五子衍宗丸預(yù)防神經(jīng)管畸形的機制研究?

楊嬋娟， 樊慧杰△， 柴 智， 李艷榮， 王新亮， 趙志偉， 彭 濤， 馬存根,3△

(1.山西中醫(yī)藥大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)研究中心， 山西 晉中 030619；2.山西省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院， 太原 030013；3.山西大同大學(xué)腦科學(xué)研究所， 山西 大同 037009)

神經(jīng)管畸形(neural tube defects，NTDs)由神經(jīng)管閉合不全所引起，以無腦畸形、腦膨出和顱脊柱裂為主要癥狀，部分可表現(xiàn)為無眼畸形、下肢癱瘓及二便失禁，是最嚴重的新生兒畸形[1]。我國是世界上已知的NTDs高發(fā)國，發(fā)病率是全球平均發(fā)病率的10倍[2，3]，有些地區(qū)甚至高達5.57‰，這給患者家庭和社會帶來了無盡的痛苦和沉重的負擔(dān)。葉酸(folic acid，F(xiàn)A)是目前國際上預(yù)防NTDs的唯一用藥，將NTDs的發(fā)病率降低了60%～70%[4，5]，但這并不能阻止所有NTDs的發(fā)生。氧化應(yīng)激(oxidative stress，OS)是指體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡，導(dǎo)致體內(nèi)氧化程度超出抗氧化物的清除速度，從而產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物，并引起組織和細胞損傷的一種反應(yīng)[6]。OS參與各種神經(jīng)變性疾病的發(fā)生發(fā)展，研究表明，幾乎所有的NTDs都存在不同程度的氧化應(yīng)激損傷[7，8]。

中醫(yī)學(xué)認為，腎藏先天之精，為生命之本源，腎中精氣具有促進生殖繁衍和促進生長發(fā)育的功能[9]。腎虛精虧是NTDs發(fā)生的基本病機。中醫(yī)經(jīng)典補腎方劑五子衍宗丸(wuzi yanzong pill，WYP)有補腎益精填髓的功效，可有效預(yù)防NTDs的發(fā)生。課題組研究發(fā)現(xiàn)，WYP可以降低NTDs發(fā)病率，且4.2 g/kg預(yù)先給藥效果最佳[10]。前期采用超高液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法在WYP中未檢測出FA成分，因此WYP對NTDs的預(yù)防作用與FA無關(guān)。在此基礎(chǔ)上，本課題采用全反式維甲酸(all-trans-retinoic acid，atRA)建立NTDs模型[11]，運用分子生物學(xué)技術(shù)研究并比較WYP與FA對NTDs的預(yù)防作用，探討WYP預(yù)防NTDs可能的抗氧化應(yīng)激機制。本研究已通過山西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會審查，倫理學(xué)批準號2019DW020。

1 材料

1.1 動物

SPF級清潔級未經(jīng)產(chǎn)C57BL/6小鼠36只，8～10周齡，其中雌性24只，雄性12只，平均體質(zhì)量18 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，實驗動物許可證號SCXK(京)2016-0006。飼養(yǎng)于無病原菌動物房適應(yīng)性1周，繁殖期飼料喂養(yǎng)，動物自由進食和飲水，溫度控制在(22±2)℃，相對濕度40%～60%，自然光照，通風(fēng)良好。

1.2 藥物

葉酸片(北京斯利安藥業(yè)有限公司，批號S181112，每片0.4 mg)。將藥片置于清潔的研缽中，用研杵磨成均勻的粉末，加入生理鹽水使其充分溶解，配制成濃度2.44 μg/mL的FA藥液，4 ℃冰箱避光儲存。

五子衍宗丸以枸杞子、菟絲子(炒)、覆盆子、五味子(蒸)和鹽車前子為原料，煉蜜為丸，由北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠生產(chǎn)(批號18035041)。將藥丸用中藥粉碎機打成超細粉末，過篩，加生理鹽水使其溶解均勻，配制成濃度為0.168 g/mL的WYP藥液，4 ℃冰箱儲存?zhèn)溆?，臨用前取出回溫。

