奧沙利鉑誘導的結腸癌細胞衰老模型的特性

潘鷺翔,賀 維,程柏楊,2,朱茂榮,2,顧錦濤,張 毅*

(1空軍軍醫(yī)大學藥學系生物制藥學教研室,西安 710032;2空軍軍醫(yī)大學基礎醫(yī)學院;*通訊作者,E-mail:zhangyi@fmmu.edu.cn)

奧沙利鉑(Oxaliplatin, OXA)是第三代鉑類抗癌化合物,以鉑原子與DNA形成交叉聯(lián)結對細胞發(fā)揮基因毒性作用[1],以奧沙利鉑為基礎的聯(lián)合化療常規(guī)應用于晚期和轉移性結直腸癌[2]。然而,晚期結腸癌患者常常因腫瘤復發(fā)、轉移導致治療的失敗,最新研究表明,基因毒性類化療藥物會對腫瘤細胞造成治療性衰老(therapy-induced-senescence, TIS)[3],其會表現(xiàn)出衰老細胞的特性,并在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮其功能[4]。其中包括通過衰老分泌相關表型(senescence-associated secretory phenotype, SASP)引起腫瘤的復發(fā)、轉移[5];通過衰老逃逸導致腫瘤“死而復生”[6];通過改變腫瘤干細胞特性促進腫瘤發(fā)展[7]。為了更全面了解化療致腫瘤細胞衰老,本文旨在構建奧沙利鉑處理后結腸癌細胞衰老模型,全面探索衰老結腸癌細胞的表型與特性,為進一步探索衰老結腸癌細胞在腫瘤微環(huán)境及腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞系和主要試劑

人結腸癌細胞系HCT-116、HT-29為本實驗室保存,青霉素鏈霉素混合液、DMEM高糖培養(yǎng)基及胎牛血清購于美國Gibco公司。培養(yǎng)皿、孔板及共聚焦小皿購于美國CORNING公司?；熕幬飱W沙利鉑(Oxaliplatin, OXA)購于美國Selleck公司。β-半乳糖苷酶試劑盒購于中國Solarbia公司?？贵wp21、β-gal、γ-H2AX、p53、CDK2、p38及p16購于美國Abcam公司,辣根過氧化物酶標記的二抗、熒光二抗及DAB顯色液均購自西安壯志生物科技有限公司。EDU檢測試劑盒購于上海銳博公司。Trizol試劑購自美國Thermo公司,RNA逆轉錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒購自日本Takara公司,qRT-PCR引物均由北京擎科生物科技有限公司設計合成。CCK-8試劑盒購自上海陶術生物科技有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞給藥及β-半乳糖苷酶染色 采用0,2.5,5,10 μmol/L的奧沙利鉑(Oxaliplatin, OXA)處理結腸癌細胞,并進行β-半乳糖苷酶染色,并篩選β-半乳糖苷酶表達最高的處理濃度作為衰老模型造模最佳濃度。用含10%的胎牛血清、1%的青鏈霉素混合液的DMEM培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基)培養(yǎng)結腸癌細胞HCT-116、HT-29于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。使細胞生長至對數(shù)期,將兩種結腸癌細胞以5×105個/皿分別接種于直徑為6 cm的培養(yǎng)皿中,24 h后更換含濃度分別為0,2.5,5,10 μmol/L的OXA完全培養(yǎng)基進行給藥處理。藥物作用每3 d,更換一次相應藥物濃度的完全培養(yǎng)基。在OXA誘導7 d時,進行β-半乳糖苷酶(β-galactosidase, β-gal)染色及形態(tài)學觀察,測量細胞直徑。

