網(wǎng)絡藥理學預測虎杖-吳茱萸抗痛風作用及驗證研究?

歐水平， 王 森， 楊建文， 王玉和△， 趙創(chuàng)榮

(1.遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院， 貴州 遵義 563000；2.遵義醫(yī)科大學， 貴州 遵義 563003；3.畢節(jié)市第一人民醫(yī)院， 貴州 畢節(jié) 551700)

痛風(gouty arthritis，GA)屬于中醫(yī)學“痹證”范疇，其病因包括內(nèi)因與外因，內(nèi)因主要指脾腎不足或肝腎陰虛，外因主要指外感邪氣及飲食失調(diào)，內(nèi)外因相結(jié)合導致濕、熱、 痰、瘀、毒等病邪痹阻經(jīng)絡、沉積于體內(nèi)。對于其治療，一般從清熱、化濕、祛痰、化瘀及補虛等治法入手[1]。目前治療痛風的藥物主要有秋水仙堿、丙磺舒、別嘌醇等，其副作用比較大，不宜久服[2]，故積極尋找高效低毒的抗痛風藥物具有重要的意義?；⒄葹檗た浦参锘⒄鹊母稍锔o和根，具有利濕退黃、散瘀止痛等功效，可用于治療風濕痹痛、濕熱黃疸等。吳茱萸具有散寒止痛、降逆止嘔等功效，可用于治療寒疝腹痛、寒濕腳氣等。文獻報道[3-5]以及本課題組前期研究[6，7]表明，虎杖和吳茱萸均具有較好的抗GA作用。

中醫(yī)藥治療疾病以“整體觀念”和“辨證論治”為理論指導，以“同病異治”和“異病同治”為治療原則。網(wǎng)絡藥理學是基于系統(tǒng)生物學的理論，融合多向藥理學、生物信息學及計算機科學等多個學科的技術(shù)和內(nèi)容，對中藥的多成分、多靶點以及多通路的特點分析，從多個角度將藥物成分靶點網(wǎng)絡與疾病靶點網(wǎng)絡相結(jié)合，系統(tǒng)全面地分析藥物的作用機制[8-11]。其在方法學上具有整體性、系統(tǒng)性的特點，與中醫(yī)藥的特點不謀而合。因此，本研究采用網(wǎng)絡藥理學方法，對虎杖-吳茱萸配伍治療痛風的主要活性成分、作用靶點及信號通路進行探索，分析其作用機制，并進行初步的藥理學實驗驗證，為低毒、高效抗痛風藥物的研制提供科學依據(jù)。本研究已通過遵義醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會審查，批準號倫審[2020]2-079號。

1 材料

1.1 動物

雄性清潔級SD大鼠60只，體質(zhì)量(200 ±20)g，購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，實驗動物許可證號SCXK(湘)2014-0011。飼養(yǎng)于SPF級實驗動物房，飼養(yǎng)溫度20～24 ℃，濕度40%～60%，12/12 h光照黑暗循環(huán)，自由攝食飲水。

1.2 試劑及儀器

尿酸(uric acid，UA)與黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XOD)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號分別為20181015、20181025)，白介素-6(interleukin 6, IL-6)、白介素-1β(interleukin 1β, IL-1β)、白介素-10(interleukin 10, IL-10)及白介素-17β(interleukin 17β, IL-17β)試劑盒(上海生工生物工程股份有限公司，批號201810)；虎杖-吳茱萸提取物(自制)。

1510全波長酶標儀(Thermo Fisher Scientific公司)；BCD-579WE冰箱(青島海爾股份有限公司)；KDC-2044低速冷凍離心機(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司)；HH-S6水浴鍋(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)。

1.3 藥品

尿酸鈉(Sigma公司，批號SU287501)；秋水仙堿片(廣東彼迪藥業(yè)有限公司，批號20190201)。

2 方法

2.1 活性成分收集與篩選

分別以“虎杖、吳茱萸”為檢索詞在傳統(tǒng)中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform, TCMSP, http：//sm.nwsuaf.edu.cn/lsp/tcmsp.php/)中查找虎杖和吳茱萸所含成分，以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、類藥性(drug-like，DL)≥0.18和半衰期(half life，HL)≥4為篩選指標，篩選虎杖、吳茱萸中的主要活性成分。其中OB值是評價藥物發(fā)揮藥效的重要指標，DL值代表成分與已知化學藥物的相似性，對確定中藥成分對機體產(chǎn)生活性具有重要參考價值[12]。

