NPY受體在急性束縛應激大鼠mPFC和下丘腦中的表達及其與炎性因子的相關性

李曉曉，于 倩，陳家豪，王文嬌，李 慧，徐志卿,1c

(1.首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院a.神經(jīng)生物學系、北京神經(jīng)修復與再生重點實驗室；b.人體解剖與組織胚胎學系；c.病理學系，北京100069；2.天津市第三中心醫(yī)院重癥醫(yī)學科，天津 300170)

應激是生物機體在經(jīng)歷強烈刺激時所出現(xiàn)的非特異性的全身性適應反應，可引起神經(jīng)內(nèi)分泌及代謝等的異常，且應激和情緒及學習記憶等生理機能密切相關[1]。束縛應激(RES)是一種非損傷性刺激，它與人類心身性疾病的過程十分相似，因此束縛應激模型是被大家公認的應激模型之一[2]。根據(jù)束縛時間的長短和次數(shù)，束縛應激可分為急性束縛應激和慢性束縛應激[3]。急性束縛應激會導致大腦皮質區(qū)域分泌的炎性因子增加，可以使大腦功能減退并導致神經(jīng)元的損害[4]。前額葉內(nèi)側皮層(mPFC)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)調(diào)節(jié)焦慮恐懼及應激反應的關鍵腦區(qū)之一，同時也是參與應激受損的重要腦區(qū)[5-6]。

神經(jīng)肽Y(NPY)是由36個氨基酸組成的多肽，在不同的物種中具有高度保守性，是一種廣泛分布在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)遞質。NPY共有6種受體，分別為Y1R、Y2R、Y3R、Y4R、Y5R和Y6R，均屬于G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)，NPY信號主要通過結合和激活NPY受體發(fā)揮作用[7]，NPY受體活化后與抑制性G蛋白Gi耦聯(lián)而抑制腺苷酸環(huán)化酶活性，進而調(diào)節(jié)鈣離子的釋放，其中Y1R和Y2R在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的表達最為廣泛[8]，是NPY產(chǎn)生抗壓力反應的主要調(diào)節(jié)者。Y4R和Y5R在最近的抑郁癥研究中逐漸受到關注，有研究[9]表明這2個受體主要與進食及胃腸蠕動有關，其中Y5R在調(diào)節(jié)焦慮狀態(tài)和應激反應時發(fā)揮功能，其余3個受體的研究報道較少。小膠質細胞(Microglia)是存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)量最多的巨噬細胞，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮免疫作用，是中樞免疫系統(tǒng)的第一道防線。小膠質細胞在神經(jīng)炎癥發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用[10]，它被激活后能分泌大量促炎細胞因子，如IL-1β、IL-6和TNF-α，這些炎癥因子的釋放又加劇小膠質細胞的激活，從而形成惡性循環(huán)[11]。NPY受體與其配體NPY結合后可以介導小膠質細胞與其他細胞相互作用[12]，還可以抑制小膠質細胞激活從而起到抗炎作用[13-14]。

筆者前期研究[15]結果顯示在慢性大鼠抑郁模型的mPFC腦區(qū)，NPY主要通過Y2R發(fā)揮抗抑郁作用。但在急性束縛應激大鼠模型中，NPY受體相關研究報道還很少。因此本研究通過急性束縛制備大鼠應激模型，觀察NPY及其受體以及炎性因子在急性束縛應激模型中的表達和分布，為進一步研究NPY及其受體在情緒認知疾病中的作用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

成年雄性SD大鼠，體重180～200 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。

1.1.2 實驗試劑及藥品

RNeasy Lipid Tissue Mini Kit購自QIAGEN公司，SuperScriptⅢ First-Strand和Power UpTMS YBRTMGreen Master Mix購自Thermo Fisher公司，NPY及Y5R等實時定量PCR引物由生物工程(上海)股份有限公司合成，Y5R及IL-1β抗體購自Abcam公司，內(nèi)參β-actin等抗體購自Proteintech公司，Iba-1抗體購自Novus公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組和造模

SD大鼠購置后飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學動物部，給予充足飼料及飲用水，飼養(yǎng)密度為3～4 只·籠-1，室溫控制在20～25 ℃，空氣濕度控制在40%～50%，給予12/12 h晝夜節(jié)律，正常飼養(yǎng)3 d，使其適應環(huán)境，將適應環(huán)境的動物隨機分為對照組(CTL組)和急性束縛應激組(RES組)。CTL組大鼠正常飼養(yǎng)，RES組進行急性束縛應激模型制備，方法如下：將大鼠放到束縛盒內(nèi)，依據(jù)大鼠體型大小調(diào)節(jié)擋板的前后位置，最佳束縛強度為大鼠在束縛盒內(nèi)不能轉頭，束縛時間2 h。造模結束后，將動物靜置30 min 后處死。本實驗中動物模型建立和處理方法符合首都醫(yī)科大學動物倫理學標準。

