豬腹瀉相關(guān)的冠狀病毒檢測(cè)方法研究進(jìn)展

向 萌，陳弟詩，任玉鵬，王一丹

（1.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041；2.四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 成都 610041）

豬腹瀉病是危害養(yǎng)豬業(yè)主要的傳染病之一，其中以病毒性腹瀉的發(fā)生率最高、危害最嚴(yán)重[1]。冠狀病毒是引起仔豬腹瀉的重要病原，主要包括豬流行性腹瀉病毒 （Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒 （Transmissible gastroenteritis virus of swine, TGEV）、豬德爾塔冠狀病毒 （Porcine delta corona virus, PDCoV）和豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒（Swine acute diarrhea syndrome coronavirus, SADS-CoV）[2]。4種病原感染豬均以嘔吐、腹瀉、脫水和腸道出血為主要特征，且常常呈現(xiàn)隱性感染或多病原混合感染，給相關(guān)疫病的診斷帶來了困難。PEDV和TGEV是目前分布最廣的豬腹瀉病毒性病原，對(duì)哺乳仔豬致死率可達(dá)100%[3]，近5年來在我國四川、福建、吉林、陜西、甘肅、黑龍江、江蘇、山東、遼寧、廣西和河北等多個(gè)省份均有流行[4-6]。PDCoV自2012年首次發(fā)現(xiàn)于中國香港后迅速蔓延至世界各地，在我國豬群中檢出率日益增長(zhǎng)，成為危害我國養(yǎng)豬業(yè)的重要病原[7]。如2017—2018年，在河南地區(qū)豬腹瀉樣本中，PDCoV陽性率達(dá)35.06%，與PEDV混合感染率達(dá)24.03%[8]。此外，SADS-CoV也是近年出現(xiàn)的引起豬群消化道癥狀的一種新型豬冠狀病毒，在2016年于我國廣東首次發(fā)現(xiàn)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，僅2017年由這種病毒引起的國內(nèi)豬只死亡數(shù)達(dá)25 000頭，造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失[9-10]。

PEDV、TGEV、PDCoV和SADS-CoV均能引起仔豬腹瀉，具有相似的臨床癥狀和病理特征，還呈現(xiàn)出舊病新發(fā)、新病頻發(fā)的流行特點(diǎn)，給疾病的快速鑒別檢測(cè)帶來了巨大困難。此外，當(dāng)前國內(nèi)基層獸醫(yī)對(duì)仔豬病毒性腹瀉診斷時(shí)，往往優(yōu)先考慮為PEDV和TGEV感染，而忽視對(duì)PDCoV和SADS-CoV等新發(fā)病原的檢測(cè)。因此，本文對(duì)前述4種引起豬腹瀉的冠狀病毒檢測(cè)方法相關(guān)研究資料進(jìn)行總結(jié)，以期為豬病毒性腹瀉的快速診斷、精準(zhǔn)防控提供理論指導(dǎo)和技術(shù)參考。

1 病原分離培養(yǎng)法

病毒分離培養(yǎng)法是病毒性疾病傳統(tǒng)又重要的檢測(cè)手段，其優(yōu)點(diǎn)在于檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性和可靠性高，同時(shí)也為后續(xù)深入研究病原特性提供了重要材料。目前常用豬腎細(xì)胞（PK-15，IBRS2）和豬睪丸細(xì)胞（ST）培養(yǎng)TGEV。如陳煥春等[11]將陽性TGEV腸系膜淋巴結(jié)處理后在IBRS2細(xì)胞系中盲傳9代后出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變。自1988年Hofmann等[12]用非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero）成功分離PEDV，并且檢測(cè)可穩(wěn)定傳代后，這種方法便一直沿用至今。但當(dāng)前國內(nèi)外對(duì)PDCoV和SADS-CoV的分離培養(yǎng)體系尚未完全確定。有證據(jù)表明，PDCoV陽性樣品處理后，能在豬的近端腎小管細(xì)胞系（LLC-PK）中穩(wěn)定有效地增殖，并在連續(xù)傳代15次后，出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變[13]。雖然病毒分離培養(yǎng)法具有重要意義，但由于過程相對(duì)耗時(shí)，且不同毒株對(duì)宿主細(xì)胞的易感性和培養(yǎng)條件存在差異，因此該方法不適用于臨床上對(duì)病原的快速檢測(cè)。

