恒牙牙髓干細(xì)胞在周圍神經(jīng)疾病中的應(yīng)用研究進(jìn)展

段德慶，王 鵬，張紅艷

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院燒傷科，南昌 330006)

臨床上，周圍神經(jīng)損傷是一類很常見的疾病，可導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)的軸突變性、炎癥反應(yīng)、神經(jīng)元壞死和細(xì)胞結(jié)構(gòu)畸形[1]。周圍神經(jīng)損傷通常于創(chuàng)傷性、遺傳性、中毒性、代謝性和免疫性等疾病引起，具有很高的致殘性且經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)重，嚴(yán)重降低患者的生活質(zhì)量[2]。自體神經(jīng)移植作為目前的主要治療手段，存在移植后不完全恢復(fù)、供區(qū)損傷病變、神經(jīng)來源困難、生長(zhǎng)因子表達(dá)不足、二次手術(shù)和神經(jīng)瘤形成等局限[3]。因此，需要尋找新的有效治療方法。隨著干細(xì)胞治療技術(shù)的開發(fā)，間充質(zhì)干細(xì)胞在周圍神經(jīng)再生研究中表現(xiàn)出了很大的潛力。有研究[4]表明，在人體骨髓、臍帶、脂肪、胎盤、牙髓等部位中存在較多的間充質(zhì)干細(xì)胞，具有促進(jìn)血管修復(fù)和神經(jīng)再生的作用。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC)作為一種神經(jīng)再生促進(jìn)劑而被廣泛應(yīng)用于修復(fù)神經(jīng)缺損部位。但是，在臨床應(yīng)用上BMSC要求患者與捐贈(zèng)者骨髓配型要吻合，否則治療后易出現(xiàn)較大的排斥反應(yīng)[5]，這限制了它的應(yīng)用。而恒牙牙髓干細(xì)胞(DPSC)作為牙髓干細(xì)胞的一類，具有來源充足、取材方便、易于保存、無倫理問題等優(yōu)點(diǎn)[6]，而且高表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物和神經(jīng)營養(yǎng)因子，具有較好的神經(jīng)分化潛能，獲得了研究者們的關(guān)注。本綜述回顧了國內(nèi)外有關(guān)DPSC的研究成果，重點(diǎn)圍繞周圍神經(jīng)的再生機(jī)制、DPSC的生物學(xué)特性及在周圍神經(jīng)疾病治療中的應(yīng)用現(xiàn)狀與前景等方面進(jìn)行綜述，旨在為DPSC的臨床應(yīng)用研究提供參考。

1 周圍神經(jīng)的再生機(jī)制

在神經(jīng)再生過程中，軸突的再生生長(zhǎng)是關(guān)鍵。在軸突再生方面，施萬細(xì)胞(SC)起著關(guān)鍵作用，它存在于周圍神經(jīng)系統(tǒng)，使其比中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有更強(qiáng)的修復(fù)再生能力[7]。SC是一種特殊的膠質(zhì)細(xì)胞，在周圍神經(jīng)系統(tǒng)中形成髓鞘并保護(hù)軸突，它的發(fā)育可分為3個(gè)階段：首先形成SC前體細(xì)胞；其次是未成熟SC的形成；最后未成熟的SC成為有髓鞘或無髓鞘的SC[8]。需要不同的細(xì)胞因子來調(diào)節(jié)其發(fā)育過程，這也是研究神經(jīng)再生的一個(gè)新方向。有研究[9-10]表明，周圍神經(jīng)損傷后，完全成熟的干細(xì)胞會(huì)向不成熟干細(xì)胞階段的細(xì)胞表型進(jìn)行去分化，其中SC參與軸突和髓鞘碎片的吞噬，并激活修復(fù)信號(hào)，提供一定的支持環(huán)境促進(jìn)軸突再生；另一方面，SC可形成細(xì)胞管道，軸突會(huì)沿著管道再生并表達(dá)神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF)和黏附分子。另有研究[7]表明，間充質(zhì)干細(xì)胞在一定條件下能夠分化為一種與SC功能類似的細(xì)胞，進(jìn)而發(fā)揮促神經(jīng)再生功能，這為如何更加有效地促進(jìn)神經(jīng)再生提供了一種新的思路。

