中藥復(fù)方聯(lián)合三苯氧胺對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞HER-2基因及MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路的影響*

周躍華，殷東風(fēng)

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽110032

乳腺癌是威脅女性健康的常見惡性腫瘤。統(tǒng)計(jì)顯示［1］，每8位婦女中就有1人會(huì)被診斷為乳腺癌，并且，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，以每年3%～4%的速度遞增，而且有年輕化趨勢(shì)。HER-2是一種原癌基因，HER-2過表達(dá)型乳腺癌普遍存在低分化、病情進(jìn)展迅速、高侵襲性等特點(diǎn)［2-3］，成為判斷性乳腺癌預(yù)后危險(xiǎn)因子之一。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinases，MAPKs）信號(hào)通路是真核生物信號(hào)傳遞網(wǎng)絡(luò)中的重要途徑，在細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化、腫瘤的發(fā)生發(fā)展、腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移、腫瘤的多藥耐藥等方面起到至關(guān)重要的作用。MAPKs主要由ERKs、JNK/SAPK、p38MAPK、MK1/ERK5四個(gè)家族成員組成，其中ERKs（細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2，ERK1/2）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與乳腺癌的關(guān)系最為密切。乳腺癌為激素依賴型惡性腫瘤，研究表明將ER（+）的MCF-7乳腺癌細(xì)胞長(zhǎng)期置于雌激素匱乏的環(huán)境中，雌激素受體α（estrogen receptor，ERα）表達(dá)將明顯降低，ERα為MAPK信號(hào)通路的下游因子，MAPK通路活性增加可以促進(jìn)ERα的轉(zhuǎn)錄及翻譯。前期實(shí)驗(yàn)［4］發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)方乳巖寧具有下調(diào)HER-2蛋白表達(dá)的作用，本研究進(jìn)一步觀察中藥復(fù)方聯(lián)合三苯氧胺（tamoxifen，TAM）對(duì)乳腺癌HER-2mRNA及ERK1/2、ERα蛋白表達(dá)變化的影響，為乳腺癌多靶點(diǎn)聯(lián)合治療以及中西醫(yī)結(jié)合治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物BALB/C裸鼠40只，雌性，4～6周齡，體質(zhì)量（20±2）g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（滬）2007-0005。飼養(yǎng)條件：動(dòng)物飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心IVC籠具中，墊料、飼料均無菌處理。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7（美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心ATCC，ER陽性，中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所）；兔抗ERK1/2抗體（Cell signaling公司，批號(hào)：14）；兔抗ERa抗體（北京博奧森生物，批號(hào)：909086W）；鼠抗β-actin抗體；DNA Marker、RT-PCR試劑盒（大連TaKaRa公司，批號(hào)：RR066A）；cDNA第一鏈合成試劑盒，Taq酶（北京康為世紀(jì)生物，批號(hào)：CW2849）；HER-2基因引物序列設(shè)計(jì)及合成（北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；DYY-6C型電泳儀（北京六一儀器廠）；MyCycler型梯度PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)BIO-RAD）。

1.3 試藥制備乳巖寧方藥物組成：柴胡10 g，太子參15 g，法半夏10 g，黃芩15 g，炙甘草10 g，生龍骨30 g，生牡蠣30 g，白花蛇舌草20 g，半枝蓮20 g，莪術(shù)15 g，浙貝母15 g。益氣消積方藥物組成：太子參15 g，白術(shù)15 g，麥冬15 g，生黃芪20 g，炙甘草10 g，沙參15 g，茯苓15 g，莪術(shù)15 g，浙貝母15 g，白花蛇舌草20 g，半枝蓮20 g。以上藥物一次性購于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，按照常規(guī)水煎煮，濃縮至終濃度為3.3 g/mL，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｋ鞣移〒P(yáng)子江藥業(yè)，國(guó)藥準(zhǔn)字H32021472，規(guī)格：10mg/片），蒸餾水溶解，調(diào)節(jié)生藥濃度1.2 g/L備用。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 模型制備取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的濃度為1×107/mL的MCF-7細(xì)胞調(diào)節(jié)活細(xì)胞，無菌條件下接種于鼠右側(cè)胸壁第二乳墊下，0.2 mL/只，裸鼠繼續(xù)飼養(yǎng)于層流罩中。接種后10～15天，在接種部位處出現(xiàn)質(zhì)硬結(jié)節(jié)，并 逐漸增大，認(rèn)為成瘤，造模成 功［5］。

