苦參素對晚期糖基化產(chǎn)物誘導的人血管平滑肌細胞表型轉化的抑制作用及其機制

岳向明,王軍奎,王巧娥,劉仲偉,邢玉潔,晁 娜*

(1陜西中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學系內(nèi)科教研室,西安 712046;2陜西省人民醫(yī)院心血管內(nèi)科;3延安大學醫(yī)學院內(nèi)科學系;*通訊作者,E-mail:tyyqga@sina.com)

糖尿病(diabetes mellitus, DM)大血管并發(fā)癥的特征性病理改變是動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS),同時DM作為一個獨立危險因素,能夠加速AS發(fā)生發(fā)展的進程,但分子機制尚不明確。晚期糖基化產(chǎn)物(advanced glycation end products, AGEs)具有典型的代表性,是DM患者體內(nèi)特征性的病理性代謝產(chǎn)物,其水平與主要心血管事件(MACE)的發(fā)生密切相關[1]。

血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)表型轉化在AS發(fā)生發(fā)展的各個階段均扮演重要的角色,合成型的VSMCs分泌細胞外基質(extra cellular matrix, ECM)以及各種炎性細胞因子,參與AS斑塊的形成及進展[2]。課題組前期研究表明VSMCs內(nèi)Notch信號通路激活是AGEs誘導VSMCs發(fā)生表型轉化的重要分子機制[3]。內(nèi)質網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress,ERS)下游的重要通路蛋白激酶RNA樣內(nèi)質網(wǎng)激酶(protein kinase RNA-like ER kinase, PERK)信號通路與諸如凋亡、自噬以及纖維化等多種病理生理學反應有關[4]。一項研究結果顯示,PERK信號通路的激活導致細胞表面Dll4的表達增多[5]。此外,多項體內(nèi)及體外研究也證實了AGEs可誘發(fā)ERS的激活[6,7]。因此,我們推測PERK信號通路是ERS與Notch信號通路之間交互作用的橋梁。

研究表明,苦參素(matrine)可有效阻遏AS的發(fā)生發(fā)展,但具體的分子機制上不完全清楚。根據(jù)課題組的前期研究結果,苦參素對糖尿病狀態(tài)下細胞內(nèi)ERS PERK信號通路具有顯著的抑制作用[8]。據(jù)此,我們推測苦參素可能通過抑制AGEs誘導的VSMCs PERK信號通路激活降低細胞表面Dll4的表達水平,從而抑制VSMCs收縮型-合成型細胞表型轉化,進而遏制AS。因此,本研究通過對苦參素抑制糖尿病相關AS相關分子機制進行探討,旨在為苦參素在本病的臨床治療應用中提供重要的理論基礎。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

牛血清白蛋白(BSA)購自美國Hyclone公司;甘油醛購自美國Sigma-Aldrich公司;PD-10脫鹽柱購自美國GE Healthcare公司;SignalSilence PERK siRNA試劑盒以及SignalSilence Scramble siRNA試劑盒均購自美國CST公司,Mirus TransIT-TKO試劑盒購自美國Mirus公司;滑肌肌球蛋白重鏈11(smooth muscle myosin heavy chain 11, MYH11)抗體、骨橋蛋白(osteopontin, OPN)抗體、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein 78, GRP78)抗體、磷酸化PERK(p-PERK)抗體、PERK抗體以及GAPDH抗體均購自美國Abcam公司;δ樣蛋白-4(delta-like 4, Dll4)、Notch受體胞內(nèi)結合域1(Notch intracellular domain 1, NICD1)以及Split多毛增強子1(enhancer of split protein 1, HES1)以及發(fā)狀分裂相關增強子2(YRPW motif protein 2, HEY2)抗體均購自美國CST公司;Alexa-488熒光二抗購自美國Invitrogen公司;苦參素購自美國Sigma-Alderich公司。

1.2 AGEs制備

AGEs的制備方法及步驟參考本課題組及既往文獻[3]中的描述進行。在無菌條件下,將BSA與0.1 mmol/L甘油醛在0.2 mmol/L的磷酸鈉緩沖液(pH=7.4)中充分混合,37 ℃孵育7 d。使用PD-10脫鹽柱層析法去除未形成基團的糖類。將未與甘油醛混合的BSA作為對照。