2 DPSC的生物學(xué)特性

牙髓干細(xì)胞最早發(fā)現(xiàn)于第三磨牙牙髓，隨后在幼兒脫落的乳牙，人類恒牙以及多生牙中分離發(fā)現(xiàn)[11]。因?yàn)檠浪柚泻胸S富的血管、神經(jīng)等組織，所以與其它來源的干細(xì)胞相比具有較好的分化潛能。據(jù)報(bào)道[12]稱，牙髓由神經(jīng)嵴來源的間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)育而來，因此從中分離出來的牙髓干細(xì)胞擁有很強(qiáng)的神經(jīng)分化潛能。另有文獻(xiàn)[13]表明，牙髓干細(xì)胞根據(jù)來源可分為恒牙牙髓干細(xì)胞和脫落乳牙牙髓干細(xì)胞，分別從成人恒牙牙髓和幼兒脫落乳牙牙髓中分離出來。雖然脫落乳牙牙髓干細(xì)胞有更強(qiáng)的增殖能力，間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD73、CD90高表達(dá)，也可表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)志物，如膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白、巢蛋白、神經(jīng)元特異性烯醇化酶[14]，但要應(yīng)用到神經(jīng)再生的臨床治療上，還需要做更多的臨床試驗(yàn)。

近年來有較多研究報(bào)道DPSC的特性[15-23]。有研究[15]表明，DPSC高表達(dá)CD29、CD90和CD49，但缺乏CD34和CD45的表達(dá)；DPSC也可表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物，如巢蛋白、βⅢ-微管蛋白、谷氨酸脫羧酶、膠質(zhì)纖維酸性蛋白等，具有神經(jīng)分化潛能；DPSC還表達(dá)神經(jīng)營養(yǎng)因子(neurotrophic factors,NTF)，如NGF，可以促進(jìn)干細(xì)胞歸巢，利于神經(jīng)再生[16]。其中，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)作為NTF的一種，與牙源性、神經(jīng)源性分化、腫瘤生長(zhǎng)和血管生成等多種生物學(xué)過程有關(guān)，bFGF還可以促進(jìn)神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖，在體內(nèi)能夠刺激SC增殖，從而促進(jìn)軸突的伸展再生[17]。另有報(bào)道[18]稱，胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated protein kinase，ERK)信號(hào)通路是絲裂原激活蛋白激酶中的經(jīng)典通路，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和腫瘤進(jìn)展等多種生物學(xué)過程的調(diào)控，具有重要的生理學(xué)意義，其中ERK是bFGF的下游分子，bFGF可將ERK磷酸化，進(jìn)而激活ERK信號(hào)通路，促進(jìn)DPSC的神經(jīng)源性分化。

此外，相比于其它來源的干細(xì)胞，DPSC可以分泌血小板衍生生長(zhǎng)因子和其它生長(zhǎng)因子；在酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)中，DPSC的NGF、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子效價(jià)高于人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞[19]，其中NGF、BDNF可以加快神經(jīng)元的分化和突觸的形成。另有研究[20]表明，IL-17對(duì)神經(jīng)分化和神經(jīng)干細(xì)胞的增殖產(chǎn)生抑制作用，而DPSC分泌組中的IL-17表達(dá)水平低于BMSC的分泌組，相同情況下對(duì)神經(jīng)再生的抑制作用更小。還有研究[21]表明，在Th1、Th2和Th17型細(xì)胞因子陣列中顯示，DPSC分泌高表達(dá)促進(jìn)神經(jīng)分化的細(xì)胞因子，如粒細(xì)胞集落刺激因子、β干擾素、α-天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶等，它們通過平行或交互的方式表達(dá)，在神經(jīng)元分化、突觸形成和其認(rèn)知功能的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。此外，βⅢ-微管蛋白是神經(jīng)分化過程中的神經(jīng)標(biāo)志物，可以在神經(jīng)嵴細(xì)胞中表達(dá)，并參與軸突生長(zhǎng)[22]。而且βⅢ-微管蛋白在神經(jīng)細(xì)胞的維持、存活和分化中起著重要作用。有報(bào)道[23]稱，在DPSC神經(jīng)分化后，βⅢ-微管蛋白的蛋白水平顯著增加。因此，DPSC成為了周圍神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療中的一個(gè)新的切入點(diǎn)。