2 血清學(xué)檢測(cè)法

2.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）是最常用的血清學(xué)診斷技術(shù)之一，對(duì)疾病的初步診斷和抗體監(jiān)測(cè)具有重要意義，主要包括間接ELISA、雙抗夾心ELISA和抗體捕獲ELISA等，而冠狀病毒高度保守的囊膜蛋白（Membrane, M）和核衣殼蛋白（Nucleocapsid protein,N）為冠狀病毒重要的結(jié)構(gòu)蛋白，均能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫，常被作為包被抗原。同時(shí)M、N蛋白氨基酸序列高度保守，不同冠狀病毒N蛋白氨基酸序列同源性在15%～30%之間，以此建立的ELISA檢測(cè)方法具有良好的特異性、敏感性及穩(wěn)定性。如楊朋霞等[14]以PEDV純化重組的N蛋白作為包被抗原建立了PEDV的間接ELISA方法，用該方法與商品化試劑盒檢測(cè)結(jié)果符合率達(dá)99.6%，此方法能在一定程度上反映豬群的抗體水平，但并不能真實(shí)反映豬體的免疫保護(hù)力，只有中和抗體才是真實(shí)反映豬只機(jī)體的抗病力指標(biāo)。因纖突蛋白（Spike protein, S） 在各冠狀病毒種內(nèi)或種間具有較高的遺傳變異性，也是介導(dǎo)病毒粒子進(jìn)入細(xì)胞和誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的關(guān)鍵。因此選用該蛋白保守區(qū)作包被抗原，可有效鑒別不同毒株引起的感染。例如：Thachol等[15]建立了以PDCoV S1蛋白保守區(qū)域作為抗原的間接ELISA方法并應(yīng)用于PDCoV抗體檢測(cè)，該方法不易與其他冠狀病毒發(fā)生交叉反應(yīng)，具有良好的特異性；此外，陳靜等[16]以純化的重組PEDV中國變異株S蛋白為包被抗原，建立了檢測(cè)PEDV流行株抗體的間接ELISA方法，該方法具有較高的特異性，與RT-PCR檢測(cè)結(jié)果符合率達(dá)100%，可能成為監(jiān)測(cè)PEDV流行情況的有效方法。

2.2 免疫層析技術(shù)

近年來免疫層析技術(shù)由于其特異、簡(jiǎn)便、快速的特點(diǎn)在獸醫(yī)臨床上被廣泛應(yīng)用，具有巨大的發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用前景。免疫層析技術(shù)是基于抗原抗體特異性反應(yīng)的一種新型膜檢測(cè)技術(shù)，通過肉眼可見的標(biāo)記物使檢測(cè)結(jié)果直接可觀。目前常見的免疫層析技術(shù)主要包括膠體金免疫層析技術(shù)、熒光免疫層析技術(shù)以及磁珠免疫層析技術(shù)等，其中PEDV和TGEV膠體金免疫層析技術(shù)在豬冠狀病毒的診斷中最為常見。如賈宇旻等[17]根據(jù)PEDV免疫BALB/c 小鼠后分泌的MAb中的 4H為檢測(cè)抗體、5A9 為捕獲抗體初步建立了檢測(cè) PEDV 的膠體金免疫層析技術(shù)，該方法最低檢測(cè)限為 7.8×103TCID50/mL，與RT-PCR法符合率達(dá)93%，為獸醫(yī)基層對(duì)PEDV的快速診斷提供了新的技術(shù)手段。但目前關(guān)于豬腹瀉相關(guān)的幾種新型冠狀病毒的免疫層析技術(shù)研究相對(duì)匱乏，仍需科研工作者不斷突破。

2.3 免疫熒光技術(shù)