1.3 細胞培養(yǎng)、處理與分組

復蘇本實驗室留存的人血管平滑肌細胞(HVSMCs,ATCC來源)并接種于含10%胎牛血清(BSA)及抗生素的DMEM培養(yǎng)基中,在5%CO2、95%新鮮空氣、飽和濕度及37 ℃條件下進行培養(yǎng),當細胞融合程度>80%時進行后續(xù)實驗。根據(jù)對細胞的處理方式不同,分為對照組(control)、低劑量AGEs組(L-AGEs)、高劑量AGEs組(H-AGEs)、低劑量苦參素組(AGEs+L-Mat)、中劑量苦參素組(AGEs+M-Mat)以及高劑量苦參素組(AGEs+H-Mat)。其中control組為空白對照;L-AGEs組以濃度為5 μmol/L的AGEs孵育細胞24 h;H-AGEs組以濃度為10 μmol/L的AGEs孵育細胞24 h;AGEs+L-Mat組以濃度為0.25 mmol/L的苦參素溶液預處理48 h后再以終濃度為10 μmol/L的AGEs孵育細胞24 h;AGEs+M-Mat組以濃度為0.5 mmol/L的苦參素溶液預處理48 h后再以終濃度為10 μmol/L的AGEs孵育細胞24 h;AGEs+H-Mat組以濃度為1.0 mmol/L的苦參素溶液預處理48 h后再以終濃度為10 μmol/L的AGEs孵育細胞24 h。下文中各檢測均在此分組基礎上進行。

1.4 免疫熒光染色檢測HVSMCs收縮型表型標志物表達水平

將HVSMCs制成細胞爬片并用磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次。4%多聚甲醛固定20 min,0.2% Triton X-100孵育10 min。PBS漂洗3次后,封閉緩沖液封閉30 min。分別與HVSMCs收縮型表型表面標記物MYH11抗體(1 ∶500)在4 ℃孵育10 h,PBS漂洗后,Alexa-488熒光二抗37 ℃孵育2 h。在倒置熒光顯微鏡下進行觀察并使用image J軟件(版本號1.38)進行分析。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測細胞培養(yǎng)液炎癥因子濃度

無菌管收集各組細胞培養(yǎng)上清液,4 ℃以2 000 r/min離心15 min后棄去沉淀,收集上清液分裝備用。以IL-1β及TNF-α ELISA試劑盒對上述標本中IL-1β及TNF-α濃度進行檢測,檢測流程參照試劑盒說明書進行。

1.6 蛋白免疫印跡檢測蛋白表達及PERK磷酸化水平

以RIPA裂解液處理收集的HVSMCs細胞,低溫離心后,使用總蛋白抽提試劑盒提取總蛋白。BCA法測定蛋白濃度,SDS-PAGE電泳分離蛋白后電轉印至PVDF膜。封閉緩沖液孵育后,分別使用GRP78抗體(1 ∶500),磷酸化PERK(p-PERK,1 ∶1 000),PERK(1 ∶1 000),Dll4(1 ∶500),NICD1(1 ∶500),HES1(1 ∶500),HEY2(1 ∶500)以及GAPDH抗體(1 ∶1 000)在4 ℃下孵育10 h。TBST洗滌后,與相應二抗室溫下孵育30 min,ECL顯色法顯色并捕捉圖像,Image J Pro軟件對條帶灰度進行分析。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 苦參素顯著抑制AGEs誘導的HVSMCs收縮型-合成型細胞表型轉化

與control組相比,L-AGEs組及H-AGEs組HVSMCs收縮型表型標記物MYH11表達水平均顯著降低(P<0.05),H-AGEs組MYH11表達水平較L-AGEs組顯著降低(P<0.05)。與H-AGEs組相比,AGEs+L-Mat組、AGEs+M-Mat組及AGEs+H-Mat組HVSMCs細胞標記物MYH11表達水平顯著升高(均P<0.05),且呈苦參素濃度依賴性(均P<0.05,見圖1)。