3 DPSC在周圍神經(jīng)相關(guān)疾病中的應(yīng)用

3.1 糖尿病周圍神經(jīng)病變

糖尿病周圍神經(jīng)病變(diabetic peripheral neuropathy，DPN)是1型和2型糖尿病最常見和早期發(fā)展的并發(fā)癥，超過一半的長(zhǎng)期糖尿病患者最終會(huì)發(fā)展成神經(jīng)病變，嚴(yán)重可導(dǎo)致糖尿病足潰瘍，致殘性很高[24]。在致病機(jī)制上，一方面高血糖導(dǎo)致氧化應(yīng)激、活性氧生成和糖基化終末產(chǎn)物產(chǎn)生，從而損害周圍神經(jīng)中的神經(jīng)元、SC和血管內(nèi)皮細(xì)胞[25]；另一方面，糖尿病通過限制軸突的順行和逆行運(yùn)輸，減少周圍神經(jīng)中的BDNF、NGF和神經(jīng)營養(yǎng)素，從而影響神經(jīng)元的修復(fù)再生[26]。近年來，DPSC在DPN的應(yīng)用得到了眾多研究者的關(guān)注。有研究[27]表明，DPSC移植可明顯改善糖尿病大鼠移植側(cè)受損神經(jīng)血流量、神經(jīng)傳導(dǎo)速度、毛細(xì)血管密度和表皮內(nèi)神經(jīng)纖維密度，增加了血管生成因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子基因的表達(dá)，抑制神經(jīng)的炎癥反應(yīng)。另有研究者[28]證明，通過移植DPSC可以顯著減少糖尿病周圍神經(jīng)中巨噬細(xì)胞的數(shù)量；同時(shí)降低M1巨噬細(xì)胞的基因表達(dá)，增加M2巨噬細(xì)胞的基因表達(dá)，調(diào)節(jié)M1/M2巨噬細(xì)胞數(shù)量比例；DPSC也可以產(chǎn)生豐富的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，改善DPN。還有文獻(xiàn)[24]表明，DPSC可以降低腫瘤壞死因子α和IL-6的表達(dá)，上調(diào)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β的表達(dá)，對(duì)DPN存在的炎癥狀態(tài)有保護(hù)作用。這些發(fā)現(xiàn)為DPSC用于DPN的臨床治療提供了一定的參考依據(jù)。

3.2 神經(jīng)脫髓鞘性病變

有文獻(xiàn)[29]表明，在神經(jīng)脫髓鞘動(dòng)物模型中，可表達(dá)stro-1、c-Kit基因和CD34的DPSC能夠在體外分化為SC樣細(xì)胞，并在體內(nèi)促進(jìn)軸突再生。將DPSC移植到坐骨神經(jīng)缺損處，抗人核染色陽性，顯示典型的SC生物標(biāo)志物的表達(dá)，還可以檢測(cè)到大量的有髓軸突，移植1個(gè)月后DPSC可促進(jìn)近端到遠(yuǎn)端的軸突再生。在另一項(xiàng)研究[13]也觀察到，DPSC移植后的免疫調(diào)節(jié)作用以及分泌的細(xì)胞外基質(zhì)分子如BDNF，在刺激神經(jīng)軸突生長(zhǎng)中起著重要的作用。因此與神經(jīng)嵴分化相關(guān)的DPSC可能是治療脫髓鞘疾病的一種很有前途的干細(xì)胞來源，可促進(jìn)周圍神經(jīng)病變后的功能恢復(fù)。

