祖卡木顆粒通過抑制急性肺損傷大鼠MAPK信號(hào)通路抗炎作用機(jī)制研究?

侯帥紅， 韓林濤， 周禎祥， 黃 芳， 尹 強(qiáng),△， 韓祥志， 穆丹丹， 董雨薇

(1.新疆維吾爾藥業(yè)有限責(zé)任公司， 烏魯木齊 830000；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)， 武漢 430000)

炎癥反應(yīng)是一種保護(hù)宿主免受全身感染、協(xié)助機(jī)體恢復(fù)組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)的自身反應(yīng)，可由損傷、感染和刺激所引起[1]，因此炎癥反應(yīng)是一種重要的防御機(jī)制，對機(jī)體健康具有保護(hù)作用[2，3]。如果急性炎癥反應(yīng)在程度或持續(xù)時(shí)間上失常，則可導(dǎo)致眾多疾病的發(fā)生[1,3]。如上呼吸道感染嚴(yán)重時(shí)可引起支氣管炎乃至肺炎，失調(diào)的急性炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致急性肺損傷，進(jìn)而導(dǎo)致肺纖維化的發(fā)生，影響氣體間的交換。若病情不能得到及時(shí)有效的治療，可進(jìn)一步發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征、哮喘及慢性阻塞性肺疾病等肺部疾病。

祖卡木顆粒(zukamu granules，ZKMG)作為維吾爾醫(yī)特色制劑，具有調(diào)節(jié)異常氣質(zhì)及清熱、發(fā)汗、通竅等功效，用于治療感冒咳嗽、發(fā)熱無汗、咽喉腫痛、鼻塞流涕等[4]，其適應(yīng)癥屬于中醫(yī)學(xué)表證范疇，相當(dāng)于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)上呼吸道感染及傳染病初期的癥狀，多由鼻腔、咽喉部感染病原微生物引起，屬黏膜急性炎癥。有大量研究表明，ZKMG 具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎等功效，無明顯毒副作用[5-7]。另外，侯帥紅等圍繞ZKMG 揮發(fā)性成分和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在線分析方法預(yù)測到其發(fā)揮抗炎作用可能與花生四烯酸代謝、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路、核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)信號(hào)通路的激活有關(guān)[8]，但是還未有相關(guān)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。大鼠急性肺損傷模型由于其具有操作簡單，模型穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，目前在評價(jià)藥物抗炎活性時(shí)被廣泛使用[9]。本試驗(yàn)通過大鼠急性肺損傷模型，觀察ZKMG 對于大鼠肺組織炎性病理損傷的治療作用，并探討其抗炎的相關(guān)作用機(jī)制。本研究已通過湖北中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理批準(zhǔn)號(hào)HUCMS 201903001。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SD 大鼠6周齡雌雄各半，體質(zhì)量(200±25) g, 購自湖北省疾控中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(鄂)2015-0018)。適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，飼養(yǎng)環(huán)境為溫度22～26 ℃，相對濕度 50%～60%，人工光照明暗各12 h，給予標(biāo)準(zhǔn)飼料和純凈水喂養(yǎng)。

1.2 藥物

祖卡木顆粒(ZKMG，新疆維吾爾藥業(yè)有限責(zé)任公司，國藥準(zhǔn)字Z65050179)；脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)(Sigma公司，L2630)；地塞米松(dexamethasone，DEX)(Sigma公司，D1756)。