2.2 活性成分潛在靶點預測

采用TCMSP平臺獲得虎杖、吳茱萸活性成分的作用靶點，并通過Uniprot(http://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫將所獲得的靶點蛋白名轉(zhuǎn)換成對應的基因名。

2.3 GA相關靶點搜集

以“Gouty arthritis”為關鍵詞，通過檢索人類孟德爾遺傳綜合數(shù)據(jù)庫(online mendelian inheritance in man，OMIM)數(shù)據(jù)庫，獲取GA相關的靶點信息。

2.4 活性成分-GA潛在靶點可視化網(wǎng)絡構(gòu)建

通過Cytoscape 3.7.2軟件(http://www.cytoscape.org/)，構(gòu)建虎杖-吳茱萸活性成分-作用靶點相互作用關系網(wǎng)絡。

2.5 構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(protein-protein interaction network，PPI)

采用STRING(https://string-db.org/)在線數(shù)據(jù)庫對靶點蛋白間相互作用進行分析，將交集靶點信息導入STRING數(shù)據(jù)庫，物種選擇“Homo sapiens”，得到PPI網(wǎng)絡圖可視化。

2.6 基因本體(gene ontology，GO) 功能富集分析與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析

為進一步探索虎杖-吳茱萸治療GA靶點在基因功能和信號通路中的作用，本研究進而利用 DAVID 數(shù)據(jù)庫(https://david.Ncifcrf.gov/) 對篩選得到的靶點進行 GO 功能與KEGG 通路富集分析。

2.7 動物實驗驗證

2.7.1 分組、給藥及造模 雄性SD大鼠60只，按體質(zhì)量隨機分為正常組、模型組、秋水仙堿組0.28(mg/kg)、虎杖-吳茱萸提取物劑量組(65、130、260 mg/kg)6組，給藥劑量按等效劑量系數(shù)折算法計算，按10 mL/kg及每次給藥前的大鼠體質(zhì)量計算給藥容積。每天10∶00灌胃給藥，連續(xù)給藥14 d，空白組、模型組每天給予等體積生理鹽水，給藥12 d后造模，期間繼續(xù)給藥。造模方法參考本項目組前期研究成果[3]。

2.7.2 血清中UA、XOD及炎癥因子IL-6、IL-1β、IL-10、IL-17β含量測定 造模48 h后取材，將大鼠用7%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射，麻醉后腹主動脈取血，3500 r/min離心10 min取上清液，按相應的試劑盒說明書進行操作測定。

2.8 統(tǒng)計學方法

3 結(jié)果

3.1 活性成分搜集與篩選

表1示，在 TCMSP數(shù)據(jù)庫中篩選得到虎杖活性成分有7個，吳茱萸活性成分有23個，虎杖和吳茱萸均含有2個。

表1 TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選得到的虎杖-吳茱萸潛在活性成分比較

3.2 活性成分作用靶點預測與篩選

將搜集得到的32個虎杖-吳茱萸活性成分，在TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選去除無對應靶點蛋白的潛在活性成分，合并后最終得到虎杖-吳茱萸26個活性成分，靶點蛋白1057個。將活性成分對應的靶點蛋白通過Uniprot數(shù)據(jù)庫查詢其對應的基因，以對獲得藥物靶點蛋白的來源和基因信息進行校正，并獲得正確的編碼。

3.3 GA相關靶點搜集與活性成分靶點交集

表2示，在OMIM數(shù)據(jù)庫檢索到與GA相關的靶點有283個。將3.2獲得的虎杖-吳茱萸活性成分作用靶點與獲得的GA相關靶點-取兩者的交集，共獲得21個虎杖-吳茱萸潛在GA的作用靶點。

