正交試驗法優(yōu)選青刺尖總黃酮提取工藝研究

夏海梅 周志宏 張菊 趙遠

摘要：目的?優(yōu)選青刺尖總黃酮的提取工藝。方法?對青刺尖中黃酮類成分進行鑒別，加熱回流提取法和索氏提取法提取青刺尖總黃酮，蘆丁為對照品，紫外可見分光光度法考察兩種提取方法下青刺尖總黃酮得率，選擇提取率較高的方法進行下一步實驗。考察提取時間、乙醇體積分數(shù)、液固比三個因素對青刺尖總黃酮提取率的影響，正交設(shè)計提取條件，篩選最優(yōu)提取工藝。結(jié)果?相同條件下，加熱回流提取法提取青刺尖總黃酮得率高于索氏提取法;選擇加熱回流提取法實驗，得最佳提取工藝為：提取時間40min、乙醇體積分數(shù)60%、液固比12 mL/g;在此條件下三次重復實驗得青刺尖總黃酮提取率為7.30%。結(jié)論?加熱回流提取法提取青刺尖總黃酮優(yōu)于索氏提取法，在提取時間為40min、乙醇體積分數(shù)60%、液固比12 mL/g的條件下青刺尖總黃酮得率高，該方法簡單易行，可作為青刺尖總黃酮提取工藝。

關(guān)鍵詞：青刺尖總黃酮;紫外可見分光光度法;提取工藝

中圖分類號：R284.2?文獻標志碼：B?文章編號：1007-2349（2021）01-0080-03

青刺尖，青刺尖（Prinsepia utilis Royle）當年生嫩尖及葉（下同）經(jīng)烘炒、揉捻和干燥等工藝制作而成，薔薇科扁核木屬落葉灌木，別名扁核木、槍刺果、打油果（曲靖）、雞蛋果（云南）等[1]。主要分布云南、貴州、四川、西藏等地[2]。云南地區(qū)主要分布于迪慶州維西縣及周邊州市，云南省滇西北特色生物資源。青刺尖始載于《滇南本草》，曰：“性散寒，味苦?！盵3]，《云南天然藥物圖鑒》記載性味，苦、辛、涼[4]，在《貴州中草藥》、《中藥大辭典》、《云南民族藥志》中也有記載。青刺尖根、莖、葉、果實均可入藥，我省納西族、白族、彝族、普米族、苗族等少數(shù)民族中已有上千年的應(yīng)用歷史，嫩葉水煎用于治療咽喉炎、發(fā)熱、牙痛、外痔出血、瘡癰腫等[2]。目前對青刺尖總黃酮的提取工藝研究不多，吳小蘭[5]以結(jié)晶法制備青刺果總黃酮，所得總黃酮含量為33.6%;張濟麟[6]以有機溶劑提取青刺尖果中總黃酮，得總浸膏、乙酸乙酯層黃酮類化合物的含量分別為3.00%、2.76%，石油醚層和正丁醇層均為0.09%，水層0.03%;劉招娣等[7]以青刺果油粨為原料，超聲波輔助法提取總黃酮，提取率為5.28%;以酶葉提取法提取扁核木莖葉中總黃酮，得1.379 mg/g[8];韓蕾[9]研究結(jié)果顯示，蕤核葉黃酮的提取量可達到9.1237 mg·g-1;左愛華[10]以蘆丁為對照品，紫外可見分光光度法測定青刺尖總黃酮，實驗以80%乙醇加熱回流提取，最終黃酮得率以麗江地區(qū)最高，3.10%。本實驗篩選青刺尖總黃酮提取方法，再對提取工藝進行優(yōu)選，旨在為產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)及藥理研究提供參考。

1?儀器及試劑

1.1?儀器?TU-1900雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司），DZTW調(diào)溫電熱套（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司），751石英比色皿10 mm（宜興市中科工業(yè)玻璃有限公司光電科析儀器部），UPH-IV-20T純水機（云南優(yōu)普科技有限公司）