3.3 脊神經(jīng)損傷

脊神經(jīng)損傷通常由創(chuàng)傷引起，致運(yùn)動(dòng)或感覺功能障礙，殘留肢體癱瘓等后遺癥。有研究[30]表明，M1巨噬細(xì)胞和M2巨噬細(xì)胞參與脊神經(jīng)損傷部位的炎癥擴(kuò)散，M1巨噬細(xì)胞通過吞噬碎片和釋放炎癥細(xì)胞因子來誘導(dǎo)炎癥，M2巨噬細(xì)胞則是減輕炎癥和分泌抗炎細(xì)胞因子促進(jìn)組織修復(fù)。在DPSC移植后，發(fā)現(xiàn)M2巨噬細(xì)胞比例明顯增加，從而促進(jìn)模型小鼠脊髓損傷后神經(jīng)的軸突生長(zhǎng)[28]，也可釋放多種NTF，如BDNF和膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子，從而使運(yùn)動(dòng)功能明顯改善[31]。還可以通過試驗(yàn)來優(yōu)化DPSC分泌NTF的功能，例如實(shí)驗(yàn)者通過改變細(xì)胞培養(yǎng)條件來啟動(dòng)預(yù)分化細(xì)胞。在脊髓損傷的體外背根神經(jīng)節(jié)損傷模型[29]中，研究發(fā)現(xiàn)相比于未分化的細(xì)胞，移植預(yù)分化為SC樣膠質(zhì)細(xì)胞的DPSC后，NTF的分泌水平顯著上升，并能夠更有效地刺激軸突生長(zhǎng)。

3.4 其他疾病

有研究[32]表明，電燒傷會(huì)對(duì)神經(jīng)組織造成極大的損傷，如皮膚燒傷瘢痕形成的遲發(fā)性壓迫性神經(jīng)病、周圍神經(jīng)損傷和電生理改變。據(jù)報(bào)道[33]，DPSC對(duì)于燒傷導(dǎo)致的周圍神經(jīng)損傷有很好的促進(jìn)再生作用，DPSC在神經(jīng)分化上具有一個(gè)很好的潛力，也可以釋放NTF促使軸突和神經(jīng)的修復(fù)再生。提示應(yīng)深入研究DPSC在電燒傷中的治療應(yīng)用。肌萎縮側(cè)索硬化癥(amyotropyic lateral sclerosis，ALS)主要是周圍神經(jīng)損傷導(dǎo)致的一種進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病，通常開始于肢體運(yùn)動(dòng)功能的減弱和肌肉震顫，隨后發(fā)展為發(fā)聲、進(jìn)食和飲水困難，患者最后常因呼吸肌無力導(dǎo)致窒息死亡[30]。目前DPSC在治療ALS上受到高度關(guān)注，但尚未開發(fā)出有效可行的治療方法。有研究[34]表明，DPSC可以抑制ALS小鼠模型中的神經(jīng)-肌肉接頭損傷和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元丟失。

4 小結(jié)和展望

目前，干細(xì)胞移植是再生醫(yī)學(xué)中應(yīng)用最廣泛的細(xì)胞治療方法。周圍神經(jīng)受損引起神經(jīng)細(xì)胞的軸突變性、炎癥反應(yīng)及壞死，傳統(tǒng)治療極難修復(fù)。DPSC相比于其它間充質(zhì)干細(xì)胞，具有強(qiáng)大的神經(jīng)再生潛能、促進(jìn)干細(xì)胞歸巢、促進(jìn)軸突生長(zhǎng)、儲(chǔ)供豐富等特性。因此DPSC在周圍神經(jīng)系統(tǒng)中應(yīng)用前景十分廣泛，如修復(fù)糖尿病周圍神經(jīng)病變、脫髓鞘性病變、脊神經(jīng)損傷、電燒傷及肌萎縮側(cè)索硬化癥等疾病引起的神經(jīng)損傷。在今后的研究，通過進(jìn)一步誘導(dǎo)DPSC分泌NTF的能力、加強(qiáng)SC增殖潛能、增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)能力以及深低溫保存并長(zhǎng)期儲(chǔ)存DPSC等措施，可以極大地增強(qiáng)DPSC在周圍神經(jīng)系統(tǒng)疾病的實(shí)用性。另有研究[35]發(fā)現(xiàn)，使用不同類型的生長(zhǎng)因子、生物材料和活性分子誘導(dǎo)分化DPSC，可影響分化結(jié)果，因此如何選擇生長(zhǎng)因子、生物材料和活性分子的最佳類型值得深入研究。此外，DPSC在應(yīng)用于臨床前，如何選擇合適的給藥途徑和監(jiān)測(cè)療效的參數(shù)以及考慮腫瘤形成的風(fēng)險(xiǎn)等問題都有待解決，因此需要學(xué)者們通過更多的有效臨床前和臨床研究去探討DPSC的特性及其治療機(jī)制。