1.2.2 實時熒光定量PCR測定NPY及其受體mRNA的表達

大鼠麻醉后快速斷頭取腦，在RNase-free條件下分離出mPFC和下丘腦，快速液氮冷凍后置于-80 ℃中保存，用于后續(xù)RNA及蛋白的提取。依照RNeasy Lipid Tissue Mini Kit試劑盒說明書進行mPFC和下丘腦總RNA的提取，甲醛變性電泳檢測RNA的完整性、NanoDrop2000測定RNA的濃度和純度。取1 μg RNA，按照SuperScriptⅢFirst-Strand試劑盒說明書進行cDNA的合成。設計實時定量PCR引物，引物序列見表1。使用Thermo Fisher公司的SYBR熒光定量試劑盒進行基因水平的測定，反應條件如下：60 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min共40個循環(huán)，反應結束后10 ℃保存。每個樣品重復3次，記錄各樣品與內(nèi)參GAPDH的CT值，運用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

表1 熒光實時定量PCR引物序列

1.2.3 蛋白免疫印記實驗分析NPY受體Y5R及IL-1β蛋白表達

取冷凍大鼠mPFC和下丘腦提取蛋白，迅速加入適量變形裂解液，勻漿超聲后低溫離心取上清，BCA法測定蛋白濃度，樣品中加入上樣緩沖液，沸水中煮沸離心取上清，5%的積層膠(80 mV，30 min)和10%分離膠(120 mV，70 min)進行SDS-PAGE電泳，電泳后將蛋白轉移到PVDF膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后，分別加入一抗Y5R(Rabbit 1:10 000)、IL-1β(Rabbit 1:1000)、β-actin(Mouse 1:5000)、α-tubulin(Mouse 1:10 000)和GAPDH(Rabbit 1:1000)，室溫孵育4 h；洗膜后加入HRP標記的山羊抗小鼠或山羊抗兔二抗(1:5000)，室溫孵育1 h。洗膜后ECL化學發(fā)光，經(jīng)顯影和定影后得到顯示條帶的X光片。掃描成像后對條帶進行分析，采用Image J軟件測出條帶的灰度，計算出各指標與其對應的β-actin等內(nèi)參條帶的灰度比值。

1.2.4 免疫熒光染色檢測NPY受體Y5R及Iba-I的分布

6%水合氯醛(6 mL·kg-1)腹腔注射麻醉大鼠，4%多聚甲醛(PFA)灌注固定，灌注完成后4%PFA后固定4～6 h，轉入30%蔗糖溶液中，4 ℃保存至沉底。干冰速凍后修整得到含有擬切片部位的腦組織塊，參考大鼠腦立體定位圖譜于冰凍切片機上行矢狀面切片，厚度30 μm，將所得腦組織切片貼在玻片上進行免疫熒光化學染色。3% H2O2溶液室溫打孔10 min，PBS漂洗后加入封閉液，室溫封閉1 h；加入Y5R(Rabbit 1:250)及Iba-I(Goat 1:100)一抗過夜，漂洗后分別加入555標記的驢抗兔IgG(1:1000)和488標記的雞抗山羊IgG(1:1000)，室溫避光孵育1 h；加入熒光染料Hoechst33258復染細胞核，避光孵育20 min，漂洗后封片，熒光顯微鏡下觀察Y5R及Iba-I在mPFC的染色情況。

1.2.5 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 NPY及其受體mRNA在mPFC和下丘腦中的表達

在mPFC中，RES組Y5R mRNA表達水平較CTL組顯著降低(P<0.05)，而NPY及其他受體mRNA表達水平與CTL組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖1。在下丘腦中，RES組NPY及其受體mRNA表達與CTL組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖2。

CTL組(n=6)，RES組(n=8)；*P<0.05 CTL組與RES組比較。

CTL組(n=6)，RES組(n=8)。

2.2 炎性因子mRNA在mPFC和下丘腦中的表達

在mPFC中，RES組MHC-Ⅱ mRNA表達水平較CTL組顯著升高(P<0.05)，說明在急性束縛應激條件下，靜息狀態(tài)下的小膠質細胞被激活，見圖3。在下丘腦中，RES組各炎性因子mRNA表達與CTL組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖4。

CTL組(n=6)，RES組(n=8)；*P<0.05 CTL組與RES組比較。

CTL組(n=6)，RES組(n=8)。

2.3 NPY受體Y5R及炎性因子蛋白在mPFC與下丘腦中的表達

Western blot檢測結果顯示，在mPFC中，RES組NPY受體Y5R蛋白表達較CTL組明顯降低(P<0.05)，炎性因子IL-1β蛋白表達與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；在下丘腦中，RES組NPY受體Y5R蛋白和炎性因子IL-1β蛋白表達與對照組相比差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖5—6。

A：Western blot檢測結果；B：NPY受體Y5R蛋白表達；C：炎性因子IL-1β蛋白表達；CTL組(n=4)，RES組(n=4)；**P<0.01 CTL組與RES組比較。

