不同亞型急性腦卒中患者外周血中T淋巴細(xì)胞亞群的分布

張海岳,關(guān)經(jīng)緯,孔 琦,褚 敏,宋海慶,孟 然

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,北京 100053;*通訊作者,E-mail:victor65@126.com)

腦卒中根據(jù)發(fā)病機(jī)制不同可分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中[1,2],其中約87%的腦卒中患者為缺血性腦卒中[3]。缺血性腦卒中發(fā)生后可迅速啟動(dòng)一系列免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng),是卒中后誘發(fā)腦組織損傷和修復(fù)的重要病理反應(yīng)[4,5]。我們前期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),調(diào)節(jié)外周血中免疫細(xì)胞(主要包括T淋巴細(xì)胞亞群)的數(shù)量和功能,可有效改善腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ偷淖渲薪Y(jié)局,達(dá)到腦保護(hù)的作用[6]。這些結(jié)果表明T淋巴細(xì)胞亞群在腦卒中發(fā)病和治療中發(fā)揮重要作用。

既往大量研究也發(fā)現(xiàn)T淋巴細(xì)胞及其亞群在缺血性腦卒中發(fā)病早期就被募集和激活,特別是CD4+輔助性T細(xì)胞和CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞大量浸潤(rùn)腦缺血區(qū)域,分別通過(guò)誘導(dǎo)白介素、細(xì)胞毒素和穿孔素等炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生,造成神經(jīng)元細(xì)胞的壞死和損傷[7,8]。但是,目前有研究提出由于不同病因引起的腦缺血的部位、面積和程度不同,發(fā)生的免疫應(yīng)答反應(yīng)也有所差別[9]。其中T淋巴細(xì)胞亞群在不同類型缺血性腦卒中急性期的作用是否有差異還沒(méi)有統(tǒng)一定論。本研究旨在分析T淋巴細(xì)胞亞群在大動(dòng)脈粥樣硬化性卒中患者和小動(dòng)脈閉塞性卒中患者在急性期外周血中分布,探討不同病因缺血性腦卒中患者急性期免疫反應(yīng)的差異。

1 材料和方法

1.1 患者臨床資料

連續(xù)納入2019年4月至2020年6月就診于首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院的急性缺血性腦卒中患者共40例。研究前經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院倫理委員會(huì)的審查和批準(zhǔn)(倫理號(hào):[2018]117),并在研究中獲得了患者知情同意。納入患者臨床資料見(jiàn)表1。

表1 兩組納入患者的基本臨床資料Table 1 Patient characteristics in two groups

納入標(biāo)準(zhǔn):①年齡18-80歲;②急性腦卒中發(fā)病到醫(yī)院就診時(shí)間≤7 d;③磁共振彌散序列成像(MRI-DWI)確認(rèn)為新發(fā)缺血性腦卒中;④通過(guò)頸動(dòng)脈血管超聲、經(jīng)顱多普勒超聲(TCCD)、頭部及頸部CT血管成像、頭部MRA或數(shù)字減影血管造影(DSA)明確病因;⑤已超過(guò)靜脈溶栓時(shí)間窗并且已不能進(jìn)行血管內(nèi)治療的患者。

排除標(biāo)準(zhǔn):①病因不明;②使用任何免疫抑制劑;③患有免疫性疾病;④嚴(yán)重心臟、肝臟及脾臟疾病。

分組依據(jù):根據(jù)TOAST分型診斷標(biāo)準(zhǔn)[10],將納入患者分為大動(dòng)脈粥樣硬化性卒中和小動(dòng)脈閉塞性卒中兩組。

1.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)T細(xì)胞亞群

所有納入患者在接受治療前通過(guò)肘部采集外周血,用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)(BD LSRII,Becton Dickinson公司,美國(guó))。所用抗體均購(gòu)買于BD Pharmingen公司(美國(guó))或BioLegend公司(美國(guó))。流式細(xì)胞儀檢測(cè)方法:①采集患者靜脈血,充分抗凝。②每管取100 μl抗凝全血至流式管,按熒光抗體染色組合加入各自抗體。③將血液與熒光標(biāo)記抗體混勻后室溫避光反應(yīng)20 min。④每個(gè)樣品管加入1×紅細(xì)胞裂解液,混勻后室溫避光孵育10 min。⑤300g離心5 min,棄上清。⑥每個(gè)樣品管中加入流式細(xì)胞洗液,混勻后300g離心5 min,棄上清。⑦向每個(gè)樣品管中再次加入流式細(xì)胞洗液,混勻后4 ℃避光,及時(shí)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。⑧收集細(xì)胞,采用美國(guó)BD LSRII型流式細(xì)胞儀上機(jī)分析細(xì)胞群,用FACS Diva6.1.3軟件分析細(xì)胞群數(shù)據(jù)。檢測(cè)的細(xì)胞亞群包括:CD3+T細(xì)胞、CD3+CD4-CD8-T細(xì)胞(double-negative T cells,DNTs)、CD3+CD4+T細(xì)胞、CD3+CD8+T細(xì)胞。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)和Levene檢驗(yàn)評(píng)估連續(xù)變量分布的正態(tài)性和方差齊性。如滿足正態(tài)分布,采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述,并采用Student’st檢驗(yàn)分析兩組變量之間的差異;如不符合正態(tài)分布,采用中位數(shù)(四分位數(shù)間距)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述,采用非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 T淋巴細(xì)胞亞群在大動(dòng)脈粥樣硬化性和小動(dòng)脈閉塞性卒中患者外周血中的百分比差異