1.3 主要試劑

甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ，GAPDH)抗體(CST公司，#2118)；p38 MAPK 抗體(Abcam公司，ab170099)；磷酸化p38 MAPK 抗體(Abcam公司，ab47363)；細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK )抗體(Abcam公司，ab17942)；磷酸化ERK 1/2 抗體(Abcam公司，ab201015)；c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)抗體(Abcam公司，ab179461)；磷酸化JNK 抗體(Abcam公司，ab124956)；山羊抗兔IgG 抗體(Bioswamp公司，PAB16011)。大鼠(tumor necrosis factor，TNF)-α 定量酶檢測試劑盒(bioswamp 公司，RA20035)；大鼠白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-6 試劑盒(bioswamp 公司，RA20607)；大鼠IL-1β 試劑盒(bioswamp 公司，RA20020-S)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 LPS 誘導(dǎo)大鼠急性肺損傷[10]適應(yīng)性飼養(yǎng)結(jié)束后第2天，將48只SD 大鼠稱重，按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為對照組、模型組、陽性藥物DEX 組和祖卡木低、中、高劑量組各8只。祖卡木低、中、高劑量組大鼠每日分別給予祖卡木灌胃干預(yù)處理(1.35 g/kg，2.7 g/kg，5.4 g/kg，相當(dāng)于人服用劑量的9 g/60 kg，18 g/60 kg，36 g/60 kg)，連續(xù)給藥5 d，每天1次；對照組和模型組每日采用等體積生理鹽水進(jìn)行灌胃處理，DEX組大鼠僅在第5天進(jìn)行腹腔給藥DEX 處理，給藥劑量為5 mg/kg。第5天給藥結(jié)束1 h后，除空白對照組注射等體積生理鹽水外，其他各組大鼠均尾靜脈注射LPS(5 mg/kg)，誘導(dǎo)大鼠急性肺損傷。6 h后采用10%水合氯醛麻醉大鼠，收集肺組織和肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)，將肺組織部分置于10%多聚甲醛中固定，另一部分凍存于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 大鼠肺泡灌洗液收集 LPS 誘導(dǎo)6 h后采用10%水合氯醛麻醉大鼠，打開胸腔分離肺組織，于左主支氣管處結(jié)扎左肺進(jìn)行氣管插管，采用800 μL生理鹽水灌洗右肺反復(fù)3次，以回收液體積大于80%表示合格。收集的混合液采用4 ℃1500×g離心5 min，收集上清液，-80 ℃保存。

1.4.3 蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)觀察病理損傷情況 將大鼠肺組織置于10%多聚甲醛中進(jìn)行固定，然后梯度乙醇脫水、二甲苯透明和浸蠟，對組織樣本進(jìn)行石蠟包埋、切片，切片厚度為5 μm。按照HE 染色試劑盒說明書進(jìn)行操作，采用光學(xué)顯微鏡觀察肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)及病理學(xué)改變并拍片。

1.4.4 蛋白質(zhì)印記法(western blot，WB)檢測蛋白表達(dá) 將大鼠肺組織剪碎并用液氮研磨，收集組織至1.5 mL離心管內(nèi)，加入適量RIPA(強(qiáng))裂解液，經(jīng)組織勻漿和超聲處理后置于冰上繼續(xù)裂解直至裂解完全，經(jīng)4 ℃ 12000×g離心20 min取上清。采用BCA 蛋白濃度檢測法進(jìn)行總蛋白定量。取20 μg總蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，并轉(zhuǎn)膜至聚偏氟乙烯，使用5%脫脂牛奶(TBST配制)常溫封閉處理1.5 h，經(jīng)TBST洗膜后使用相應(yīng)的一抗稀釋液進(jìn)行孵育，4 ℃過夜。以兔抗p-JNK(1∶1000)、兔抗JNK(1∶1000)、鼠抗p-ERK1/2(1∶1000)、兔抗ERK1/2(1∶1000)、兔抗p-p38 MAPK(1∶1000)、p38 MAPK(1∶1000)為一抗，羊抗IgG(1∶20000)為二抗分別孵育后，取ECL 發(fā)光液A和B等量混勻，加在膜的正面與之充分接觸，并使用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀進(jìn)行檢測。

1.4.5 ELISA 檢測炎癥因子水平 將收集的大鼠BALF上清液，依據(jù)酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒說明書進(jìn)行操作，測量單位pg/mL，分別檢測炎癥因子TNF-α、IL-6 和IL-1β 的表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 ZKMG對急性肺損傷大鼠的肺組織病理形態(tài)學(xué)影響

圖1示，對照組大鼠的肺泡大小均一，肺泡壁較薄，無炎性細(xì)胞浸潤。模型組大鼠的肺泡壁明顯增厚，肺泡大小不均且明顯變小，存在大量的炎性細(xì)胞浸潤。陽性藥物DEX 組的肺泡壁仍舊增厚，但較模型組顯著降低且肺泡大小有所恢復(fù)。不同劑量的ZKMG 處理組也表現(xiàn)出不同程度的炎癥反應(yīng)，但與模型組比較，均表現(xiàn)出不同程度的緩解，其中高劑量ZKMG 組大鼠肺組織的炎癥情況改善效果最佳。