表2 疾病靶點和藥物活性成分靶點交集比較

3.4 活性成分-GA潛在靶點可視化網(wǎng)絡

圖1示，活性成分-GA潛在靶點可視化網(wǎng)絡圖的節(jié)點分別代表活性成分和疾病靶點，包括47個節(jié)點(26個活性成分和21個靶點)，有著112條相互作用關系。其中黃色三角形是共同作用靶點，綠色橢圓形是藥物活性成分。網(wǎng)路圖中化合物的平均度值為4.64，度值靠前的靶點有PTGS2、F7、MMP9、TP53、CDKN1A，其度值分別為19、13、9、8、7。度值靠前的化合物有白藜蘆醇(resveratrol)、槲皮素(quercetin)、吳茱萸次堿(Evodiamine)、大黃素(emodin)、芹菜素(apigenin)，其度值分別為17、13、10、9、8。活性成分和疾病靶點相互作用時以邊來連接，每個活性成分很多個靶點與其作用，每個靶點上也作用著很多種活性成分，體現(xiàn)了虎杖-吳茱萸多成分、多靶點的抗GA作用機制。

圖1 活性成分-疾病靶點可視化網(wǎng)絡圖

3.5 PPI 網(wǎng)絡的構(gòu)建與分析

圖2示，采用STRING數(shù)據(jù)庫對21個虎杖-吳茱萸潛在抗GA作用靶點進行PPI蛋白相互作網(wǎng)絡分析，獲得PPI網(wǎng)絡圖。PPI網(wǎng)絡圖的關鍵節(jié)點包括白介素β-1(IL1B)、白介素10(IL10)、白介素6(IL6)、血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)、C-C型趨化因子受體2(CCR2)。

圖2 PPI網(wǎng)絡圖

3.6 抗GA潛在靶點GO生物功能富集分析

表3示，對21個虎杖-吳茱萸潛在靶點抗GA進行GO生物功能富集分析，用于注釋基因參與的生物學過程，這21個共同靶點主要參與Regulate of response to external stimuli(調(diào)節(jié)對外部刺激的反應)、Regulation of lymphocyte proliferation(淋巴細胞增殖的調(diào)節(jié))、Regulation of inflammatory response(炎癥反應的調(diào)節(jié))、Regulation of cytokine biosynthesis process(細胞因子生物合成過程的調(diào)控)、positive regulation of response to external stimulus(對外部刺激反應的積極調(diào)節(jié))、positive regulation of leukocyte activation(積極調(diào)控白細胞激活)、myeloid leukocyte migration(骨髓白細胞遷移)、regulation of angiogenesis(白細胞趨化性)、cytokine-mediated signaling(血管生成的調(diào)節(jié)和細胞因子介導)的信號通路等生物學功能。

表3 虎杖-吳茱萸抗GA的 GO 生物功能富集分析比較

3.7 抗GA潛在靶點KEGG通路富集分析

表4示，對21個虎杖-吳茱萸潛在抗GA潛在靶點進行KEGG通路分析注釋，21個潛在靶點主要參與Cytokine-cytokine receptor interaction(細胞因子與細胞因子受體的相互作用)、African trypanosomiasis(非洲錐蟲病)、Malaria(瘧疾)、 Inflammatory bowel disease (IBD) [炎性腸病(IBD)]、Rheumatoid arthritis(類風濕關節(jié)炎)、Amoebiasis(阿米巴病)、 AGE-RAGE signaling pathway in diabetic Complicationsdis(IL-17信號通路)、HIF-1 signaling pathway(HIF-1信號通路)、FoxO signaling pathway(FoxO信號通路)、Jak-STAT signaling pathway(Jak-STAT)等信號通路。

表4 虎杖-吳茱萸抗GA的KEGG途徑富集分析比較

3.8 動物實驗結(jié)果

3.8.1 各組大鼠血清中UA和XOD水平的測定 表5示，與空白組比較，模型組UA和XOD水平明顯增高(P<0.01)；與模型組比較，秋水仙堿組、虎杖-吳茱萸高、中、低各劑量組均能顯著降低血清中UA及XOD水平(P<0.01)，且低、中、高劑量組呈量效關系。

3.8.2 各組大鼠血清中IL-6、IL-1β、IL-10、IL-17β含量測定 表5示，與空白組比較，模型組大鼠血清中IL-6、IL-1β、IL-17β水平顯著升高(P<0.01)，IL-10水平顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，秋水仙堿組、虎杖-吳茱萸高、中、低各劑量組IL-6、IL-1β、IL-17β水平含量均顯著降低(P<0.01或P<0.05)，IL-10水平顯著升高(P<0.01或P<0.05)。

