筋骨寧膏中黃曲霉毒素的測(cè)定

倪倩，南文萍，張俐*（. 江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，南京 009；. 南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京 003）

筋骨寧膏由骨碎補(bǔ)、鳳仙透骨草、五加皮、生天南星、續(xù)斷、蒲公英、當(dāng)歸、羌活、紅花、土鱉蟲(chóng)、桃仁、乳香、沒(méi)藥、樟腦、冰片、桉葉油、水楊酸甲酯、鹽酸苯海拉明組成。其功效為活血化瘀、消腫止痛、舒筋活絡(luò)，主要用于閉合性骨折和跌打損傷。

其藥味之一土鱉蟲(chóng)別名?蟲(chóng)、地鱉和土鱉，為鱉蠊科（Corydiidae）昆蟲(chóng)地鱉Eupolyphaga sinensisWalker. 或冀地鱉Steleophagaplancyi（Boleny）的雌蟲(chóng)干燥體。其性寒，味咸，有破淤血、續(xù)筋骨的功效，是跌打損傷、消腫止痛和活血化瘀中成藥的常用組成成分。土鱉蟲(chóng)在采收、加工、運(yùn)輸及儲(chǔ)存環(huán)節(jié)中，極易發(fā)生霉變并產(chǎn)生黃曲霉毒素（aflatoxins，AFs）。黃曲霉毒素是一種強(qiáng)致癌的霉菌毒素，最常見(jiàn)的是黃曲霉G1（Aflatoxin G1，AFG1）、G2（Aflatoxin G2，AFG2）、B1（Aflatoxin B1，AFB1）、B2（AflatoxinB2，AFB2）。 其 中AFB1的毒性最大，分布最廣，屬于Ⅰ類致癌物。近年來(lái)，陸續(xù)有文獻(xiàn)報(bào)道土鱉蟲(chóng)中黃曲霉毒素超標(biāo)的現(xiàn)象[1-2]。有研究表明，AFB1 對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞毒性作用[3]，說(shuō)明對(duì)外用制劑控制黃曲霉毒素也很有必要。《中國(guó)藥典》2020年版一部對(duì)土鱉蟲(chóng)中黃曲霉毒素規(guī)定了限度，AFB1 限度為5 μg·kg－1，AFB1、AFB2、AFG1 與AFG2 的總量限度為10 μg·kg－1[4]，但未對(duì)土鱉蟲(chóng)相關(guān)制劑黃曲霉毒素進(jìn)行控制，相關(guān)檢測(cè)方法并不完善。

本文利用黃曲霉毒素的溶解性（易溶于油、三氯甲烷、甲醇和乙腈，不溶于水、乙醚和正己烷），對(duì)可能存在污染的貼膏劑制品建立了新的提取方式，為黃曲霉毒素的檢測(cè)與監(jiān)管提供新思路。

1 儀器與試藥

ExionLC 型超高效液相色譜、AB QTRAP 4500 LC/MS/MS（美國(guó)SCIEX 公司）；CPA0045 型萬(wàn)分之一電子分析天平（德國(guó)Sartorius 公司）；TG16-WS 離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；Milli-Q 超純水處理系統(tǒng)。色譜柱PhenomenxTitank C18（2.1 mm×150 mm，1.8 μm）。甲醇、乙腈均為色譜純；水為超純水；免疫親和色譜柱（北京華安麥科生物技術(shù)有限公司）。黃曲霉毒素混合對(duì)照品溶液（AFB1、AFB2、AFG1、AFG2 標(biāo)示質(zhì)量濃度分別為1.04、0.38、1.08、0.38 μg·mL－1，批號(hào)：610001-202006，中國(guó)食品藥品檢定研究院）。筋骨寧膏（土鱉蟲(chóng)處方量占處方生藥總量6.7%，江蘇百益制藥有限公司，批號(hào)分別為200601-1、210201）。

2 方法與結(jié)果

2.1 液相-質(zhì)譜條件

色譜柱：PhenomenxTitank C18（2.1 mm×150 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相以10 mmol·L－1醋酸銨溶液為流動(dòng)相A，以甲醇為流動(dòng)相B；柱溫25℃；流速0.3 mL·min－1；按表1 程序進(jìn)行梯度洗脫。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution procedure

離子源：電噴霧離子源（ESI），正離子檢測(cè)方式；多反應(yīng)檢測(cè)（MRM 模式）；氣簾氣：35 psi；離子源溫度：550℃；電噴霧電壓：5500 V；霧化器：55 MPa；輔助器：60 MPa；各化合物監(jiān)測(cè)離子對(duì)和碰撞電壓（CE）見(jiàn)表2。