圖1 大鼠肺組織的病理形態(tài)學(xué)檢測比較(200×)

2.2 ZKMG 對炎癥因子表達(dá)水平的影響

圖2示，在LPS誘導(dǎo)大鼠急性肺損傷模型中，與正常組比較，模型組大鼠BALF中IL-6、IL-1β和TNF-α 含量急劇增加(P<0.001)；與模型組比較，DEX 組及中、高劑量ZKMG 組大鼠BALF 中炎癥因子水平均出現(xiàn)不同程度的下降(P<0.05)，這些結(jié)果表明，中、高劑量ZKMG 能夠減少相關(guān)炎癥因子的表達(dá)。

注：與對照組比較:***P<0.001; 與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001圖2 大鼠肺泡灌洗液中炎癥因子水平比較

2.3 ZKMG 對炎癥相關(guān)信號(hào)通路蛋白的影響

MAPK 家族信號(hào)通路是調(diào)控炎癥發(fā)生發(fā)展的重要通路之一[11]。為檢測ZKMG 是否通過MAPK 信號(hào)通路來發(fā)揮其抗炎作用，該實(shí)驗(yàn)分別對其家族蛋白p38、ERK 和JNK 的磷酸化水平進(jìn)行了檢測。圖3示，與對照組比較，模型組大鼠肺組織中p-p38、p-ERK、p-JNK 水平顯著升高(P<0.001)；與模型組比較，DEX 及ZKMG 各劑量組p-p38、p-ERK、p-JNK 表達(dá)量明顯降低(P<0.001，P<0.05)，提示ZKMG 能夠通過抑制MAPK 家族相關(guān)蛋白的磷酸化水平來發(fā)揮其抗炎作用。

注：與對照組比較：***P<0.001 ; 與模型組比較：#P<0.05；##P<0.01；###P<0.001圖3 大鼠肺組織MAPK 家族成員蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

MAPK 信號(hào)通路是調(diào)控細(xì)胞多項(xiàng)生命活動(dòng)的重要信號(hào)通路之一，與多種疾病的發(fā)生發(fā)展緊密相關(guān)[12]。在多種因素的刺激下，MAPK 蛋白家族成員發(fā)生磷酸化而被激活，進(jìn)而影響轉(zhuǎn)錄因子、酶類和細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白等表達(dá)，最終調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡和炎癥反應(yīng)等多種生命活動(dòng)。該通路主要包括p38 MAPK、ERK 和JNK 三條經(jīng)典的信號(hào)傳導(dǎo)通路，均可參與炎癥的調(diào)控，可通過促進(jìn)趨化因子的分泌誘導(dǎo)，造成更多巨噬細(xì)胞的活化、募集并產(chǎn)生多種促炎因子分泌，加劇局部的炎癥反應(yīng)[13，14]。且有研究表明，抑制MAPK 信號(hào)通路可改善多種炎性損傷[15，16]，達(dá)到緩解炎癥型疾病的作用，因此MAPKs 是一些炎癥性疾病的潛在治療靶點(diǎn)。LPS 能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中p38 MAPK 和JNK 發(fā)生磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生[17]。劉振寧等[18]研究也發(fā)現(xiàn)，急性肺損傷大鼠肺組織中存在嚴(yán)重的炎性反應(yīng)，且與MAPK 信號(hào)通路的活化密切相關(guān)。在本實(shí)驗(yàn)中，急性肺損傷大鼠肺組織中存在嚴(yán)重的炎性損傷，且p-p38、p-ERK 和p-JNK 表達(dá)量也明顯上升，給予ZKMG 干預(yù)治療后，大鼠急性肺損傷組織中的炎性病理損傷得到了有效改善。