1.4.2 分組及給藥將40只造模成功的裸鼠隨機(jī)分為模型組、TAM組、乳結(jié)合組、益結(jié)合組，每組10只。根據(jù)人和鼠給藥劑量換算公式［6］計(jì)算各組給藥的劑量。模型組給予蒸餾水0.2 mL/只；TAM組給予TAM 3.6 μg/g（相當(dāng)于成人臨床用量的9倍）；乳結(jié)合組給予乳巖寧33.3 g/kg（相當(dāng)于成人臨床用量的12倍）+TAM 3.6 μg/g；益結(jié)合組給予益氣消積方35.3 g/kg（相當(dāng)于成人臨床用量的12倍）+TAM 3.6 μg/g。各組每日灌胃1次，連續(xù)給藥21天。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 一般狀態(tài)觀察各組大鼠體質(zhì)量、活動(dòng)量、進(jìn)食等表現(xiàn)。

1.5.2 ERK1/2、ERα蛋白表達(dá)-20℃冰箱中取出樣本，取標(biāo)本100 mg，加入冰預(yù)冷的細(xì)胞裂解液500 μL，組織勻漿，采用酚試劑法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，制備12%分離膠與4%濃縮膠，SDS-聚丙烯酰胺不連續(xù)凝膠電泳，轉(zhuǎn)印，雜交，堿性磷酸酶法顯色，并以β-actin內(nèi)參蛋白作為對(duì)照，掃描照相，用Scion Image軟件對(duì)蛋白電泳帶的進(jìn)行灰度值檢測(cè)，進(jìn)行定量分析。

1.5.3 HER-2mRNA的表達(dá)Trizol提取腫瘤組織總RNA，采用紫外可見光分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度和純度，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，HER-2基因引物序列引物參照文獻(xiàn)報(bào)道；β-actin引物設(shè)計(jì)參照Genebank的cDNA序列，按照PCR反 應(yīng) 條件進(jìn) 行PCR反應(yīng)。瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果采用Flour Chem V2.0凝膠成像分析軟件（America）分析，記錄每條HER-2和β-actin擴(kuò)增帶的灰度值，用β-actin做內(nèi)參照，將HER-2DNA擴(kuò)增片段的灰度值與相應(yīng)的內(nèi)參β-actin擴(kuò)增片段灰度值的比值作為HER-2mRNA的半定量指標(biāo)。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以表示，采用單因素方差分析（ANOVA），P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般狀態(tài)各組給藥一周后除模型組外，各用藥組荷瘤裸鼠體質(zhì)量均下降，形體消瘦，活動(dòng)量減少，進(jìn)食減少，喜蜷臥，以TAM組表現(xiàn)最明顯，在給藥的第19天，TAM組1只裸鼠因腫瘤消耗最終死亡，死亡時(shí)體質(zhì)量14 g，經(jīng)解剖檢查排除其他原因死亡。而兩個(gè)結(jié)合組裸鼠由于腫瘤消耗，體質(zhì)量也有不同程度下降，但狀態(tài)保持相對(duì)較好，直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束無死亡。

2.2 ERK1/2、ERα蛋白,HER-2 mRNA表達(dá)與模型組比較，TAM組、乳結(jié)合組及益結(jié)合組，ERK1/2、ERα蛋白、HER-2 mRNA表達(dá)均降低（P＜0.01）；乳結(jié)合組及益結(jié)合組較TAM組降低更明顯（P＜0.01）；乳結(jié)合組與益結(jié)合組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1、圖1—3。

表1 各組大鼠ERK1/2、ERα蛋白，HER-2 mRNA表達(dá)比較（

表1 各組大鼠ERK1/2、ERα蛋白，HER-2 mRNA表達(dá)比較（

注：☆表示與模型組比較，P＜0.01；★表示與TAM組比較，P＜0.01；◆表示與乳結(jié)合組比較，P＞0.05

HER-2 mRNA 0.62±0.023 0.51±0.041☆0.42±0.004☆★0.41±0.008☆★◆組別模型組TAM組乳結(jié)合組益結(jié)合組鼠數(shù)10 9 10 10 ERK1/2 219.14±5.91 179.64±5.46☆161.34±5.03☆★159.54±4.16☆★◆ERα 224.33±7.59 187.33±4.97☆172.33±6.24☆★173.37±4.81☆★◆

圖1 各組大鼠瘤組織中ERK1/2、ERα蛋白表達(dá)

圖2 各組大鼠瘤組織中HER-2 mRNA的表達(dá)

圖3 各組大鼠瘤組織中β-actin mRNA的表達(dá)

3 討論

HER-2基因又稱人類表皮生長(zhǎng)因子受體2（epidermal growth factor receptor，EGF2），乳腺癌HER-2基因參與調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)，其基因擴(kuò)增或蛋白過度表達(dá)與腫瘤惡性生物學(xué)行為相關(guān)；在治療方面，HER-2（+）較HER-2（-）的乳腺癌患者能從蒽環(huán)類新輔助化療中獲得更高的有效率［7］。