表2 監(jiān)測(cè)離子對(duì)和碰撞電壓Tab 2 Monitoring ion pair and collision voltage

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密量取黃曲霉毒素混合對(duì)照品溶液500 μL，置50 mL 量瓶中，用70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即為線性1 號(hào)溶液。精密量取線性1 號(hào)溶液5、4、3、2 和1 mL，分別置25、25、25、25 和50 mL 量瓶中，用70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為線性溶液2、3、4、5和6號(hào)溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取本品1 g，置50 mL離心管中，加入10 mL 正己烷浸漬1 h，渦旋3 min，即可將背襯層表面的膏狀層完全溶解，呈乳液狀。再精密加入10 mL70%甲醇，渦旋3 min后，9000 r·min－1離心5 min，此時(shí)膏狀層和背襯層在瓶底聚集，溶液分為澄清的上下兩層，黃曲霉毒素溶解于下層的70%甲醇中，精密量取下層液體6 mL，置20 mL 量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，9000 r·min－1離心5 min，取全部上清液，通過(guò)免疫親和柱，流速3 mL·min－1，用水20 mL 洗脫，棄去洗脫液，使空氣進(jìn)入柱子，將水?dāng)D出柱子，再用適量甲醇洗脫，收集洗脫液，置2 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜濾過(guò)（0.22 μm），取續(xù)濾液，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取空白溶劑（甲醇）與線性2 號(hào)溶液各5 μL，分別注入超高效液相色譜-質(zhì)譜儀，考察各組分峰形（見(jiàn)圖1）。結(jié)果各成分峰形較好，響應(yīng)值高，空白溶劑中未提取出離子峰，說(shuō)明對(duì)檢測(cè)無(wú)干擾，所選擇的監(jiān)測(cè)離子對(duì)較為合適。

圖1 空白溶劑和對(duì)照品溶液的提取離子峰圖Fig 1 Extracted ion chromatogram of blank solvent and reference solution

2.4 線性關(guān)系考察

取“2.2”項(xiàng)下系列線性溶液，精密量取5 μL，注入超高效液相色譜-質(zhì)譜儀，測(cè)定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 線性關(guān)系與范圍Tab 3 Linear relation and range

2.5 精密度試驗(yàn)

精密量取線性2 號(hào)溶液5 μL，連續(xù)進(jìn)樣6 次，以峰面積計(jì)算RSD，考察精密度。結(jié)果AFG2 峰面積RSD為0.75%，AFG1 為1.6%，AFB2 為1.6%，AFB1 為1.8%，表明本法精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取本品1 g，按“2.2.2”項(xiàng)下方法操作，平行制備6 份，結(jié)果6 份樣品中均未檢出黃曲霉毒素。

2.7 檢測(cè)限與定量限

取線性6 號(hào)溶液逐級(jí)稀釋至S/N約為3，即為檢測(cè)限，S/N約為10，即為定量限。結(jié)果表明，本法靈敏度較高，符合檢測(cè)要求（見(jiàn)表4）。

表4 檢測(cè)限與定量限結(jié)果Tab 4 LOD and LOQ

2.8 加樣回收試驗(yàn)

精密稱取本品1 g，精密加入線性1 號(hào)溶液350 μL，按“2.2”項(xiàng)下方法操作，平行制備6 份，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果加樣回收率見(jiàn)表5。結(jié)果表明，各成分回收率在72.80%～86.40%，RSD均小于10%，說(shuō)明本法可有效提取出制劑樣品中的黃曲霉毒素。

表5 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果Tab 5 Recovery

2.9 樣品測(cè)定結(jié)果

精密量取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液5 μL，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果表明，2 批樣品中均未檢出黃曲霉毒素。

3 討論

3.1 提取方法的確立

黃曲霉毒素的提取多采用甲醇-水或乙腈-水的提取方式，但是貼膏劑中具有活性物質(zhì)的膏狀層不溶于甲醇-水或乙腈-水體系，導(dǎo)致包裹在其中的成分難以被提取出。本文中的提取方法將膏狀層完全溶解在正己烷中，再用甲醇-水進(jìn)行提取，大大提高了黃曲霉毒素的提取回收率。

另外，比較了乙腈-水與甲醇-水的提取效率，結(jié)果表明，乙腈-水與甲醇-水的提取回收率幾乎無(wú)差別，但乙腈-水提取液顏色偏深，說(shuō)明干擾物多于甲醇-水體系，因此最終選擇甲醇-水作為提取溶劑。

3.2 分析方法的確立

本文參考2020年版《中國(guó)藥典》四部通則2351 真菌毒素測(cè)定法，對(duì)質(zhì)譜條件進(jìn)行了人工優(yōu)化，使得4 個(gè)黃曲霉毒素的檢測(cè)靈敏度更高。

3.3 存在的不足

本文雖然為土鱉蟲(chóng)相關(guān)貼膏劑類產(chǎn)品黃曲霉毒素的測(cè)定與監(jiān)管提供了新方法與新思路，但依然存在不足，由于樣本量較少，不能全面評(píng)估該類產(chǎn)品的質(zhì)量。鑒于土鱉蟲(chóng)相關(guān)產(chǎn)品黃曲霉毒素污染情況較為嚴(yán)重，并且黃曲霉毒素對(duì)表皮細(xì)胞存在一定毒性，透皮吸收情況也尚不明確，因此應(yīng)該加大對(duì)此類產(chǎn)品的質(zhì)量監(jiān)控，獲取足量數(shù)據(jù)后再對(duì)此類產(chǎn)品的質(zhì)量監(jiān)管采取合理措施。