新疆阿魏不同外植體組織培養(yǎng)技術(shù)研究

高 能， 李有忠， 耿召坤， 布帕提馬·依薩洪， 努爾扎代姆·麥麥提，塔依爾江·卡米力， 葉春秀

(1.新疆農(nóng)墾科學院/作物種植創(chuàng)新與基因資源利用兵團重點實驗室， 新疆 石河子 832000；2.新疆農(nóng)業(yè)大學， 烏魯木齊 830000)

新疆阿魏(FerulasinkiangensisK. M. Shen)隸屬傘形科(Umbelliferae)阿魏屬(FerulaL.)，是多年生一次結(jié)實的草本植物，植株具有很濃烈的蔥蒜樣臭味。株高0.2～1 m，根粗壯，為紡錘形或圓錐形，根頸上有殘存的葉鞘纖維。莖通常單一，稀2-5，被柔毛，從近基部開始分枝，下部為互生枝，上部為輪生枝，常帶紫紅色?；ㄆ?—5月，果期5—6月[1]，具有重要藥用價值，是一種珍惜植物資源。然而，近年來因新疆阿魏市場需求量升高，使得價格大幅上漲，導致亂采濫挖，嚴重破壞了新疆阿魏天然植物資源[2]。新疆阿魏又是種子繁殖的早春短命植物，多年生，每年結(jié)實一次，地域分布狹窄，生態(tài)幅度小，且其種子發(fā)芽率低，天然更新能力差[3]，已被列為國家二級保護植物[4]。

1996年，譚敦炎等[5]對新疆阿魏的實生苗育苗和人工種植進行了一些研究工作，通過建立苗圃，取得了一套較為成熟的栽培技術(shù)。凱撒·蘇來曼等[6]分別在新疆阿魏原產(chǎn)地新疆伊寧縣喀什鄉(xiāng)北面阿布拉勒和新疆阜康對本地阿魏進行了野生保護管理，并對阿魏的人工繁育技術(shù)進行了初步的研究。田聰?shù)萚7]研究了新疆阿魏在播種苗培育過程中的重要環(huán)節(jié)，包括層積處理、覆土厚度、光照、濕度等，并初步觀察了在溫室內(nèi)播種苗的生長特性。

阿卜杜許庫爾·牙合甫等[8]研究發(fā)現(xiàn)，阜康阿魏種子的發(fā)芽率可通過層積和浸水處理的方法來提高，并建立了阜康阿魏在田間通過春播和秋播兩種方法的栽培技術(shù)。李芳等[9]對新疆阿魏的生物學特性進行系統(tǒng)研究，通過對石河子南部山區(qū)阿魏的生境土壤條件、酸堿度、有機質(zhì)等進行了調(diào)查研究，發(fā)現(xiàn)阿魏的野生資源與其引種地(石河子大學藥學院植物園)的生境、土壤條件類似，均適合阿魏生長條件的要求，但是否有耐鹽堿的特性還有待進一步研究。張云玲等[10]通過對阜康阿魏不同生長時期的碳、氮代謝的動態(tài)，揮發(fā)油和阿魏酸含量變化規(guī)律進行了研究，為人工栽培提供了參考理論依據(jù)。

目前，對阿魏人工繁育技術(shù)的研究報道相對較少。人工組織快繁及種子室內(nèi)誘導發(fā)芽體系的研究，對新疆阿魏資源保護和合理利用提供了相關(guān)科學數(shù)據(jù)，這對保護和開發(fā)利用珍稀藥用植物資源都具有重要的現(xiàn)實意義。本研究以新疆阿魏不同外植體為研究材料，設置不同的溫度和激素處理組合，通過統(tǒng)計發(fā)芽率和成苗率，探討野生新疆阿魏的組織培養(yǎng)技術(shù)，為深入研究新疆阿魏的人工繁育技術(shù)提供理論基礎。

1 實驗材料與器材

1.1 實驗材料

野外采集阿魏外植體、阿魏種子(如圖1，圖2)。

圖1 野生阿魏

圖2 阿魏種子

1.2 培養(yǎng)基

處理1：MS+0.8 mg·L-1KT+1.5 mg·L-16-BA；處理2：MS+2.0 mg·L-16-BA；處理3：MS+2.0 mg·L-12,4-D+0.5 mg·L-16-BA；處理4：1/2 MS。

所有培養(yǎng)基均為3%蔗糖+2.5%植物膠，pH值為5.8～6.0。

2 試驗方法

2.1 外植體誘導愈傷組織處理方法

挑選出較嫩的葉片，去除干葉片及雜質(zhì)，用自來水沖洗表面灰塵后，再用洗潔精水浸泡20 min左右，自來水沖凈表面泡沫后，用長流水沖1～2 h，無菌水沖洗2～3次，75%的酒精浸泡30～40 s，無菌水沖洗3～4次，0.1%升汞浸泡5～10 min，無菌水沖洗3～4次，無升汞殘留即可；用濾紙吸干表面水分，剪成1 cm左右，葉表面緊貼培養(yǎng)基(如圖3)；22 ℃恒溫培養(yǎng)，光照12 h·d-1。