研究結(jié)果表明CD3+T細(xì)胞、CD3+CD4+T細(xì)胞以及CD3+CD4-CD8-T細(xì)胞在大動(dòng)脈粥樣硬化性卒中患者和小動(dòng)脈閉塞性卒中患者外周血中百分比間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05,見(jiàn)圖1)。但是CD3+CD8+T細(xì)胞在小動(dòng)脈閉塞性卒中患者外周血中的百分比明顯高于大動(dòng)脈粥樣硬化性卒中患者外周血中的百分比,兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.295,P=0.027,見(jiàn)圖1)。

SSC:側(cè)向角散射;FSC:前向角散射;CD:白細(xì)胞分化抗原圖1 不同亞型T細(xì)胞在缺血性腦卒中患者急性期外周血中的比例Figure 1 The proportion of different subtypes of T cells in peripheral blood of patients with acute ischemic stroke

2.2 性別及糖尿病對(duì)T淋巴細(xì)胞亞群在患者外周血中分布的影響

臨床資料分析顯示大動(dòng)脈粥樣硬化組患者中女性發(fā)病比例和糖尿病發(fā)病比例高(見(jiàn)表1)。因此本研究進(jìn)一步對(duì)比了男性患者組與女性患者組外周血中CD3+CD8+T細(xì)胞的百分比,結(jié)果顯示兩組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.908,P=0.370,見(jiàn)圖2)。為了排除糖尿病對(duì)研究結(jié)果的影響,課題組在研究中還對(duì)比了糖尿病組和無(wú)糖尿病組患者外周血中CD3+CD8+T細(xì)胞的百分比,結(jié)果顯示兩組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.768,P=0.447,見(jiàn)圖2)。為了減少性別對(duì)CD3+CD8+T細(xì)胞在外周血中分布的影響,所有女性患者被去除后,對(duì)比兩組間男性患者外周血中CD3+CD8+T細(xì)胞的百分比差異,結(jié)果顯示小動(dòng)脈閉塞性卒中患者外周血中的百分比明顯高于大動(dòng)脈粥樣硬化性卒中患者外周血中的百分比,兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.214,P=0.035,見(jiàn)圖2)。

圖2 CD3+CD8+T細(xì)胞在不同人群缺血性腦卒中患者急性期外周血中的百分比Figure 2 Percentage of CD3+CD8+T cells in peripheral blood of patients with acute ischemic stroke in various populations

3 討論

缺血性腦卒中因其發(fā)病原因不同所致預(yù)后結(jié)局也有所差別,目前臨床推薦根據(jù)不同病因?yàn)榛颊咛峁┐_切的治療方式[11]。因此明確不同亞型腦卒中發(fā)病機(jī)制間的差異是目前臨床面對(duì)的一項(xiàng)主要問(wèn)題。作為兩種最主要的腦卒中類型,大動(dòng)脈粥樣硬化性卒中和小動(dòng)脈閉塞性卒中成為目前病因?qū)W研究的重點(diǎn)。

顱內(nèi)外血管的血栓形成是大動(dòng)脈粥樣硬化性腦卒中發(fā)病的主要原因,可造成顱內(nèi)外血管供血不足,從而導(dǎo)致腦細(xì)胞代謝功能障礙,并引起相應(yīng)供血區(qū)腦組織發(fā)生炎癥反應(yīng),最終造成神經(jīng)細(xì)胞的壞死和凋亡[12]。小動(dòng)脈閉塞性卒中的發(fā)病多與長(zhǎng)期高血壓對(duì)血管的損傷有關(guān),長(zhǎng)期高血壓引起小動(dòng)脈壁玻璃樣變性、內(nèi)膜增生硬化、動(dòng)脈壁局部結(jié)構(gòu)紊亂,逐步造成相應(yīng)腦功能區(qū)供血障礙、細(xì)胞壞死、炎癥反應(yīng)發(fā)生,并最終導(dǎo)致腦卒中的發(fā)生[13]。因此大動(dòng)脈粥樣硬化性卒中和小血管閉塞性卒中在發(fā)病機(jī)制上具有一定的差異。