1.3 試劑與儀器

全反式維甲酸(all-trans-retinoic acid，atRA)(美國Sigma公司，批號WXBC4500V)；還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)試劑盒(批號20190530)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒(批號20190813)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)試劑盒(批號20190712)，南京建成生物工程研究所；Western blot相關(guān)抗體：過氧化氫酶(catalase，CAT)(美國Cell Signaling Technology公司，批號14097)；HRP標記的山羊抗兔二抗(愛必信(上海)生物科技有限公司，批號AS005)；BCA蛋白定量檢測試劑盒(上海生工生物技術(shù)有限公司，批號F814DA0001)；RIPA蛋白裂解液(批號011918100315)、PMSF(批號061918180704)，碧云天生物技術(shù)有限公司。

EZ4D型體視顯微鏡(德國Leica公司)；5840型高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)；C-1150型酶標儀(德國Leica公司)；PowerPacTM型電泳儀(美國Bio-Rad公司)；HOOD-Ⅱ型凝膠成像分析儀(美國Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 NTDs模型制備

下午6時，將小鼠按雌性∶雄性=2∶1合籠交配，次日晨8時逐一檢查陰道栓，將觀察到有黃白色陰道分泌物的雌鼠標記并分籠喂養(yǎng)，當(dāng)天中午12時記作孕0.5 d，未發(fā)現(xiàn)陰栓的雌鼠繼續(xù)合籠，5 d為1個周期。按照隨機數(shù)字表法將孕鼠分為正常組、模型組、FA組和WYP組4組各6只。實驗組于孕7.5 d(受孕第7天中午12時)給予一次性腹腔注射atRA混懸液0.2 mL，正常組給予相應(yīng)量的橄欖油。atRA混懸液(7.5 mg/kg)用無水乙醇和橄欖油按8∶92比例配制，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.2 給藥

從檢出陰道栓第0.5天起進行藥物干預(yù)，持續(xù)至第11.5天。模型組和正常組給予生理鹽水灌胃，F(xiàn)A組給予FA藥液(2.44 μg/mL)，WYP組給予WYP藥液(0.168 g/mL)，灌胃體積25 μL·g-1·d-1。

2.3 取材

藥物干預(yù)至第11.5天脫頸處死孕鼠，用針頭固定于板上。剖腹取出子宮段，于冰上剝離子宮及胎膜，將胚胎置于4 ℃生理鹽水中。體視顯微鏡下觀察胚胎，拍照、鑒定畸形并計算畸形率。正常孕鼠子宮未見充血，吸收胎較罕見，鏡下觀察小鼠胚胎腦泡發(fā)育完整，有胎心搏動；NTDs孕鼠子宮充血，其胚胎可出現(xiàn)顱脊柱裂畸形、無眼畸形、單眼畸形、面部畸形等，吸收胎多見，鏡下觀察其發(fā)育多不完整，且較正常胚胎發(fā)育遲緩，其中顱脊柱裂畸形胚胎未見到完整的腦泡。本文將肉眼及鏡下觀察到的除正常胚胎外的所有胚胎記作NTDs胚胎，將4組收集到的胚胎分別裝入EP管，于-80 ℃冰箱中備用。

2.4 檢測指標及方法

2.4.1 微量酶標法檢測胚胎組織GSH含量 將液氮加入并浸滿研缽，先取出1個組的胚胎組織將其迅速轉(zhuǎn)移至研缽內(nèi)，使用研杵在液氮中把組織研磨成粉末狀，其余各組制法相同。將各組所得粉末一分為二，取其中一半稱重，按照重量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例加入4 ℃生理鹽水，冰上研磨至均勻，高速冷凍離心機(4 ℃，2500 r/min)離心10 min，取上清液制成10%組織勻漿液，一部分檢測組織濃度，其余分裝備用。取以上勻漿液按照GSH試劑盒說明書步驟規(guī)范操作，酶標儀檢測405 nm處各孔的吸光度值，根據(jù)測得的濃度計算組織中GSH的含量。

