體外電轉(zhuǎn)染TGF-β1質(zhì)粒對背根神經(jīng)節(jié)軸突生長的影響①

胡譯文，張 衡，王銳英，沈 翀，劉瑞端，張 衡，王銳英，沈 翀，劉瑞端

(桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院骨科，廣西 桂林 541001)

周圍神經(jīng)損傷是生活和工作中的常見事件，周圍神經(jīng)在受到機(jī)械外力及各種理化因素?fù)p傷后，其神經(jīng)元胞體、軸突、髓鞘等均會發(fā)生一系列的變性反應(yīng)。病理表現(xiàn)為胞體腫大，尼氏體溶解或消失。修復(fù)周圍神經(jīng)損傷的關(guān)鍵是神經(jīng)元胞體的存活及軸突的延伸[1]。近年來運(yùn)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)治療周圍神經(jīng)損傷已成為研究熱點(diǎn)[2]。轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor beta1，TGF-β1)是一種相對分子質(zhì)量為 25 000 的活性多肽，屬于轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β(transforming growth factor beta)多肽家族，具有拮抗腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-alpha，TNF-a)的效應(yīng)，抑制細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化，拮抗興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性作用。周圍神經(jīng)擠壓損傷，TGF-β1含量上升[3-4]。質(zhì)粒是小型環(huán)狀DNA分子，是基因工程最常用、最簡單的載體。筆者應(yīng)用電轉(zhuǎn)染方法將構(gòu)建的TGF-β1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中[5]，培養(yǎng)背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，然后，觀察TGF-β1對背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突生長的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

8～10周齡C57BL/6健康雄性小白鼠6只，體重25～35 g，來源于桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。小鼠的飼養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)均在桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心完成，環(huán)境溫度控制在20～23 ℃，濕度控制在40%～50%，室內(nèi)光照時間為10∶00 am至22∶00 pm，黑暗時間為22∶00 pm至10∶00 am。動物飼料及飲用水均按照嚴(yán)格規(guī)范進(jìn)行處理，小鼠飲用水pH值為3.0～3.5，按需、定期更換籠具及飲水瓶。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

倒置熒光顯微鏡(德國Carl Zeiss)；NucleofectorRII 細(xì)胞核轉(zhuǎn)染儀，Amaxa電轉(zhuǎn)液(德國Lonza)；TGF-β1質(zhì)粒(美國Clontech)；pBR322質(zhì)粒(美國Thermo Scientific)；胰酶，Ⅱ型膠原酶(Gibco公司)；MEM培養(yǎng)基，胎牛血清，兔抗小鼠TGF-β1單克隆抗體，β-actin單克隆抗體，紅色熒光二抗免疫組織化學(xué)試劑(美國cell singling)；兔抗小鼠Tuj1單克隆抗體(美國Covance)。

1.3 背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與分析

分離小鼠DRG 內(nèi)的背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)；培養(yǎng)成功后，進(jìn)行背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞電轉(zhuǎn)染，設(shè)對照組和TGF-β1組。具體方法如下：C57BL/6小白鼠脫頸處死后，嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，用小組織剪沿小鼠背部皮膚正中線依次剪開皮膚，剝離皮下組織和脊椎旁肌肉，取出小鼠脊柱兩側(cè)背根神經(jīng)節(jié)置于MEM無血清培養(yǎng)基中；吸除培養(yǎng)基，于37 ℃ 1 mlⅡ膠原酶中消化90 min，700 r離心 8 min后移除Ⅱ膠原酶，加入500 μl胰酶，37 ℃下消化15～20 min；700 r離心8 min，洗滌3次后，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。對照組中加入100 μl Amaxa電轉(zhuǎn)液(含濃度為4 μg/ml的 pBR322空白質(zhì)粒10 μl與90 μl Amaxa電轉(zhuǎn)液)重懸細(xì)胞團(tuán)； TGF-β1組加入100 μl電轉(zhuǎn)混合液(濃度為4 μg/ml的TGF-β1質(zhì)粒10 μl與90 μl Amaxa電轉(zhuǎn)液)重懸細(xì)胞團(tuán)；細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至電轉(zhuǎn)杯，置入NucleofectorRII 細(xì)胞核轉(zhuǎn)染儀，選擇G13程序進(jìn)行質(zhì)粒電轉(zhuǎn)染[6]；電轉(zhuǎn)染后，加入含10%胎牛血清(FBS)的MEN培養(yǎng)基，將細(xì)胞濃度調(diào)整至1×105個/ml，加入至有無菌蓋玻片(多聚賴氨酸及層粘連蛋白浸泡過)的24孔培養(yǎng)板中，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 d后用無菌PBS洗滌細(xì)胞，然后，進(jìn)行Tuj1免疫組化染色：每孔加入200 μl 4%多聚甲醛PFA固定細(xì)胞，PBS液洗3次， 5 min/次；0.5% TritonX-100 孵育20 min，PBS洗3次， 2 min/次；3% H2O2室溫孵育5～10 min，每孔加入500 μl封閉液(1%胎牛血清，0.1% Triton X-100，2%山羊血清混合配制而成)于室溫下封閉60 min；吸除封閉液，PBS洗3次， 5 min/次；每孔的蓋玻片上滴加30 μl兔抗小鼠Tuj1單克隆抗體(1∶1 200)孵育1 h；PBS沖洗3次，滴加30 μl紅色熒光二抗孵育1 h，PBS洗3次后，取出蓋玻片，用MOUNT液封閉；置于倒置熒光顯微鏡下觀察神經(jīng)細(xì)胞軸突生長情況并拍照。每組取100個DRG細(xì)胞，采用Axio-Vision4.6 software軟件分析神經(jīng)細(xì)胞軸突長度。