免疫熒光技術(shù)是將免疫學(xué)方法與熒光標(biāo)記技術(shù)結(jié)合起來研究特異蛋白抗原在細(xì)胞內(nèi)分布的方法，通過熒光素標(biāo)記抗原或抗體的方法對(duì)組織、細(xì)胞內(nèi)的抗原或抗體進(jìn)行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)抗原定性、定位和定量的分析，該方法對(duì)病原的血清學(xué)檢測(cè)以及病原在組織細(xì)胞內(nèi)的動(dòng)態(tài)分布研究具有重要意義，但也存在方法耗時(shí)長(zhǎng)、對(duì)實(shí)驗(yàn)室及操作人員技術(shù)要求高等缺陷，而不適用于臨床樣本檢測(cè)。馬思奇等[18]早在1982年就用免疫熒光法檢查扁桃體應(yīng)用于活體診斷TGE，既適用于早期感染，也適用于慢性或隱性帶毒豬的診斷，對(duì)豬腹瀉病的早期診斷具有重要的意義。近年來免疫熒光技術(shù)在豬腹瀉相關(guān)冠狀病毒檢測(cè)中也在不斷發(fā)展，但目前主要見于PEDV和TGEV免疫熒光技術(shù)研究的報(bào)道。如朱蘊(yùn)暖等[19]利用TGEV N蛋白的單克隆抗體為一抗，熒光素FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG為二抗，建立了TGEV的間接免疫熒光檢測(cè)方法，該方法具有良好的特異性，為TGEV病原學(xué)檢測(cè)提供技術(shù)支撐，為TGEV感染細(xì)胞后的定位和動(dòng)態(tài)分布提供了有效的檢測(cè)手段，也為豬腹瀉相關(guān)冠狀病毒感染機(jī)制的研究打下前期基礎(chǔ)。

3 分子生物學(xué)檢測(cè)方法

3.1 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （Polymerase Chain Reaction,PCR）是目前檢測(cè)豬腹瀉相關(guān)冠狀病毒最常用的手段，其最大的特點(diǎn)是能將微量的DNA大幅擴(kuò)增，可用于檢測(cè)疑似感染豬的糞便、直腸拭子或腸道樣品中的基因組。通過保守基因M、N建立的豬冠狀病毒RT-PCR檢測(cè)方法，特異性好、準(zhǔn)確性高，可為疾病診斷提供更準(zhǔn)確、更科學(xué)的信息，但此方法在臨床上無法區(qū)分野毒株和疫苗株以及不同型毒株，因此針對(duì)S基因以及ORF3基因建立的RTPCR檢測(cè)方法對(duì)病原的分型以及深入的分子機(jī)制研究具有重要意義。如闞蕊慈等[20]根據(jù)PEDV野毒株和疫苗株ORF3基因的差異設(shè)計(jì)特異性引物，建立了可區(qū)分PEDV野毒株和疫苗株的多重RT-PCR方法，為PEDV的快速精準(zhǔn)檢測(cè)提供了有效的工具。此外，由于豬腹瀉相關(guān)的冠狀病毒在感染豬群后具有相似的臨床癥狀，眾多學(xué)者致力于對(duì)病原快速鑒別診斷的研究，多重RT-PCR技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，得到廣大學(xué)者的支持。如韋學(xué)雷等[21]根據(jù)PDCoV N基因、PEDV M基因和TGEV N基因序列，建立了能同時(shí)檢測(cè)3種豬冠狀病毒的多重RT-PCR方法，有良好的臨床應(yīng)用價(jià)值。黃海鑫等[22]根據(jù)PDCoV和SeACoV N基因建立的雙重RT-PCR方法，最低檢測(cè)量為4.73×101copies/μL，為兩種豬新型冠狀病毒快速檢測(cè)提供了新的技術(shù)手段。