1.2?試劑?蘆?。ㄉ虾W克化學有限公司），產(chǎn)品編號：132390050，其他試劑均為分析純，純水自制。

1.3?試劑的配制?5%NaNO2的配制 準確稱取5.0 g亞硝酸鈉，再加入95 ml去離子水，攪拌溶解即得。10% AL（NO3）3 的配制 準確稱量硝酸鋁10.0 g放入150 ml錐形瓶中，然后用移液管移取90 ml去離子水，用玻璃棒攪勻即得。

4% NaOH的配制 準確稱取4.0 g氫氧化鈉固體，加入96 g去離子水中，攪拌、溶解即得。

1.4?樣品?購于麗江貢合實業(yè)有限公司，當年生嫩尖及葉經(jīng)烘炒、揉捻和干燥等工藝制作而成，經(jīng)粉碎成粗粉備用。

2?方法與結(jié)果

2.1?青刺尖中黃酮類化合物的鑒別

2.1.1?三氯化鋁試驗?取青刺尖樣品溶液在濾紙上滴1滴，待干后加入1% ALCL3乙醇溶液3滴，待溶劑揮干后，觀察是否有黃色絡(luò)合物，紫外燈下觀察是否出現(xiàn)鮮黃色熒光。觀察實驗結(jié)果，溶劑揮干后，有黃色絡(luò)合物;紫外線分析儀下觀察，呈鮮黃色熒光，表明青刺尖中含有黃酮類化合物。

2.1.2?鹽酸鎂粉試驗?取青刺尖樣品溶液1 mL，加入少許鎂粉，振搖，滴入幾滴濃鹽酸，溶液顯紅色，表明含有黃酮類化合物。

2.2?對照品溶液的制備 精密稱取蘆丁對照品5.00 mg于25.00 mL容量瓶中，加70%乙醇水浴上微熱溶解，加70%乙醇定容至刻度，即為濃度0.2000 mg/mL的對照品溶液。

2.3?標準曲線的制備?精密吸取對照品溶液0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00 mL分別置于25ml容量瓶中，編號0、1、2、3、4、5、6，加70%乙醇至6.00 mL，加5% NaNO2 1 mL，搖勻，靜置6 min，加10% AL（NO3）3 1.00 mL混勻，靜置6 min，加入4% NaOH 溶液10.00 mL，加入超純水定容至刻度，搖勻，靜置15 min后，以0號做對照，在510 nm處測定吸光度。以吸光度Y為縱坐標，質(zhì)量濃度X（mg/mL）為橫坐標，繪制標準曲線，其回歸方程為：Y=f（x），公式Y(jié)=K1*（x）+K0，其中K0=0.05382，K1=0.43482，R=0.9983，即Y=0.43482*（x）+0.05382。蘆丁0.0081 mg/mL～0.0486 mg/mL濃度范圍內(nèi)線性良好。

2.4?提取方法的篩選?分別選用索氏提取法和加熱回流提取法，以液料比10 mL/g，乙醇體積分數(shù)70%，加入青刺尖粗粉，浸泡30 min，提取青刺尖總黃酮，提取結(jié)束，每種提取方法下選擇三個樣品進行編號測定吸光度，計算平均值，選擇黃酮得率較高的提取方法進行下一步實驗。