巨噬細(xì)胞是吞噬性白細(xì)胞，在先天免疫炎癥反應(yīng)中起重要作用?；罨木奘杉?xì)胞分泌各種細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6和其他炎性細(xì)胞因子[19]，通過激活適應(yīng)性免疫反應(yīng)和惡化炎癥反應(yīng)顯示多效性。中藥控制炎性細(xì)胞因子與抗炎治療效果存在直接聯(lián)系，是其抗炎效果發(fā)揮的基礎(chǔ)條件。其中，TNF-α 是一種重要的促炎介質(zhì)，參與多種炎癥的信號(hào)通路，而且可以調(diào)節(jié)其他炎性細(xì)胞因子的合成和釋放，促進(jìn)黏附分子的表達(dá)，促進(jìn)LPS 引發(fā)的肺損傷的進(jìn)展。IL-6主要是刺激免疫細(xì)胞的增殖和分化，參與機(jī)體的免疫應(yīng)答，并能有效促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞對炎癥介質(zhì)及黏附分子的表達(dá)，進(jìn)而增加炎癥反應(yīng)，是一種促炎因子。IL-1β 在免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)中起重要作用，它能夠促進(jìn)T細(xì)胞和B細(xì)胞的增殖分化，對中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞有趨化和增強(qiáng)作用，還能夠誘導(dǎo)IL-2、IL-6和TNF 等細(xì)胞因子的產(chǎn)生，因此它們是檢測炎癥反應(yīng)的常見指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)[20]，在急性肺損傷模型中，LPS 能夠誘導(dǎo)IL-6、IL-1β和TNF-α 等的合成和分泌。在本試驗(yàn)中，急性肺損傷大鼠BALF 中炎癥因子的表達(dá)量出現(xiàn)一定程度的升高，與既往研究結(jié)果一致。給予中藥ZKMG 干預(yù)后，模型大鼠BALF 中炎性因子的水平顯著下降，且高劑量的ZKMG效果最為顯著。

DEX 是臨床廣泛使用的長效糖皮質(zhì)激素，常用于治療炎癥、過敏及自身免疫性疾病等。DEX 可以從基因水平調(diào)控炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，抑制促炎癥因子的釋放。雖然DEX 具有強(qiáng)效的抗炎作用，但長期服用容易產(chǎn)生毒副作用[21]。ZKMG 是維吾爾醫(yī)藥秘方經(jīng)改良后研制的復(fù)方制劑，由山柰、罌粟殼、洋甘菊、大棗、薄荷、甘草、蜀葵子、睡蓮花、大黃、破布木果10 味天然藥材組成，具有解熱、鎮(zhèn)痛和抗炎的作用，已被廣泛應(yīng)用于治療急性上呼吸道感染等[22-24]。盡管祖卡木的臨床療效已被證實(shí)，但其具體抗炎作用機(jī)制目前尚不明確，MAPKs 蛋白是否是祖卡木抗炎的作用靶點(diǎn)，目前還未見報(bào)道。既往研究發(fā)現(xiàn)，薄荷酚類成分和蒙花苷能夠抑制MAPK 通路蛋白JNK、ERK1/2、p38 MAPK 的磷酸化水平，減少促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β 的表達(dá)量[25]。甘草中多種成分如甘草素、甘草酸、異甘草酸鎂、黃烷酮和甘草查而酮均能抑制炎癥因子表達(dá)和MAPK 相關(guān)蛋白的磷酸化水平發(fā)揮抗炎活性[26-30]。Feng 等研究發(fā)現(xiàn)，大黃通過抑制MAPKs 的激活及炎癥介質(zhì)的表達(dá)降低胰腺炎的程度[31]。Hu 等研究發(fā)現(xiàn)，蘆薈大黃素可顯著抑制IL-6和IL-1β 基因的mRNA 表達(dá)水平，ERK、p38、JNK 和Akt 的磷酸化來抑制巨噬細(xì)胞中LPS 誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[32]。前人研究顯示[33，34]，山柰、大棗等也與MAPK 信號(hào)通路關(guān)系密切。在本試驗(yàn)中，為探究MAPK信號(hào)是否參與大鼠急性肺損傷中祖卡木介導(dǎo)的抗炎作用，通過蛋白質(zhì)印跡評估了ERK、p38 MAPK 和JNK 的磷酸化水平。給予祖卡木各劑量組干預(yù)后，p38 MAPK、ERK 和JNK 的磷酸化水平顯著降低，提示ZKMG 可能是通過抑制MAPK 信號(hào)通路發(fā)揮其抗炎效應(yīng)的。

綜上所述，ZKMG 具有顯著的抗炎作用，其具體作用機(jī)制可能與抑制MAPK 信號(hào)通路的活化和炎癥因子的釋放有關(guān)。