HER-2/MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在HER-2（+）乳腺癌患者中普遍處于活化狀態(tài)，通路的高活性常提示癌細(xì)胞低分化、高增殖、易轉(zhuǎn)移、預(yù)后差。其機(jī)制可能與乳腺癌細(xì)胞中HER-2/neu基因的過表達(dá)能夠通過激活PI3K和ERK通路導(dǎo)致野生型P53蛋白含量減少有關(guān)［8］。本研究所采用的MCF-7細(xì)胞ER（+），為激素依賴型乳腺癌。研究表明，在雌激素匱乏的條件下，HER-2具有類雌激素樣的促進(jìn)細(xì)胞增殖作用，主要通過激活ERK/MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中c-fos、ERα等，促進(jìn)癌細(xì)胞的惡性浸潤(rùn)性生長(zhǎng)［9］。乳腺癌的治療方式除了手術(shù)、放化療外，還有內(nèi)分泌治療，而TAM是最具代表性的內(nèi)分泌治療藥物，絕經(jīng)前及絕經(jīng)后患者均可以使用。本實(shí)驗(yàn)選用TAM作用于MCF-7乳腺癌動(dòng)物模型后，研究發(fā)現(xiàn)各處理組均可下調(diào)HER-2 mRNA的表達(dá)，以兩個(gè)結(jié)合組最為明顯，HER-2 mRNA的表達(dá)水平下降，可以抑制MAPK信號(hào)通路的活性，故其下游激酶ERK1/2、ERα蛋白的表達(dá)水平也下降，說明中藥復(fù)方聯(lián)合TAM抑制乳腺癌生長(zhǎng)可能是通過下調(diào)HER-2 mRNA的表達(dá)，抑制MAPK信號(hào)通路的活性，使ERK1/2、ERα蛋白表達(dá)減少來實(shí)現(xiàn)的，而且單純抑制HER-2 mRNA表達(dá)本身就可以抗腫瘤。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明雌激素受體拮抗劑TAM可通過抑制MAPK信號(hào)通路來抗腫瘤，與文獻(xiàn)報(bào)道［10］相一致。馬云飛等［11］研究發(fā)現(xiàn)焦慮、抑郁、睡眠障礙與肝腎虧虛證、肝郁脾虛證、脾腎虧虛證、心腎不交證均有一定的相關(guān)性。而肝腎虧虛型康復(fù)期乳腺癌患者更易合并疲乏、焦慮、抑郁、睡眠障礙。劉勝［12］教授認(rèn)為正氣虧虛、肝腎不足、沖任失調(diào)、痰毒瘀結(jié)為乳腺癌發(fā)病的根本病因；正虛毒留、余毒旁竄是晚期乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素；治療應(yīng)以宣肺、補(bǔ)心、疏肝、健脾、溫腎等法進(jìn)行辨證論治。

乳巖寧方是遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科的協(xié)定方。殷東風(fēng)［13］教授認(rèn)為，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與氣機(jī)升降失常關(guān)系密切，氣機(jī)升降出入異常是導(dǎo)致患者出現(xiàn)各種變證的重要原因。乳巖寧方由《傷寒論》中的柴胡加龍骨牡蠣湯加減化裁而來，針對(duì)乳巖肝郁氣滯的病機(jī)，以小柴胡湯為主方和解少陽，調(diào)暢肝臟之氣機(jī)，調(diào)整氣機(jī)的升降紊亂以樞利全身氣機(jī)，經(jīng)臨床及實(shí)驗(yàn)證明小柴胡湯具有抗腫瘤之功效，加入生龍骨、生牡蠣以鎮(zhèn)定安神，軟堅(jiān)散結(jié)，輔以山慈菇、莪術(shù)、浙貝母等。諸藥配伍共奏調(diào)暢氣機(jī)、扶正抗癌、軟堅(jiān)散結(jié)之功效。根據(jù)腫瘤病機(jī)“全身為虛，局部為實(shí)”，治療應(yīng)以扶正祛邪兼顧為主，以四君子湯及沙參麥冬湯為基礎(chǔ)方加減而成益氣消積方，尤其適用于中晚期的惡性腫瘤患者。關(guān)于乳巖寧方及益氣消積方我們進(jìn)行了大量的臨床及實(shí)驗(yàn)研究。研究表明，該藥安全可靠，對(duì)惡性腫瘤具有治療作用，在腫瘤各階段均可應(yīng)用，可改善患者生存質(zhì)量［14-15］。

本研究發(fā)現(xiàn)，中藥復(fù)方乳巖寧方及益氣消積方聯(lián)合TAM可下調(diào)原癌基因HER-2 mRNA的表達(dá)，通過MAPK信號(hào)通路下調(diào)ERK1/2的表達(dá)，從而減少ERa蛋白的表達(dá)，抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖。此外，還發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)方乳巖寧方及益氣消積方可加強(qiáng)TAM的療效。