C（μg/m L）：總黃酮的濃度;V（m L）：待測樣品體積;D：稀釋倍數(shù);M（μg）：稱取樣品的質(zhì)量。

計算青刺尖總黃酮提取率，索氏提取法和加熱回流提取法青刺尖總黃酮提取率分別為2.81%、4.06%，加熱回流提取法優(yōu)于索氏提取法。

2.5?單因素試驗?考察在不同乙醇體積分數(shù)、液固比、提取時間的影響因素下，青刺尖總黃酮的提取率。

2.5.1?體積分數(shù)對青刺尖總黃酮提取率的影響?精密稱取青刺尖樣品15 g，置于圓底燒瓶中，加入（30、40、50、60、70、75、80%）乙醇溶液150 mL浸泡30 min，連接回流裝置，加熱回流提取1 h，放涼，傾倒出藥液，補足與藥液同體積的乙醇，重復以上操作3次。提取結(jié)束后合并濾液，過濾，濃縮提取液至0.2 g生藥/mL。將濾液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度。精密吸取1 mL樣品置于25 mL容量瓶中，自“加70%乙醇至6.00 mL”起按照標準曲線項下的操作進行。在510 nm波長處測定吸光度，并利用公式計算青刺尖總黃酮提取率，實驗發(fā)現(xiàn)乙醇體積分數(shù)為50%時黃酮得率最高，為5.94%。結(jié)果如圖1所示。

2.5.2?液固比對青刺尖總黃酮提取率的影響?準確稱取青刺尖樣品15 g置于圓底燒瓶中，以液固比（8、10、12、14、16）mL/g，加入50%乙醇溶液，浸泡30 min，連接回流裝置，加熱回流提取1 h，放涼，傾倒出藥液，補足與藥液同體積的乙醇，重復以上操作3次。提取結(jié)束后合并濾液，過濾，濃縮提取液至0.2 g生藥/mL。將濾液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度。精密吸取1 mL樣品置于25 mL容量瓶中，自“加70%乙醇至6.00 mL”起按照標準曲線項下的操作進行。在510 nm波長處測定吸光度，并利用公式計算青刺尖總黃酮提取率。實驗發(fā)現(xiàn)，液固比為12 mL/g時青刺尖總黃酮得率最高，為7.81%。實驗結(jié)果如圖2所示。

2.5.3?提取時間對青刺尖總黃酮提取率的影響?準確稱取青刺尖樣品15 g置于圓底燒瓶中，以液固比 1：10加入50%乙醇溶液浸泡30 min，連接回流裝置，加熱回流提?。?0、55、70、85、100 min），放涼，傾倒出藥液，補足與藥液同體積的乙醇，重復以上操作3次。提取結(jié)束后合并濾液，過濾，濃縮提取液至0.2 g生藥/mL。將濾液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度。精密吸取1 mL樣品置于25 mL容量瓶中，自“加70%乙醇至6.00 mL”起按照標準曲線項下的操作進行。在510 nm波長處測定吸光度，并利用公式計算青刺尖總黃酮提取率，提取時間為70 min時，青刺尖總黃酮得率最高，為6.88%。結(jié)果如圖3所示。

2.6?正交試驗?選取單因素試驗結(jié)果進行正交設(shè)計，優(yōu)選最佳提取工藝，結(jié)果如表1所示。

由表5結(jié)果可知，提取時間40 min，液料比12 mL/g，乙醇濃度60%青刺尖總黃酮的提取率最高，達7.19%。由極差結(jié)果可知，在三個提取因素中，乙醇濃度對青刺尖總黃酮的提取率影響最大，依次為乙醇濃度>液固比>提取時間。在以上優(yōu)選工藝條件下重復實驗3次，平均提取率為7.3%。

3?討論

本實驗以提取時間、乙醇體積分數(shù)和液料比三個因素為考察對象，正交設(shè)計優(yōu)選得到青刺尖總黃酮的最佳提取工藝：提取時間40min，液料比12ml/g，乙醇濃度60%，重復驗證最佳工藝的總黃酮類提取率為7.30%，較文獻報道3.10%高。據(jù)文獻研究結(jié)果[10]，以紫外可見分光光度法考察青刺尖黃酮類化合物準確靈敏，本實驗以該方法作為考察方法，可信度較高，所優(yōu)選提取工藝較為可靠。

黃酮類化合物具有顯著的降血脂活性，可有效應(yīng)用于心血管疾病的防治。目前對青刺尖中黃酮類成分的藥理研究較少，基于青刺尖的豐富資源及富含黃酮類成分的特性，對其進行深入的藥理研究具有重要意義。

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（收稿日期：2020-06-24）