3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)融合了PCR高靈敏性、DNA雜交的高特異性和光譜技術(shù)的高精確定量等優(yōu)點(diǎn)，通過檢測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)度直接對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行定性分析和定量分析。目前關(guān)于PEDV、TGEV和PDCoV的熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)已趨向成熟，國內(nèi)外眾多學(xué)者建立了多種針對(duì)單一或多個(gè)病原的熒光定量PCR檢測(cè)方法，如王以欣等[23]建立的基于雙啟動(dòng)寡核苷酸引物檢測(cè)PEDV的熒光定量PCR方法對(duì)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品最低檢測(cè)限為1.64×101copies/μL，組內(nèi)、組間重復(fù)性結(jié)果的變異數(shù)均小于1%，可為PEDV準(zhǔn)確、快速的臨床檢測(cè)提供技術(shù)支持。此外，施開創(chuàng)等[24]針對(duì)PEDV N基因、TGEV M基因、PDCoV M基因和豬輪狀病毒VP6基因建立的4重TapMan熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)相關(guān)病毒的快速診斷更是具有重要意義，但目前關(guān)于SADS-CoV的熒光定量PCR檢測(cè)方法的研究相對(duì)較少，亟待補(bǔ)充。

3.3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP）是一種新的DNA擴(kuò)增方法。該技術(shù)依賴于自動(dòng)循環(huán)的鏈置換反應(yīng)，利用4對(duì)特異性的引物在等溫條件下1 h內(nèi)即能擴(kuò)增出 1×109copies的靶序列，該方法無需昂貴的試驗(yàn)設(shè)備及試劑，操作簡(jiǎn)單，結(jié)果直觀，是當(dāng)前病原檢測(cè)方法研究熱點(diǎn)之一。目前已有LAMP檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于豬冠狀病毒的檢測(cè)，但在獸醫(yī)臨床上并未廣泛應(yīng)用。如焦韻潔等[25]建立的TGEV可視化RT-LAMP檢測(cè)方法在恒溫水浴鍋中1 h即可完成檢測(cè)，比普通PCR方法高2個(gè)數(shù)量級(jí)，并以羥基萘酚藍(lán)為指示劑，使結(jié)果直接可觀。Zhang等[26]建立的PDCoV RT-LAMP 的檢測(cè)方法，敏感性比普通PCR高出100倍左右，與巢式PCR符合率為100%?？梢奓AMP方法為豬群冠狀病毒的基層診斷及病原流行病學(xué)調(diào)查提供了更為有效的手段。

