因核苷酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹分析

圖8 ApxⅣ毒力基因核苷酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹分析

2.7 藥物敏感性試驗(yàn)

根據(jù)CLSI/NCCLS執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)判斷，質(zhì)控菌株的抑菌圈大小在規(guī)定范圍內(nèi)。HB1、HB2、HB3和HB4菌株對環(huán)丙沙星、諾氟沙星、氟苯尼考、氧氟沙星、頭孢唑林、頭孢曲松均100%敏感，對青霉素、卡那霉素、四環(huán)素100%耐藥，對其他8種藥物也表現(xiàn)出不同程度耐藥（表2）。

表2 HB1—HB4菌株藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

APP主要定植于豬的呼吸道并且具有高度宿主特異性。調(diào)查顯示，在豬4周齡時(shí)APP即可定植其上呼吸道，而發(fā)病一般在6～12周齡之后的肥育期。帶菌豬和病豬是PCP的主要傳染源，傳播途徑主要為氣源感染，即通過豬只之間的直接接觸或短距離的飛沫傳播；還可通過被APP污染的車輛、工具、器械以及飼養(yǎng)人員流動等間接傳播；鼠類和鳥類也能傳播PCP。感染豬的鼻腔、扁桃體、支氣管和肺臟等部位是APP存在的主要場所。PCP雖多發(fā)于冬春季節(jié)，但易受外界因素影響，如氣溫驟變、濕度過高、通風(fēng)不良、飼養(yǎng)環(huán)境的突然改變、混群、轉(zhuǎn)群、擁擠、長途運(yùn)輸?shù)葢?yīng)激因素可促使本病的發(fā)生和流行。此外，豬群感染豬圓環(huán)病毒2型、豬藍(lán)耳病病毒、豬鏈球菌、副豬嗜血桿菌、多殺性巴氏桿菌等病原后，也可使其對APP的易感性增強(qiáng)[5]。

PCR技術(shù)鑒定APP，具有敏感性高、特異性強(qiáng)、診斷速度快的特點(diǎn)，是目前病原分子生物學(xué)診斷中常用的方法。本試驗(yàn)針對某核心種豬場260～300日齡后備母豬出現(xiàn)的病情，在掌握進(jìn)行相關(guān)信息的基礎(chǔ)上，包括飼養(yǎng)數(shù)量、飼養(yǎng)方式、免疫接種、發(fā)病時(shí)間、病程進(jìn)展、用藥情況、發(fā)病率與病死率等，以及發(fā)病時(shí)的臨床表現(xiàn)和病理剖檢變化，利用常規(guī)細(xì)菌學(xué)鑒定方法，對采集的4頭發(fā)病豬病料組織進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)與APP分離菌的生物型確定，應(yīng)用PCR技術(shù)對分離菌進(jìn)行APP及其血清型鑒定、毒力基因檢測以及分離菌之間親緣關(guān)系的確定。檢測結(jié)果表明，4份病料均分離出APP，且同為生物Ⅰ型、血清8型菌株，均檢測到毒力基因Omp2和ApxⅣ而無ApxⅡ、ApxⅢ，菌株之間的Omp2和ApxⅣ基因核苷酸序列相似度達(dá)100%，并處于系統(tǒng)發(fā)育樹的同一分支，4株APP分離菌高度同源，該豬場后備母豬出現(xiàn)的APP感染為同一菌株。APP血清型眾多，分布廣泛，不同國家和地區(qū)流行的優(yōu)勢血清型存在差異，即使是同一地區(qū)也會隨時(shí)間的遷移而發(fā)生變化。在國外，歐洲以2、3、7、8和9型為主；北美地區(qū)以1、3、5和7型為主；日本、韓國則以2、4和5型為主。1995—2004年韓國以血清2、5型最為流行，但至2012—2013年血清1、5型呈現(xiàn)優(yōu)勢。在國內(nèi)，優(yōu)勢血清型多集中于7、1和3型，其次為5、11、10和13型。山東地區(qū)以5、7和10型為主；湖北地區(qū)以13、1和11型為主；廣東地區(qū)以3、10型為主[6]。1996—2000年，多個(gè)省份地區(qū)血清1、3和7型處于優(yōu)勢，2015—2018年，在流行的APP血清型中又增加了5、10、11和13型[7]。本試驗(yàn)APP分離株為血清8型，盡管與目前主要的流行血清型不同，且相關(guān)報(bào)道不多，但由于APP各血清型之間交互免疫力差，現(xiàn)有的商品化疫苗不能對其感染提供保護(hù)，因此該血清型的出現(xiàn)應(yīng)引起高度重視，實(shí)時(shí)監(jiān)測APP血清型的動態(tài)流行情況，對于APP疫苗的研發(fā)以及預(yù)防該菌的感染具有重要意義。

對PCP的綜合防制措施主要包括加強(qiáng)飼養(yǎng)管理、藥物防治、預(yù)防接種等。免疫接種是預(yù)防本病的有效方法，但要根據(jù)具體情況選擇含有相對應(yīng)APP血清型的疫苗。對受威脅但未發(fā)病的豬群，可以進(jìn)行預(yù)防性給藥。對于發(fā)病豬群，早期及時(shí)治療是有效降低損失的方法。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，4株APP分離株對環(huán)丙沙星、諾氟沙星、氟苯尼考、氧氟沙星、頭孢唑林和頭孢曲松均100%敏感，可作為首選治療藥物，對青霉素、卡那霉素和四環(huán)素均100%耐藥，對鏈霉素、慶大霉素、丁胺卡那、復(fù)方新諾明、多西環(huán)素、紅霉素、阿莫西林和氨芐西林的耐藥率介于25%～75%。研究顯示，65株韓國分離株對頭孢噻呋、阿米卡星敏感，對四環(huán)素耐藥；148株塞爾維亞分離株對頭孢噻呋、恩諾沙星、氟苯尼考敏感，對四環(huán)素和鏈霉素耐藥；我國河南地區(qū)APP分離株對泰妙菌素、氨芐西林和頭孢噻呋鈉等6種藥物敏感，對替米考星、紅霉素、氟苯尼考等20種抗菌藥物完全耐藥，西南地區(qū)APP分離株對阿莫西林、頭孢噻肟和青霉素敏感，對氟苯尼考、替米考星和四環(huán)素等9種藥物耐受[8-10]。至此表明不同國家和地區(qū)APP分離株對抗菌藥物的感受性存在差異。由于不同地區(qū)、不同養(yǎng)豬場，即使同一養(yǎng)豬場在不同時(shí)間，其用藥方法有所不同，出現(xiàn)因抗生素的選擇壓力而導(dǎo)致APP對藥物的敏感性不同。因此，針對APP分離菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)以選擇合適藥物意義顯著。此外，本試驗(yàn)源自4頭病豬的APP分離株雖鑒定為同一菌株，但4株菌對鏈霉素、慶大霉素、丁胺卡那、復(fù)方新諾明、多西環(huán)素、紅霉素、阿莫西林和氨芐西林等8種抗生素的感受性有一定差異，這可能是由于抗生素的長期使用，引致環(huán)境中抗生素抗性基因（ARGs）豐度增高，而ARGs之間水平基因的不規(guī)則轉(zhuǎn)移可加速APP的抗性獲得，導(dǎo)致耐藥差異性的出現(xiàn)。