A：Western blot檢測結果；B：NPY受體Y5R蛋白表達；C：炎性因子IL-1β蛋白表達；CTL組(n=4)，RES組(n=4)。

2.4 NPY受體Y5R及小膠質細胞標志物Iba-1的共定位

免疫熒光染色結果顯示，NPY受體Y5R在大鼠mPFC中廣泛分布，鏡下可見錐形或橢圓狀的神經(jīng)元，細胞核標記為藍色，Y5R蛋白標記為紅色，分布于神經(jīng)元胞膜；RES組NPY受體Y5R的表達低于對照組。對照組小膠質細胞突起細長呈分枝狀，處于未激活狀態(tài)；RES組小膠質細胞突起粗短分支減少，呈“阿米巴”樣的激活狀態(tài)，RES組小膠質細胞標志物Iba-1表達低于對照組。但對照組和RES組均不存在Y5R和Iba-1共定位的現(xiàn)象，見圖7。

圖7 免疫熒光染色結果

3 討論

急性應激是當代社會的一種常見應激。在急性束縛應激動物模型制備中只給與動物一次束縛應激且束縛時間較短，常為幾十分鐘到幾小時。應激可以導致糖皮質激素增加(人類為皮質醇，大鼠為皮質酮)，激素的增加又會引起一系列病理生理過程。機體受到應激刺激后能激活下丘腦-垂體軸，引起ACTH和CORT的增加，繼而導致后續(xù)炎癥、免疫及行為發(fā)生改變[16]。NPY是分布在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中的具有神經(jīng)保護作用的內(nèi)源性多肽，NPY可能通過其受體發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的作用，它與其相應受體結合后能夠影響下游多條信號通路[17-18]。

本研究結果顯示，NPY受體Y5R的mRNA水平在RES大鼠mPFC顯著性下降，而在下丘腦卻無變化，說明NPY受體Y5R呈現(xiàn)區(qū)域特異性降低；進一步的WB結果顯示NPY受體Y5R蛋白水平也顯著降低，而下丘腦NPY受體Y5R蛋白水平無變化，因此mPFC是RES大鼠模型的關鍵腦區(qū)。Y5R的表達在mPFC中顯著降低，表明其參與了急性束縛應激的病理過程。筆者前期研究[15]結果顯示，在LPS模型的mPFC腦區(qū)，NPY受體Y2R可通過抑制M1型小膠質細胞的NLRP3炎性信號通路發(fā)揮抗抑郁作用。但在急性束縛應激大鼠模型mPFC腦區(qū)炎性因子的變化，及降低的Y5R參與束縛應激的病理機制是否與小膠質細胞的神經(jīng)炎性相關尚未見報道。

mPFC是與壓力、認知、情緒障礙等密切相關的腦區(qū)，它可以將情緒信息轉化為應激行為，是神經(jīng)炎性反應的關鍵腦區(qū)[19]。小膠質細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮免疫作用的主要細胞，在外界刺激的作用下，靜息態(tài)小膠質細胞分化為M1-型小膠質細胞，CD11b、Iba-1和MHC-Ⅱ是M1-型小膠質細胞的表面標志物，小膠質細胞通過分泌IL-1β、IL-6和TNF-α等炎性因子起到致炎性的作用[20]。本研究結果顯示，在mPFC中，小膠質細胞的表面標志物MHC-Ⅱ的mRNA水平升高，表明小膠質細胞被激活；下丘腦的小膠質細胞的表面標志物卻無變化。mPFC炎性因子蛋白水平的變化與mRNA水平的變化不一致，推測可能是因為真核基因表達在轉錄和翻譯即mRNA和蛋白兩個水平層面存在時間和位點的時空間隔；轉錄后加工、轉錄產(chǎn)物的降解及翻譯后加工修飾等層面使得轉錄和翻譯并不完全一致；再者由于檢測時間點的不同，因為急性束縛應激模型造模時間比較短，當炎性因子的mRNA水平達到峰值的時候，蛋白水平還在增加中，所以出現(xiàn)炎性因子mRNA和蛋白水平表達不同步的現(xiàn)象。

小膠質細胞表面表達有多種神經(jīng)肽及神經(jīng)遞質受體，這為研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)神經(jīng)肽及受體家族對神經(jīng)炎性的調(diào)控作用提供依據(jù)。在急性束縛應激大鼠模型中，Y5R和小膠質細胞之間是否存在一定關聯(lián)，本研究通過免疫熒光染色來進一步鑒定，結果證實Y5R和小膠質細胞的表面標志物Iba-1不存在共定位的情況，說明在急性束縛應激大鼠模型中，Y5R不是通過小膠質細胞發(fā)揮神經(jīng)炎性的調(diào)控作用。有研究[21]報道，在培養(yǎng)的基底外側杏仁核神經(jīng)元腦片，NPY的反復刺激導致興奮性的輸出持續(xù)衰減，誘導樹突發(fā)育不良，這是通過NPY激活Y5R實現(xiàn)。這提示在急性束縛應激大鼠模型中，Y5R的作用機制可能與突觸可塑性等有關。

綜上所述，本研究結果表明急性束縛應激大鼠mPFC腦區(qū)NPY受體Y5R的表達下降，急性應激導致炎性因子mRNA水平出現(xiàn)變化，但蛋白水平的變化沒有顯著差異。本研究首次證實Y5R和小膠質細胞的表面標志物Iba-1不存在共定位，推測Y5R的作用機制可能與突觸可塑性相關，但具體機制還需進一步研究。