線粒體糖尿病家系MT-TL1基因m.3243A>G突變1例臨床特征分析

楊 玉，吳貴員，黃 慧，陳 卡，熊 婷

(江西省兒童醫(yī)院、南昌大學(xué)附屬兒童醫(yī)院a.內(nèi)分泌遺傳代謝科;b.中心實(shí)驗(yàn)室，南昌330006)

線粒體糖尿病(mitochondrial diabetes mellitus，MDM)是一組由于線粒體呼吸鏈和氧化磷酸化系統(tǒng)功能障礙引起的臨床異質(zhì)性疾病，屬于特殊類型糖尿病，線粒體DNA MT-TL1基因m.3243A>G突變是其最常見的原因，因其具有母系遺傳特征且多伴耳聾故又稱為母系遺傳糖尿病伴耳聾(maternally inherited diabetes and deafness，MIDD)[1]。多系統(tǒng)損害是MDM的臨床特征[2]，通常包括腦、肝臟、骨骼肌、內(nèi)分泌腺和心臟在內(nèi)的依賴能量高的器官都會(huì)受到影響。本文通過(guò)以下標(biāo)準(zhǔn)篩選線粒體糖尿病家系，分析家系成員臨床表型特征及基因突變情況，為臨床早期診斷以及治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 病例篩查

對(duì)江西省兒童醫(yī)院內(nèi)分泌遺傳代謝科2016年1月至2019年12月收治的161例糖尿病患兒進(jìn)行篩選，篩選標(biāo)準(zhǔn)：1)按相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[3]確診為糖尿病[3]；2)年齡<16歲；3)合并多系統(tǒng)損傷(多系統(tǒng)是指等于或大于3個(gè)系統(tǒng))；4)具有明顯的母系遺傳特征。本研究經(jīng)過(guò)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，征得患兒監(jiān)護(hù)人及其他家系成員知情同意。

1.2 先證者病例資料

161例糖尿病患兒中篩查出疑似母系遺傳糖尿病家系1例。先證者，女，13歲8個(gè)月，反復(fù)尿糖、尿蛋白陽(yáng)性1周入院?，F(xiàn)病史：患兒近13年生長(zhǎng)緩慢，生長(zhǎng)速率不詳。運(yùn)動(dòng)和智力發(fā)育落后，無(wú)聽力、嗅覺障礙，無(wú)其他慢性疾病等，多次尿常規(guī)提示“尿糖、尿蛋白陽(yáng)性”。精神可，食納欠佳，睡眠好，大小便正常。既往史：12歲時(shí)因闌尾炎行闌尾切除術(shù)，曾有“外陰炎”病史，眼科體檢異常(具體不詳)。個(gè)人史：G2P1，胎齡30周，剖宮產(chǎn)，無(wú)產(chǎn)時(shí)缺氧窒息史。出生體重2 kg，身長(zhǎng)不詳，人工喂養(yǎng)，生長(zhǎng)發(fā)育較同齡兒落后，2年前初潮。家族史：父親健康，母親、外婆、舅舅均患糖尿病，外公、阿姨、妹妹目前身體健康，均否認(rèn)近親結(jié)婚。

體格檢查：身高135 cm(-3.9SDS，SDS：標(biāo)準(zhǔn)偏差分?jǐn)?shù))，坐高72 cm，體重29 kg(-2.58SDS)，BMI15.9 kg·m-2，血壓102/65 mmHg(1 mmHg=1.33 kPa)。身材勻稱，皮膚偏黑，無(wú)水腫，雙上臂及背部毳毛多(F-G評(píng)分6分)，后發(fā)際線低，心、肺、腹部、脊柱、四肢無(wú)異常，腎區(qū)無(wú)叩擊痛，神經(jīng)征(-)，雙乳房B4，腋毛A1，陰毛PH1。

輔助檢查：24 h尿蛋白86 mg·24 h-1(3.2 mg·24 h-1)，尿微量白蛋白58.06 mg·L-1(0～30 mg·L-1)，葡萄糖口服耐量試驗(yàn)2 h血糖 9.29 mmol·L-1(<11.1 mmol·L-1)，HbA1c 5.50%，谷氨酸脫羧酶抗體和抗人胰島素抗體陰性。血?dú)夥治鎏崾敬x性酸中毒，血乳酸 4.5 mmol·L-1↑(正常值0.7～2.1 mmol·L-1)，血氨 38 μmol·L-1(正常值18～72 μmol·L-1)。血常規(guī)、肝腎功能、血脂、甲功五項(xiàng)、皮質(zhì)醇、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-3均正常。性激素：黃體生成素(LH)9.90 mU·mL-1，卵泡刺激素(FSH)5.32 mU·mL-1，孕酮(P)0.29 ng·mL-1，雌二醇(E2)249.74 pg·mL-1，泌乳素(PRL)12.33 ng·mL-1，睪酮(T)42.08 ng·dL-1。血串聯(lián)質(zhì)譜正常。染色體：46，XX。腹部彩超未及明顯異常。骨齡(G-P法)：10歲。心電圖正常。