2.4.2 黃嘌呤氧化酶法檢測胚胎組織SOD活力 取2.4.1中10%組織勻漿液，依據(jù)SOD試劑盒說明書步驟規(guī)范操作，酶標儀檢測450 nm處各孔的吸光度值，計算胚胎組織中SOD抑制率及活力。

2.4.3 比色法檢測胚胎組織GSH-Px活力 取2.4.1中10%組織勻漿液，依據(jù)GSH-Px試劑盒說明書步驟規(guī)范操作，酶標儀檢測532 nm處各孔的吸光度值，計算胚胎組織中GSH-Px抑制率及活力。

2.4.4 Western blot檢測胚胎組織中CAT的蛋白表達 取2.4.1中各組剩余的一半胚胎組織粉末，加RIPA、PMSF在冰上裂解提取組織蛋白，BCA法測定蛋白濃度。各組按4∶1比例加Loading buffer制備蛋白上樣緩沖液樣品，用10% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜(恒流200 mA，2 h)，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST洗滌10 min×4次。加入抗CAT抗體(1∶1000，TBST稀釋)，4 ℃冰箱過夜。洗膜并加入HRP耦聯(lián)的山羊抗兔二抗(1∶5000，TBST稀釋)，室溫孵育2 h。膜洗凈，滴加ECL化學(xué)發(fā)光液(A∶B=1∶1)，采用Bio-Rad凝膠成像分析儀檢測條帶，Image J 1.4軟件進行灰度值比較并進行統(tǒng)計分析。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 小鼠胚胎形態(tài)學(xué)觀察

圖1示，胚胎正常發(fā)育良好，頭顱飽滿，神經(jīng)管完全閉合，外形完整，色澤正常(見圖1A)；神經(jīng)管畸形胚胎以顱脊柱裂為主，少數(shù)可見無眼畸形、單眼畸形和面部畸形。顱脊柱神經(jīng)管未閉合伴發(fā)育遲緩，形態(tài)各異，有瘀血狀外觀表現(xiàn)(見圖1B)；無眼畸形胚胎：胚胎未見眼泡及眼珠，發(fā)育遲緩，呈現(xiàn)瘀血狀外觀(見圖1C)。

注：A.正常胚胎；B.顱脊柱裂畸形胚胎；C.無眼畸形胚胎圖1 小鼠胚胎形態(tài)學(xué)觀察比較

3.2 小鼠NTDs發(fā)病率統(tǒng)計

圖2示，與正常組比較，模型組NTDs發(fā)病率顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，F(xiàn)A組、WYP組NTDs發(fā)病率均顯著降低(P<0.05，P<0.01)；與FA組比較，WYP組NTDs發(fā)病率明顯降低(P<0.05)。結(jié)果表明，WYP與FA都可以降低NTDs發(fā)病率，且WYP的預(yù)防效果優(yōu)于FA。

注：*P<0.05，**P<0.01圖2 各組小鼠NTDs發(fā)病率統(tǒng)計比較(n=6)

3.3 WYP對NTDs小鼠胚胎組織GSH含量，SOD和GSH-Px活力的影響

圖3、4示，與正常組比較，模型組GSH含量SOD、GSH-Px活力顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，F(xiàn)A組、WYP組GSH含量及SOD、GSH-Px活力均顯著升高(P<0.05，P<0.01)；與FA組比較，WYP組GSH含量及SOD、GSH-Px活力明顯升高(P<0.05)。結(jié)果表明，WYP可能增加NTDs小鼠體內(nèi)抗氧化酶的含量。

注：*P<0.05，**P<0.01圖3 各組小鼠胚胎組織中GSH含量差異比較(n=6)