2.2 苦參素顯著抑制AGEs誘導的HVSMCs細胞炎性細胞因子分泌

本研究以ELISA法對HVSMCs細胞培養(yǎng)液中促炎因子IL-1β及TNF-α水平進行檢測,結果見圖2。與control組相比,L-AGEs組及H-AGEs組HVSMCs細胞培養(yǎng)上清液中IL-1β及TNF-α水平均顯著升高(P<0.05),且H-AGEs組較L-AGEs組顯著升高(P<0.05)。與H-AGEs組相比,AGEs+L-Mat組、AGEs+M-Mat組及AGEs+H-Mat組HVSMCs細胞培養(yǎng)上清液中L-1β及TNF-α水平顯著降低,且呈苦參素濃度依賴性(均P<0.05)。

與control組相比,aP<0.05;與L-AGEs組相比,bP<0.05;與H-AGEs組相比,cP<0.05;與AGEs+L-Mat組相比,dP<0.05;與AGEs+M-Mat組相比,eP<0.05圖1 免疫熒光檢測HVSMCs收縮型表型標記物MYH11表達水平 (×400)Figure 1 Expression of HVSMCs contractile phenotype marker MYH11 by immunofluorescent staining (×400)

與control組相比,aP<0.05;與L-AGEs組相比,bP<0.05;與H-AGEs組相比,cP<0.05;與AGEs+L-Mat組相比,dP<0.05;與AGEs+M-Mat組相比,eP<0.05圖2 ELISA法檢測HVSMCs細胞培養(yǎng)上清液IL-1β及TNF-α濃度Figure 2 Concentrations of IL-1β and TNF-α in medium supernatant of HVSMCs by ELISA

2.3 苦參素顯著抑制AGEs誘導的HVSMCs細胞ERS PERK/Dll4信號通路激活

Werstern blotting結果顯示,與control組相比,L-AGEs組及H-AGEs組HVSMCs內(nèi)GRP78、Dll4表達水平以及PERK磷酸化水平均顯著升高,且H-AGEs組較L-AGEs組顯著升高(均P<0.05)。與H-AGEs組相比,AGEs+L-Mat組、AGEs+M-Mat組及AGEs+H-Mat組HVSMCs內(nèi)GRP78、Dll4表達水平以及PERK磷酸化水平均顯著降低,且呈現(xiàn)苦參素濃度依賴性(均P<0.05,見圖3)。

2.4 PERK敲減可顯著抑制AGEs誘導的HVSMCs內(nèi)Dll4/Notch信號通路激活

Western blotting結果顯示,與control組相比,L-AGEs及H-AGEs組HVSMCs內(nèi)NICD1、HEY2以及HES1表達水平均顯著升高,且H-AGEs組較L-AGEs組顯著升高(均P<0.05)。與H-AGEs組相比,AGEs+L-Mat組、AGEs+M-Mat組及AGEs+H-Mat組HVSMCs內(nèi)NICD1、HEY2以及HES1表達水平顯著降低,且呈苦參素濃度依賴性(均P<0.05,見圖4)。

與control組相比,aP<0.05;與L-AGEs組相比,bP<0.05;與H-AGEs組相比,cP<0.05;與AGEs+L-Mat組相比,dP<0.05;與AGEs+M-Mat組相比,eP<0.05圖3 Western blotting法檢測HVSMCs GRP78、Dll4表達水平及PERK磷酸化水平Figure 3 Relative expression levels of GRP78, Dll4 and relative phosphorylation level of PERK in HVSMCs by Western blotting

與control組相比,aP<0.05;與L-AGEs組相比,bP<0.05;與H-AGEs組相比,cP<0.05;與AGEs+L-Mat組相比,dP<0.05;與AGEs+M-Mat組相比,eP<0.05圖4 Western blotting法檢測HVSMCs內(nèi)NICD1、HES1以及HEY2表達水平Figure 4 Relative expression levels of NICD1, HES1 and HEY2 in HVSMCs by Western blotting

3 討論

AGEs是DM患者體內(nèi)異常代謝產(chǎn)物的代表之一,在持續(xù)的控制不佳的高血糖狀態(tài)下,蛋白質、核酸以及脂質發(fā)生Maillard反應,形成Schiff堿,后者經(jīng)過Amadori反應生成一系列結構多樣的具有高度生物學活性的產(chǎn)物[9]。既往研究表明,AGEs與DM患者主要心血管事件(MACE)的發(fā)生密切相關[1]。在本課題組的前期系列研究中,相繼發(fā)現(xiàn)AGEs可作用于心肌細胞以及動脈內(nèi)皮細胞,通過誘導細胞凋亡以及局部炎癥等參與DM相關心血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展[10-13]。