1.3 家系其他成員的病史資料

先證者外公，男，72歲，身高165 cm(-1.26SDS)，體重63 kg(+0.22SDS)，BMI 23.2 kg·m-2，有高血壓病史，在予以降血壓藥物治療(具體藥物不詳)。

先證者外婆，女，70歲，身高144 cm(-3SDS)，體重34 kg(-3.2SDS)，BMI 16.5 kg·m-2。58歲出現(xiàn)雙側(cè)聽力障礙，伴左側(cè)偏盲，65歲診斷糖尿病，偶有左側(cè)偏頭痛，在當(dāng)?shù)蒯t(yī)院檢測(cè)有乳酸酸中毒，現(xiàn)予以口服降糖藥(具體藥物不詳)治療，血糖控制良好。

先證者舅舅，男，40歲，身高156 cm(-2.7SDS)，體重37.7 kg(-3.05SDS)，BMI 15.5 kg·m-2。28歲診斷糖尿病，30歲出現(xiàn)雙側(cè)耳鳴、聽力下降和雙眼視力減低，晨起經(jīng)常神志恍惚，在當(dāng)?shù)蒯t(yī)院檢測(cè)有乳酸酸中毒，現(xiàn)予以胰島素皮下注射治療，血糖控制良好。

先證者阿姨，女，36歲，身高152 cm(-1.59SDS)，體重40 kg(-2SDS)，BMI 17.3 kg·m-2，目前身體健康。

先證者父親，男，42歲，身高170 cm(-0.44SDS)，體重67.3 kg(+0.5SDS)，BMI 23.3 kg·m-2，目前身體健康。

先證者母親，女，35歲，身高148 cm(-2.3SDS)，體重34 kg(-3.1SDS)，BMI 15.6 kg·m-2。20歲診斷糖尿病，26歲出現(xiàn)雙側(cè)聽力障礙，伴雙側(cè)視力下降，平時(shí)經(jīng)常有中上腹疼痛，在當(dāng)?shù)蒯t(yī)院檢測(cè)有乳酸酸中毒，現(xiàn)予以胰島素皮下注射治療，血糖控制良好。

先證者妹妹，女，12歲，身高136 cm(-2.56SDS)，體重30 kg(-1.3SDS)，BMI 16.2 kg·m-2，智力落后，學(xué)習(xí)能力成績(jī)差，余無(wú)不適。

1.4 線粒體DNA MT-TL1基因檢測(cè)

采集先證者及其家系成員的外周血3 mL。按照試劑盒說(shuō)明書提取DNA(北京，TIANGEN)，設(shè)計(jì)MT-TL1 3243位點(diǎn)篩查引物：mtDNA3243-F1：5′-TTGGATCAGGACATCCCGATGGTGCAG-3′，mtDNA3243-R1：5′-GTTTTAGGGGCTCTTTGGTGAAGAGT-3′，配制20 μL PCR反應(yīng)體系，擴(kuò)增條件為：95 ℃ 5 min、95 ℃ 30 s、退火 1 min、72 ℃ 1 min、35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min。將PCR產(chǎn)物適量加入提前配置好的2%瓊脂糖凝膠，置于電泳槽中，120 V恒壓電泳30 min后，攝像并觀察電泳條帶。

ApaⅠ酶切PCR產(chǎn)物鑒定家系成員MT-TL1基因m.3243A>G點(diǎn)突變。取所得PCR反應(yīng)產(chǎn)物各50 μL，送上海生工基因公司檢測(cè)MT-TL1基因。

2 結(jié)果

2.1 ApaⅠ酶切電泳結(jié)果

線粒體基因PCR產(chǎn)物經(jīng)ApaI酶切后，含有m.3243A>G點(diǎn)突變的基因會(huì)被切成兩條片段，在6%聚丙烯酰胺凝膠電泳中顯影兩條帶，而不含該位點(diǎn)突變的野生型基因不會(huì)被酶切，在6%聚丙烯酰胺凝膠電泳中顯影一條帶。如圖1所示，先證者及其外婆、舅舅，母親、小姨、妹妹的線粒體基因提示存在突變。