注：*P<0.05，**P<0.01圖4 各組小鼠胚胎組織中SOD、GSH-Px活力差異比較(n=6)

3.4 WYP對NTDs小鼠胚胎組織CAT蛋白的影響

圖5示，Western blot結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組CAT蛋白表達顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，F(xiàn)A組、WYP組CAT表達顯著升高(P<0.05，P<0.01)；與FA組比較，WYP組CAT表達明顯升高(P<0.05)。結(jié)果表明，WYP組的CAT蛋白表達高于FA組。

注：與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01圖5 各組小鼠胚胎組織中CAT蛋白表達差異比較(n=6)

4 討論

NTDs是由胚胎發(fā)育早期神經(jīng)管閉合障礙所引起的，主要影響腦和脊髓的嚴重先天性畸形并有多種臨床表型，其中以無腦畸形和顱脊柱裂最具代表性[12]。氧化應(yīng)激指機體內(nèi)活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)生成過多，或機體抗氧化能力不足，導(dǎo)致神經(jīng)元、髓鞘等被嚴重破壞，是引起NTDs的一個重要因素[13]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)傳遞各種信號，其耗能多、耗氧大、ROS產(chǎn)生多且易積累。神經(jīng)元細胞富含不飽和脂肪酸，且自身GSH含量低，易與自由基發(fā)生反應(yīng)，發(fā)生過氧化損傷。有專家研究證明[14]，在諸多神經(jīng)系統(tǒng)病變中均有ROS含量增加的現(xiàn)象。研究指出，使用抗氧化應(yīng)激藥物可以減少自由基的生成，進而減緩機體內(nèi)神經(jīng)元的變性和死亡[13]。因此清除過多氧化中間產(chǎn)物，修復(fù)氧化應(yīng)激所引起的損傷，可以有效地預(yù)防NTDs的發(fā)生[15]。

NTDs的基本病機是腎虛精虧，WYP是中醫(yī)補腎益精經(jīng)典方，源于明代《攝生眾妙方》，由枸杞子、菟絲子(炒)、覆盆子、五味子(蒸)和鹽車前子組成，5味藥均為植物種子。枸杞子、菟絲子(炒)補腎陽、益精血，共為君藥；五味子(蒸)、覆盆子補腎固澀共為臣藥；鹽車前子瀉有形之邪，利尿固精[16]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，WYP具有抗氧化、抗炎細胞浸潤、抗腫瘤及增強免疫力等作用[17]。枸杞子可以抗脂質(zhì)過氧化，降低組織中丙二醛含量；五味子可以提高SOD和GSH活性，減輕活性氧自由基損害，維持細胞膜在氧化損傷狀態(tài)下的穩(wěn)定性；車前子具有抗氧化和清除氧自由基作用[18-20]。有研究表明，WYP維持氧化與抗氧化平衡，通過促進精子增殖治療男性不育癥[21]。

GSH和SOD是細胞內(nèi)重要的抗氧化劑，能有效清除過氧化物，調(diào)節(jié)機體氧自由基代謝，發(fā)揮抗氧化作用[22，23]。CAT和GSH-Px是過氧化物分解酶，能將有毒的過氧化物催化成無毒的羥基化合物，使細胞膜結(jié)構(gòu)保持完整，功能不受損害[24]。本研究結(jié)果顯示，WYP和FA都可以降低小鼠NTDs的發(fā)生率，增加GSH含量，提高SOD和GSH-Px的活力，上調(diào)CAT表達水平，且WYP的預(yù)防效果明顯優(yōu)于 FA。

綜上所述，WYP能顯著降低小鼠NTDs的發(fā)病率，有效預(yù)防NTDs的發(fā)生，其作用機制可能是WYP激活小鼠體內(nèi)抗氧化功能，減弱脂質(zhì)過氧化程度，清除過氧化產(chǎn)物，阻止自由基的入侵，從而對抗氧化應(yīng)激。本課題為WYP預(yù)防NTDs運用于臨床提供了實驗依據(jù)。