1.4 Western-blot檢測TGF-β1

細(xì)胞培養(yǎng)3 d后，收集對照組和TGF-β1質(zhì)粒電轉(zhuǎn)染組的背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，加入RIPA buffer 100 μl細(xì)胞裂解液，細(xì)胞裂解后以13 500 r離心10 min，提取總蛋白，100 ℃變性10 min；取20 μl總蛋白樣品置10% SDS-PAGE膠中電泳分離，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜；5% 脫脂奶粉常規(guī)封閉 1 h，加入兔抗小鼠TGF-β1單克隆抗體(1∶1 000)，4 ℃過夜，室溫下加入二抗(羊抗兔IgG，1∶10 000)孵育1 h，ECL 顯色。β-actin單克隆抗體(1∶25 000 稀釋液)為內(nèi)參照。應(yīng)用Image-J圖像分析軟件分析數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞形態(tài)

背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)4 h后開始貼壁，1 d后在顯微鏡下觀察可見胞體周圍開始有軸突長出，3 d后形態(tài)更為典型，細(xì)胞胞體呈圓形，胞體發(fā)出兩條線狀軸突，軸突上有少量分叉。

2.2 背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突長度

背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)3 d后，免疫熒光染色，Axio-Vision4.6 software軟件分析背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突長度，TGF-β1組為(5.231±1.03)mm， 對照組為(3.342±0.72)mm，TGF-β1組背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突明顯長于對照組， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 顯微鏡下觀察Tuj1染色后的背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(100×)

2.2 TGF-β1蛋白表達(dá)

TGF-β1組TGF-β1蛋白條帶灰度掃描值(1.09±0.01)大于對照組(0.46±0.02)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，TGF-β1組TGF-β1蛋白表達(dá)量高于對照組，見圖2。

圖2 Western-blot檢測 TGF-β1蛋白表達(dá)

3 討論

周圍神經(jīng)損傷呈逐年升高趨勢，它可引起嚴(yán)重神經(jīng)功能障礙[7]。周圍神經(jīng)損傷會造成一段或整段神經(jīng)纖維的變性或壞死，同時不可避免地?fù)p傷相應(yīng)的神經(jīng)元細(xì)胞，引起胞體病理性變化[8]。由于周圍神經(jīng)纖維的可再生性，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)增強(qiáng)神經(jīng)纖維再生能力，抑制神經(jīng)元細(xì)胞胞體腫大及尼氏體溶解，促進(jìn)軸突再生，修復(fù)周圍神經(jīng)損傷[9]。神經(jīng)軸突的再生需要神經(jīng)元胞體的基因調(diào)節(jié)和位于軸突生長錐處的軸突組織合成，因此，近年來運(yùn)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)治療周圍神經(jīng)損傷已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)。

TGF-β是有多種功能的蛋白多肽大家族，目前已發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長因子β1-5種分子。轉(zhuǎn)化生長因子β廣泛存在于動物的正常組織和轉(zhuǎn)化細(xì)胞中，以骨組織和血小板中含量最高，在骨組織中又以TGF-βl含量最高。TGF-βl由兩條肽鏈組成，每條肽鏈上有112個氨基酸，相對分子質(zhì)量為25 000，TGF-βl有耐酸、堿，熱和耐變性等特性[10]。神經(jīng)系統(tǒng)的TGF-β1則存在于腦脊膜、脈絡(luò)膜叢及外周神經(jīng)與神經(jīng)節(jié)中，有研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1可降低細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，抗細(xì)胞凋亡，拮抗興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性，且具有維持神經(jīng)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，保護(hù)運(yùn)動和感覺神經(jīng)元免受損傷[11]。Caruso等[12]研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1表達(dá)缺失導(dǎo)致患者腦部組織炎性損傷加重。Jiang等[13]用 TGF-β1孵育神經(jīng)細(xì)胞24 h，一氧化氮導(dǎo)致的神經(jīng)毒性明顯降低。近年來，電轉(zhuǎn)染DRG細(xì)胞方法已廣泛應(yīng)用于周圍神經(jīng)軸突再生[14]，體外電轉(zhuǎn)染有明顯的優(yōu)勢：轉(zhuǎn)染所需時間短，瞬時基因轉(zhuǎn)染有更高的轉(zhuǎn)染效率，更適用于對DRG神經(jīng)元及軸突生長的生物學(xué)分析。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用成熟的體外電轉(zhuǎn)染方法將重組TGF-β1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TGF-β1具有促進(jìn)背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突生長，修復(fù)周圍神經(jīng)的損傷，但TGF-β1促軸突生長的分子機(jī)制還不清楚，還待進(jìn)一步研究與探索[15]。