0:未酶切；1：酶切后；a：舅舅；b：父親；c：母親；d：妹妹；e：外公；f：外婆；g：小姨；h：先證者。

2.2 基因測(cè)序結(jié)果

先證者及其外婆、舅舅、小姨和母親存在MT-TL1基因m.3243A>G點(diǎn)突變(圖2紅箭頭所示)。

有線粒體3243A>G點(diǎn)突變：Ⅰ2為先證者外婆，Ⅱ1為先證者舅舅，Ⅱ2為先證者小姨，Ⅱ3為先證者母親，Ⅲ1為先證者；無(wú)線粒體3243A>G點(diǎn)突變：Ⅰ1為先證者外公，Ⅱ4為先證者父親，Ⅲ2為先證者妹妹。

2.3 該家系成員的主要臨床特征

該家系共3代，母系成員有6人，4人患病，分別為先證者及其外婆、舅舅、母親。先證者Ⅲ1診斷為糖耐量受損；其外婆、舅舅、母親診斷為糖尿病。

主要臨床特征為身材矮小5人(83.3%)，聽力障礙3人(50%)，視力受損4人(66.7%)，智力落后2人(33.6%)，乳酸酸中毒4人(66.7%)；其他表現(xiàn)為腎臟損傷、胃腸道癥狀、偏頭痛、運(yùn)動(dòng)發(fā)育落后、腎臟損傷、間斷性神志不清各1人。詳見表1。

表1 該家系6位母系成員主要臨床特征

2.4 家系圖譜

該家系圖譜如圖3，顯示先證者家系具有明顯的母系遺傳特征，三代人中共有5人攜帶突變基因，4人發(fā)病。

圖3 家系圖譜

3 討論

MDM即MIDD屬于線粒體疾病，它是由線粒體DNA(mtDNA)基因突變引起的一類疾病，最常見突變類型為m.3243A>G 點(diǎn)突變。由于基因突變，線粒體氧化磷酸化基因的翻譯過(guò)程出現(xiàn)異常，造成ATP合成減少；突變致高毒性O(shè)H-物質(zhì)增多，引起DNA破壞，都可能是致病的原因[4]，最終發(fā)生相關(guān)的多種臨床表型。

3.1 MDM的臨床特征

MDM的臨床特征有：1)呈母系遺傳特征，女性患者子代幾乎都攜帶此突變基因，但不一定都患病，男性患者后代一般不攜帶此突變基因；2)糖尿病發(fā)病年齡大部分在40歲之前，大部分發(fā)病于成年期，青少年發(fā)病少見；3)大多數(shù)患者的體形正?；蚱?，平均BMI小于20 kg·m-2[5]；4)胰島自身抗體檢測(cè)大部分為陰性；5)糖代謝異常合并多系統(tǒng)損傷表現(xiàn)，如身材矮小、聽力異常、視力下降、腎病、肌病、線粒體腦肌病、心肌病等[6]。

身材矮小在線粒體疾病患者中很常見[7]，下丘腦-垂體軸功能障礙被認(rèn)為是其發(fā)病機(jī)制，已有報(bào)道證實(shí)生長(zhǎng)激素治療能夠有效地改善一些患者的身高且沒有明顯不良反應(yīng)。在患者中，有75%是感覺神經(jīng)性聽力損失[8]，其機(jī)制是由于ATP生成減少可能導(dǎo)致紋狀血管內(nèi)離子濃度失衡和細(xì)胞死亡，從而造成聲音傳導(dǎo)減少。最常見眼科特征是典型的黃斑部視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良[9]，大多數(shù)黃斑疾病患者都呈現(xiàn)糖尿病病史>5年且年齡>40歲，有人認(rèn)為該癥狀是由于多元醇途徑降低了葡萄糖代謝，異常的葡萄糖耐量增加了色素性視網(wǎng)膜病變的臨床表達(dá)?；颊叩耐砥谀I功能衰竭患病率很高，甚至可能是m.3243 A>G點(diǎn)突變的唯一表現(xiàn)[10]?；颊叩募〔⊥ǔ＠奂八闹思∪猓憩F(xiàn)為運(yùn)動(dòng)引起的肌肉痙攣或無(wú)力[11]。神經(jīng)系統(tǒng)損傷的患病率為10%～27%，而且大部分都是軸突感覺運(yùn)動(dòng)神經(jīng)病[12]。已報(bào)道的精神疾病，包括反復(fù)發(fā)作的嚴(yán)重抑郁癥、精神分裂癥和各種恐懼癥。胃腸道不適也非常常見，尤其是便秘和假性阻塞[13]，且已證明在這些患者的胃體黏膜中積累了更高水平的m.3243A>G點(diǎn)突變[14]。本研究可見該家系先證者目前主要臨床特征為糖耐量受損、身材矮小、視力受損、智力發(fā)育落后、乳酸酸中毒和腎臟損傷等，雖暫無(wú)聽力異常的表現(xiàn)，但需定期監(jiān)測(cè)聽力情況；先證者外婆、母親以及舅舅表現(xiàn)有糖尿病、聽力下降及視力受損等，可見該家系的主要表現(xiàn)符合該病的臨床特征。