圖3 葉片消毒后接種于培養(yǎng)基上

2.2 種子處理方法

自來水沖洗表面灰塵，無菌水沖洗2～3次，75%的酒精浸泡30～40 s，無菌水沖洗3～4次，10%H2O2浸泡20 min，無菌水沖洗3～4次，無升汞殘留即可；用濾紙吸干表面水分，分成兩等份，一份直接接種在培養(yǎng)基(如圖4)上，放置于4 ℃冰箱中處理，另一份用1 g·L-1的GA3浸泡24 h后接種在培養(yǎng)基(如圖4)上，22 ℃恒溫培養(yǎng)，光照12 h·d-1。

圖4 消毒后的種子接種于培養(yǎng)基上

3 實驗結(jié)果分析

3.1 外植體誘導愈傷組織

22 ℃恒溫培養(yǎng)9 d后處理1和處理2培養(yǎng)基葉片無任何膨大顏色也無變化，處理3培養(yǎng)基上的葉片有明顯的膨大，且而且顏色變淺，表明單獨含有激素6-BA和6-BA+KT組合對葉片誘導愈傷組織沒有顯著的效果，激素6-BA+2,4-D組合對誘導愈傷組織有明顯的效果(如圖5)。

圖5 3種培養(yǎng)基上葉片愈傷組織的變化

3.2 利用種子培養(yǎng)無菌苗

3.2.14 ℃層積處理和22 ℃恒溫處理結(jié)果

4 ℃處理過程中，放置于冰箱門口處的種子14 d后有露白現(xiàn)象，一直處于4 ℃條件下35 d后只有根生長，無子葉生長(如圖6)；而置于冰箱內(nèi)部的種子4 ℃條件下處理35 d后依然無露白現(xiàn)象。原因可能是置于冰箱門口處的種子每次開門時，會有溫差刺激促使種子發(fā)芽，由于每次開門時間不長處于冰箱內(nèi)側(cè)的種子感應不到溫差刺激，因此一直處于低溫狀態(tài)不利于種子發(fā)芽。

圖6 4 ℃條件下14 d及35 d后置于冰箱門口的種子情況

4 ℃處理35 d后將所有的種子放置于人工氣候箱中22 ℃恒溫，光照12 h·d-1培養(yǎng)。22 ℃恒溫培養(yǎng)1 d后有根的種子子葉開始生長(如圖7左)，沒有露白的種子已開始露白(如圖7右)。

圖7 22 ℃恒溫培養(yǎng)1 d后種子發(fā)芽狀況

22 ℃恒溫培養(yǎng)10 d后側(cè)根開始萌發(fā)，再繼續(xù)培養(yǎng)至15 d后真葉開始萌發(fā)生長(如圖8、圖9)。

圖8 22 ℃培養(yǎng)10 d側(cè)根萌發(fā)

將獲得的無菌苗移栽到沙土中(如圖10)，13 d后有真葉萌發(fā)的一株真葉長大，但只有一片無其他真葉萌發(fā)；另兩株依然無真葉萌發(fā)跡象(圖11)，持續(xù)進行觀察。

22 ℃恒溫培養(yǎng)5 d后統(tǒng)計發(fā)芽情況，發(fā)芽率能夠達到65%，相比于文獻記錄50%～63%發(fā)芽率有所提高。

圖9 22 ℃培養(yǎng)15 d真葉開始萌發(fā)

圖10 準備移栽無菌苗

圖11 移栽后22 ℃恒溫培養(yǎng)13 d后情況

3.2.2GA3處理

GA3處理的種子在22 ℃恒溫培養(yǎng)35 d后，依然無發(fā)芽跡象(如圖12)。之后將種子置于4 ℃冰箱中處理15 d后，又將種子放置于22 ℃恒溫培養(yǎng)1 d后種子開始露白(如圖13)，但是發(fā)芽率低，僅為18%。由此可以看出，GA3對打破阿魏草種子休眠的效果沒有4 ℃層積效果好。而且用GA3浸泡處理可能對種子活力也會有影響，導致經(jīng)4 ℃處理后發(fā)芽率低。

圖12 GA3處理后22 ℃恒溫培養(yǎng)35 d后情況

圖13 經(jīng)4 ℃處理15 d后22 ℃培養(yǎng)1 d后情況

結(jié)果表明，在針對野生新疆阿魏實生繁殖率低的情況，可以采用人工組織培養(yǎng)技術(shù)的方式來提高繁殖效率，達到保護野生新疆阿魏目的的同時也為進一步進行馴化栽培提供了理論和實際的支持。對植物種子的變溫處理促使萌發(fā)[11]及對植物種子萌發(fā)抑制物的研究[12]，已經(jīng)在其他植物種子上有了成熟的研究。因此，對新疆阿魏種子萌發(fā)的抑制物研究還有待進一步研究，明確抑制物為阿魏種子人工繁殖提供科學依據(jù)。