表5 各組大鼠血清中各因子檢測結(jié)果比較

4 討論

GA是因尿酸鹽沉積在關節(jié)及其周圍軟組織而引起的組織病損及炎性反應。尿酸鈉沉積含量大或時間長，可出現(xiàn)關節(jié)軟組織破壞和腎功能受損[1]。由于目前臨床所使用的降尿酸藥物品種有限，而且具有嚴重不良反應，因此中藥在痛風輔助治療方面的作用日漸凸顯。中藥虎杖和吳茱萸中的活性成分具有抗GA的作用。有研究表明，虎杖中提取出的白黎蘆醇、虎杖苷、大黃素、大黃素等成分對GA都具有很好的療效作用，能減少前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)的含量，抑制關節(jié)局部細胞黏附分子-1(ICAM-1)和核轉(zhuǎn)錄因子-BP65(NF-BP65)的不正常表達與激活[13]?；⒄戎泻械幕钚猿煞只⒄溶站哂薪档瓦^高的血尿酸水平[14]；大黃素能減少尿酸合成，并促進尿酸的排泄。分子對接表明，虎杖中所含黃酮類和二苯乙烯類可抑制黃嘌呤氧化酶的活性，減少尿酸的生成[15]；白藜蘆醇可以緩解GA，減少中性粒細胞向關節(jié)腔的趨化，改善局部滑膜組織炎癥浸潤和增生；吳茱萸中含有的活性成分吳茱萸堿具有抗痛風、降尿酸、抗炎、鎮(zhèn)痛等作用[16，17]。成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑吳茱萸堿分散片在臨床有很好的降尿酸作用[3]。吳茱萸堿可能通過降低模型動物 XOD活性，發(fā)揮降血尿酸水平的作用[5]。

中藥化學成分復雜，作用靶點及機制不甚清楚，系統(tǒng)探索中藥藥對活性成分、作用靶點與通路間的關聯(lián)性，具有重要意義。通過虎杖-吳茱萸的活性成分-靶點-疾病網(wǎng)絡圖可以發(fā)現(xiàn)，虎杖-吳茱萸中有8個成分的度值和9個靶點的度值大于平均度值4.64。這8個活性成分能與GA的9個或9個以上靶點相互作用。通過GO功能和KEGG通路富集分析，有細胞因子與細胞因子受體的相互作用信號通路、類風濕關節(jié)炎信號通路、HIF-1信號通路、IL-17信號通路、Jak-STAT信號通路等，說明虎杖-吳茱萸抗GA具有多成分、多靶點、多通路的特點，其作用機制可能與這些通路密切相關，其中炎癥相關通路及炎癥因子發(fā)揮著重要作用，因此本研究通過體內(nèi)藥理實驗對炎癥相關通路及炎癥因子進行了驗證。

UA水平升高是痛風的生化學基礎。XOD直接調(diào)控體內(nèi) UA 水平的高低，XOD活性增強會使UA的生成增加，故抑制 XOD 的活性、降低UA的生成，是治療痛風性關節(jié)炎的重要機制[6]。動物驗證實驗發(fā)現(xiàn)，虎杖-吳茱萸各劑量組均能顯著降低急性GA模型大鼠血清中UA及XOD水平，且能顯著降低急性GA模型血清中IL-6、IL-1β、IL-17β含量并增加IL-10水平，說明其作用機制之一可能是通過炎癥相關通路，調(diào)控相關炎癥因子發(fā)揮抗GA的作用。該結(jié)果與網(wǎng)絡藥理學分析所得結(jié)果一致。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡藥理學預測了虎杖-吳茱萸抗GA的活性成分、作用靶點以及信號通路，其中活性成分可以調(diào)控多個靶點，關鍵靶點還同時調(diào)控多個重要信號通路，體現(xiàn)出虎杖-吳茱萸多靶點、多通路與多成分間的復雜網(wǎng)狀相互作用關系，進而通過動物實驗初步驗證了虎杖-吳茱萸可通過調(diào)控炎癥因子的表達發(fā)揮抗GA的作用。本項目組將以此研究為理論基礎，對虎杖-吳茱萸的活性成分及抗GA的作用機制進行更為深入的研究，為虎杖-吳茱萸抗GA的臨床應用及其相關產(chǎn)品的研發(fā)提供依據(jù)。