3.2 MDM的診斷

隨著二代測(cè)序技術(shù)的成熟和普及，線粒體基因組測(cè)序和異質(zhì)性分析容易進(jìn)行。血液來(lái)源的DNA已被廣泛用作多種常見mtDNA突變(例如m.3243A>G點(diǎn)突變)的篩選和診斷工具。但血液中的白細(xì)胞異質(zhì)性低，特別是隨年齡增加異質(zhì)性更低，容易出現(xiàn)假陰性。與血液白細(xì)胞相比，尿中脫落細(xì)胞mtDNA的異質(zhì)分析準(zhǔn)確性更高。肌肉通常具有最高的異質(zhì)水平，但在臨床工作中較難取樣[15]?？谇火つぜ?xì)胞更易于進(jìn)行基因診斷，因?yàn)樗鼈円子诓蓸?，并且與血液相比通常具有高于30%～50%的異質(zhì)性值[16]。因此，選擇合適的檢測(cè)樣本對(duì)線粒體疾病的診斷至關(guān)重要，當(dāng)臨床考慮線粒體糖尿病時(shí)，可采用不同樣本進(jìn)行檢測(cè)以提高檢出率。該研究通過(guò)采集家系成員的血液樣本進(jìn)行基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)先證者及其外婆、母親、舅舅、阿姨均攜帶m.3243A>G點(diǎn)突變，雖然先證者妹妹基因檢測(cè)結(jié)果為陰性，但可能由于樣本的異質(zhì)性表現(xiàn)為假陰性，故后期可采集不同樣本進(jìn)行再分析。

3.3 MDM的治療

線粒體糖尿病的降血糖治療應(yīng)個(gè)體化，包括一般治療：盡量避免誘發(fā)因素，如感染、過(guò)度勞累等；飲食上可不必太嚴(yán)格限制；還可進(jìn)行抗性訓(xùn)練和耐力訓(xùn)練等。藥物治療：1)降糖藥物治療，應(yīng)避免使用二甲雙胍藥物治療[17]；磺脲類藥物及近年來(lái)上市的新型降糖藥物可用于控制線粒體糖尿病的血糖[18]。2)針對(duì)其他系統(tǒng)的藥物治療以及線粒體功能的藥物治療。此外，目前還有一些基因治療的方法，但仍待進(jìn)一步的研究。同時(shí)，線粒體糖尿病家系的遺傳咨詢也非常重要，這有助于無(wú)癥狀患者得到早期的診斷和并發(fā)癥的預(yù)防。本研究家系成員中有2人使用胰島素進(jìn)行治療，1人口服降糖藥物治療，先證者目前診斷為糖耐量受損，暫未使用藥物治療。

通過(guò)本研究，發(fā)現(xiàn)母系遺傳線粒體糖尿病家系1例。該家系成員的主要表現(xiàn)為身材矮小、聽力障礙、視力受損、智力落后合并乳酸酸中毒，符合該病的臨床特征。經(jīng)線粒體基因測(cè)序證實(shí)，該家系成員中有5人攜帶線粒體基因MT-TL1 3243A>G點(diǎn)突變，分別為先證者及其外婆、舅舅、小姨和母親；共4人發(fā)病，分別為先證者及其外婆、舅舅和母親，說(shuō)明即使攜帶突變基因，但不一定患病。雖然本研究Ⅲ2基因檢測(cè)結(jié)果為陰性，但鑒于不同樣本的異質(zhì)性不同，血液樣本檢測(cè)結(jié)果可能呈現(xiàn)假陰性。該家系成員的治療主要是口服降糖藥及胰島素注射進(jìn)行降糖治療，先證者目前診斷糖耐量受損，故暫未予藥物治療，但需要密切監(jiān)測(cè)。

綜上可見，通過(guò)詳細(xì)分析糖尿病患者的臨床特征、體格檢查、家族遺傳病史，并結(jié)合線粒體基因檢測(cè)，能夠?yàn)榫€粒體糖尿病的診斷及個(gè)體化治療提供依據(jù)，從而延緩并發(fā)癥的發(fā)生。