VSMCs是動脈血管壁的重要細胞成分,在不同病理生理條件下可表現(xiàn)出不同的細胞表型,即VSMCs的表型轉化。在一些病理因素的刺激下,VSMCs出現(xiàn)收縮型表型向合成型表型的轉化,表現(xiàn)為VSMCs內(nèi)肌絲纖維減少以及炎性因子及細胞外基質蛋白合成分泌異?；钴S[14]。喪失了收縮型表型特征的VSMCs可向合成型表型轉化。合成型VSMCs具有產(chǎn)生和分泌細胞外基質以及炎癥性細胞因子的特點,進而對AS斑塊的形成、進展以及易損性表現(xiàn)出促進作用[14]。本研究結果表明,AGEs可使VSMCs細胞表面收縮型表面標記物MYH11表達水平下降,同時VSMCs分泌的炎性因子水平顯著升高,表明AGEs可使VSMCs喪失收縮型表型特征,向合成型表型轉化。

在有害病理因子的作用下,ER功能受損便可誘發(fā)ERS,并通過其下游的PERK等信號通路產(chǎn)生各種生物學效應[15]。本研究結果顯示,AGEs處理可使VSMCs細胞內(nèi)GRP78表達水平及PERK磷酸化水平顯著升高。GRP78是ERS激活的分子標志物,PERK信號通路則通過其自身磷酸化激活。本研究結果表明,AGEs可使VSMCs內(nèi)PERK磷酸化水平顯著升高,說明AGEs可誘導VSMCs內(nèi)ERS PERK信號通路激活。除了依賴帽結構的翻譯,還有一種依賴5′非翻譯區(qū)(5′-UTR)的內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)機制可在ERS狀態(tài)下起到指導蛋白翻譯的作用。一項研究表明,處于ERS狀態(tài)的細胞可通過PERK信號通路的活化,經(jīng)由5′-UTR IRES機制促進Dll4的表達[5]。作為配體,Dll4可通過與細胞表面的Notch受體結合而激活Notch信號通路。

目前認為,Notch通路是VSMCs發(fā)生收縮型-合成型表型轉化的關鍵信號通路。Notch信號通激活后,furin對Notch進行切割,后者發(fā)生裂解,Notch胞內(nèi)段(Notch intracellular domain, NICD)被釋放進入胞漿,發(fā)生核轉位后與轉錄因子CBF-1/RBP-Jκ及Mastermind結合形成三元絡合物,激活下游的Hey以及Hes等靶基因的轉錄[16]。HEY2可以通過抑制多個轉錄調(diào)控元件(transcriptional regulatory elements)活性而降低例如MYH11等收縮蛋白的表達[17]。HES則被證明可促進膠原蛋白等靶基因啟動子的活性,參與細胞外基質的分泌[18]。本研究發(fā)現(xiàn),AGEs可誘發(fā)VSMCs內(nèi)Notch信號通路的激活,通過NICD1、HEY2以及HES1等效應分子參與VSMCs收縮型-合成型表型轉化。

近年來藥理學研究顯示苦參素具有多種藥理學活性,本課題組前期研究結果也證實了苦參素具有心血管保護作用。前期研究結果還表明,苦參素對氧化應激依賴的內(nèi)質網(wǎng)應激有顯著的抑制作用[8]。本研究以不同劑量苦參素對AGEs暴露的VSMCs進行預處理,發(fā)現(xiàn)苦參素預處理能夠顯著抑制VSMCs內(nèi)質網(wǎng)應激,降低下游PERK信號通路的活性,從而抑制VSMCs Dll4的表達水平,進而抑制細胞內(nèi)Notch信號通路的激活,最終抑制VSMCs由收縮型向合成型的表型轉化。綜上所述,苦參素可抑制AGEs激活的內(nèi)質網(wǎng)應激PERK/Dll4/Notch信號通路誘導的VSMCs收縮型-合成型細胞表型轉化。該機制可能是苦參素抑制動脈粥樣硬化的重要分子機制之一。