4 新型檢測(cè)方法在豬冠狀病毒檢測(cè)中的應(yīng)用

隨著分子生物學(xué)技術(shù)及其交叉學(xué)科的不斷發(fā)展，近年來多種簡(jiǎn)便快捷的新型病原分子檢測(cè)方法不斷涌現(xiàn)，如：恒溫?zé)岣艚^式PCR （Insulated isothermal PCR, iiPCR）、重組酶聚合酶擴(kuò)增（Recombinase polymerase Amplification, RPA）和微滴式數(shù)字PCR（Droplet digital PCR, ddPCR）。iiPCR是一種基于Rayleigh-Benard對(duì)流原理的新型擴(kuò)增技術(shù)[27]。利用儀器底部單一熱源加熱，使毛細(xì)管內(nèi)部液體自然對(duì)流形成PCR各步驟反應(yīng)所需溫度而實(shí)現(xiàn)PCR擴(kuò)增，針對(duì)此方法研發(fā)的小型核酸分析儀器，反應(yīng)時(shí)間僅需42 min，檢測(cè)結(jié)果直接顯示于屏幕，與傳統(tǒng)熒光定量PCR方法相比，縮短了反應(yīng)時(shí)間，操作更加簡(jiǎn)便，更是達(dá)到了檢測(cè)儀器的小型化而適用室外快速檢測(cè)。該技術(shù)于2002年首次報(bào)道以來[28]，已有多種病原的iiPCR技術(shù)相繼問世，但iiPCR在豬冠狀病毒的檢測(cè)僅見于PEDV和PDCoV。如沈思思等[29]采用PEDV S基因設(shè)計(jì)引物和探針，建立了用于檢測(cè)PEDV的iiPCR，其靈敏度高于普通熒光定量PCR方法，具有良好的應(yīng)用價(jià)值。目前關(guān)于iiPCR檢測(cè)技術(shù)的報(bào)道僅見于單病原的檢測(cè)，因此在臨床檢測(cè)時(shí)需考慮多個(gè)病原，防止漏檢。RPA被稱為可以替代PCR的核酸擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)依賴于重組酶、單鏈結(jié)合蛋白和鏈置換DNA聚合酶3種重要組分，無需特殊控溫儀器，在25～42 ℃條件下就能實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA或者RNA的擴(kuò)增，也可結(jié)合凝膠電泳、測(cè)流層析試紙條、熒光探針和生物芯片等多種技術(shù)檢測(cè)結(jié)果，真正意義上實(shí)現(xiàn)了病原檢測(cè)的快速便捷，但RPA技術(shù)正處于不斷發(fā)展過程中，其引物及探針設(shè)計(jì)尚不成熟，還需要研究者進(jìn)行摸索優(yōu)化。目前RPA在豬冠狀病毒檢測(cè)中的應(yīng)用不為常見，但肖帥等[30]建立的PDCoV的RPA方法具有高特異性及靈敏性，為豬腹瀉相關(guān)冠狀病毒新型RPA檢測(cè)方法的建立奠定了基礎(chǔ)。ddPCR為第3代PCR技術(shù)[31]，該技術(shù)通過將樣品無限稀釋至納米級(jí)微滴，使每個(gè)微滴形成獨(dú)立的反應(yīng)體系，通過終點(diǎn)信號(hào)計(jì)算靶分子的拷貝數(shù)，該方法是在熒光定量PCR基礎(chǔ)上發(fā)展而來，不依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線和Ct值，實(shí)現(xiàn)了病原的絕對(duì)定量[32]。該技術(shù)不僅能對(duì)單一病原進(jìn)行定量的分析，亦可對(duì)兩種病原同時(shí)檢測(cè)。但目前尚未有同時(shí)檢測(cè)3種及以上病原的ddPCR檢測(cè)方法的報(bào)道。目前已有PEDV和TGEV雙重微滴數(shù)字PCR商品化試劑盒投入市場(chǎng)，并取得了良好的臨床效果。上述新型分子生物學(xué)診斷技術(shù)為疫病病原更加快速、精準(zhǔn)、高效檢測(cè)提供了可能。

5 小結(jié)與展望

豬腹瀉相關(guān)冠狀病毒給世界各地的養(yǎng)豬業(yè)均造成了巨大威脅，而快速精準(zhǔn)的診斷是疫病防控的關(guān)鍵之一。目前關(guān)于豬冠狀病毒檢測(cè)方法的研究多集中于血清學(xué)和分子生物學(xué)檢測(cè)方法。其中ELISA、免疫層析等血清學(xué)檢測(cè)方法成本低、操作簡(jiǎn)單快速，可滿足大批量樣本檢測(cè)，在基層獸醫(yī)臨床診斷和血清抗體監(jiān)測(cè)中得到廣泛應(yīng)用，但也存在特異性、敏感性相對(duì)較低的缺點(diǎn)。而傳統(tǒng)分子生物學(xué)檢測(cè)方法如PCR、多重PCR、熒光定量PCR等技術(shù)在特異性和靈敏性上有了大幅度的提高，實(shí)現(xiàn)了對(duì)病原定性到定量的分析，單一病原到多重病原的鑒別檢測(cè)，提升了檢測(cè)效率及準(zhǔn)確率，可快速鑒別多種腸道病原以及快速區(qū)分不同基因型，但仍需要較高的試驗(yàn)條件和成本而不適用于大規(guī)模的臨床樣本和基層獸醫(yī)診斷。近年出現(xiàn)的ddPCR、iiPCR和RPA技術(shù)等新型分子檢測(cè)技術(shù)正在克服血清學(xué)技術(shù)和傳統(tǒng)PCR技術(shù)的弊端，為病原更加快速、便捷和高效地檢測(cè)提供了可能，也是豬冠狀病毒檢測(cè)方法研究的新方向。