免疫反應(yīng)在腦卒中急性期組織損傷及后期組織修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究均表明,在缺血性腦卒中發(fā)病早期即出現(xiàn)明顯的免疫反應(yīng),在腦缺血區(qū)域可檢測(cè)到T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞的過(guò)度募集,這些免疫細(xì)胞可通過(guò)刺激炎癥因子的產(chǎn)生和細(xì)胞毒性蛋白酶的分泌導(dǎo)致神經(jīng)組織的損傷[14]。目前研究發(fā)現(xiàn)由于不同病因?qū)е碌哪X卒中病理過(guò)程有一定的差異,因此不同病因的腦卒中患者的免疫反應(yīng)也有差別[15]。

T淋巴細(xì)胞作為主要的免疫細(xì)胞,參與腦卒中急性期的組織損傷過(guò)程。既往科學(xué)研究發(fā)現(xiàn),在腦卒中患者急性期,40%侵入的T淋巴細(xì)胞為CD4+輔助性T細(xì)胞(CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞),30%為CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞)[13]。CD4+T淋巴細(xì)胞通過(guò)介導(dǎo)白介素、腫瘤壞死因子等炎癥因子的產(chǎn)生誘發(fā)腦組織的損傷[7,16]。細(xì)胞毒性CD8+T淋巴細(xì)胞通過(guò)釋放細(xì)胞毒性蛋白酶參與神經(jīng)元損傷的病理過(guò)程[17]。此外Meng Hailan課題組[18]研究發(fā)現(xiàn),CD3+CD4-CD8-T淋巴細(xì)胞通過(guò)調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)參與了腦卒中發(fā)病過(guò)程中的腦組織損傷。

在本研究中,課題組應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)分析不同亞型缺血性腦卒中患者急性期外周血中T淋巴細(xì)胞的分布。結(jié)果表明CD3+T細(xì)胞、CD3+CD4+T細(xì)胞以及CD3+CD4-CD8-T細(xì)胞在大動(dòng)脈粥樣硬化性卒中患者和小動(dòng)脈閉塞性卒中患者外周血中的百分比無(wú)明顯差異。但是CD3+CD8+T細(xì)胞在小動(dòng)脈閉塞性卒中患者外周血中的百分比明顯高于大動(dòng)脈粥樣硬化性卒中患者外周血中的百分比,兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此結(jié)果提示,細(xì)胞毒性CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞在小動(dòng)脈閉塞性卒中患者急性期外周血中被更多活化。此外,有研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)腦組織損傷時(shí),在外周血管腔內(nèi)和周圍間隙有明顯的CD3+CD8+T細(xì)胞的聚集[19]。這一現(xiàn)象可能與CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞在小動(dòng)脈閉塞性腦卒中患者急性期外周血中表達(dá)增加有關(guān)。由于細(xì)胞毒性CD8+T淋巴細(xì)胞主要通過(guò)釋放細(xì)胞毒性蛋白酶參與神經(jīng)組織的損傷,在未來(lái)研究中應(yīng)該進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞毒性蛋白酶在小動(dòng)脈閉塞性腦卒中發(fā)病過(guò)程中作用。

既往有研究提出隨著年齡增加,人群大動(dòng)脈粥樣硬化負(fù)擔(dān)加重[20]。絕經(jīng)后女性動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂風(fēng)險(xiǎn)增加,造成急性血管栓塞風(fēng)險(xiǎn)增高[21]。并且高齡患者發(fā)生糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)增加[22]。在納入研究的患者中,臨床資料也顯示大動(dòng)脈粥樣硬化組患者年齡較大,女性患者比例和糖尿病患者比例也較高。為了進(jìn)一步驗(yàn)證CD3+CD8+T細(xì)胞在小動(dòng)脈閉塞性卒中患者和大動(dòng)脈粥樣硬化性卒中患者外周血中的百分比差異,本研究分析了男性患者與女性患者外周血中CD3+CD8+T細(xì)胞的百分比,并且對(duì)比了糖尿病組和無(wú)糖尿病組患者外周血中CD3+CD8+T細(xì)胞的百分比,結(jié)果均提示組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。為了減少混雜因素影響CD3+CD8+T細(xì)胞在外周血中的表達(dá),所有女性患者被去除后,再次對(duì)比了兩組男性患者外周血中CD3+CD8+T細(xì)胞的百分比差異,結(jié)果提示小動(dòng)脈閉塞性卒中患者外周血中的百分比明顯高于大動(dòng)脈粥樣硬化性卒中患者外周血中的百分比,兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這一結(jié)果提示CD3+CD8+T細(xì)胞在小動(dòng)脈閉塞性卒中患者外周血中的分布增加在男性患者人群中更加明顯。

4 結(jié)論

與大動(dòng)脈粥樣硬化性卒中患者相比,在小動(dòng)脈閉塞性卒中患者急性期外周血中CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞被更多活化,在缺血性腦卒中患者預(yù)后分析和治療中應(yīng)考慮到不同病因誘發(fā)的免疫反應(yīng)間的差異。但是本組研究樣本量偏小,并且為單中心病例研究,可能存在系統(tǒng)性誤差,在未來(lái)研究中,更多中心患者的數(shù)據(jù)應(yīng)該被納入用于進(jìn)一步的驗(yàn)證。