β-gal染色:染色前去除培養(yǎng)基,用PBS緩沖液洗滌,每孔加入β-gal染色固定液1 ml,室溫下靜置固定15 min;去除細胞固定液,用PBS緩沖液洗滌細胞3 min,洗滌3遍;按照β-gal染色試劑盒說明書配置染色工作液,每孔加入1 ml染色工作液,37 ℃孵育過夜;第2天光學顯微鏡下觀察。陽性細胞染色后呈藍綠色,陰性細胞不被染色;顯微鏡下各組選取3個視野,計數(shù)細胞總數(shù)和β-gal染色陽性細胞數(shù),計算陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)的百分比。

1.2.2 激光共聚焦檢測衰老標志物p21、β-gal 將結腸癌細胞HCT-116、HT-29分別分為未處理組(OXA 0 μmol/L)及衰老模型組(OXA 2.5 μmol/L),采用激光共聚焦免疫熒光檢測衰老標志物p21、β-gal的表達水平。將細胞以2×105個/孔提前24 h接種于共聚焦小皿中,PBS緩沖液洗滌后用4%多聚甲醛固定15 min,隨后用含0.5% Triton的PBS緩沖液以1 ∶250的比例稀釋一抗(p21、β-gal)4 ℃孵育過夜,次日PBS緩沖液洗滌3次后,以1 ∶400的稀釋比的熒光二抗室溫避光孵育1 h,PBS洗滌后加入100 μl即用型DAPI孵育2 min,PBS洗滌3次后用激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.2.4 蛋白免疫印跡檢測γ-H2AX、p53、p21、CDK2、p38及p16蛋白表達情況 分組同1.2.2,采用Western blot檢測未處理組及衰老模型組的DNA損傷相關標志物γ-H2AX、p53及p38、細胞周期相關標志物p21、p16及CDK2的蛋白表達水平。將對照細胞及衰老細胞分別接種于培養(yǎng)皿中,待細胞密度達80%左右時分別收集細胞,使用RIPA裂解液于冰上裂解30 min提取各組總蛋白并進行BCA定量。以β-actin為內(nèi)參進行十二烷基硫酸鈉聚烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE),轉膜于甲醇活化后的PVDF膜上,再用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h,隨后用一抗(β-actin稀釋比為1 ∶3 000;γ-H2AX、p53、p21、CDK2、p38及p16稀釋比均為1 ∶1 000)于4 ℃搖床孵育過夜,用洗膜緩沖液(Tris buffered saline tween, TBST)在室溫下?lián)u床上清洗3遍,每遍10 min,然后室溫孵育與一抗對應的二抗1 h,TBST清洗3遍,每遍10 min,最后用ECL化學發(fā)光儀發(fā)光。

1.2.5 qRT-PCR檢測衰老細胞相關分泌表型(senescence-associated secretory phenotype, SASP) 分組同1.2.2,通過qRT-PCR檢測未處理組及衰老模型組的SASP因子IL-6、IL-8、IL-10、CXCL10、MMP-1及MMP-3。收集對照細胞及衰老細胞,用Trizol提取試劑分別提取總RNA并進行定量。將提取的總RNA用Takara反轉錄試劑盒反轉錄為cDNA,反應條件為37 ℃ 15 min,95 ℃ 10 s。按照qPCR試劑盒說明書配置反應體系,反應條件為95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,40次循環(huán)后記錄數(shù)據(jù),引物序列見表1。以β-actin為內(nèi)參,使用2-ΔΔCt法分析各個SASP因子的相對表達量。

表1 實時定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences for qPCR

1.2.6 CCK-8檢測細胞活力 分組同1.2.2,采用CCK-8法檢測未處理組及衰老模型組在同一藥物濃度中的細胞活力。收集對照細胞及衰老細胞,用細胞計數(shù)儀計數(shù)后,按5×103個/孔接種至96孔板中,給予不同劑量(0,2.5,5,10,20,40,80 μmol/L)的OXA處理24 h后,按照與培養(yǎng)基10 ∶1配置CCK-8溶液,分別在每孔加入100 μl配置好的CCK-8溶液,于培養(yǎng)箱中孵育90 min后測定吸光度,以0 μmol/L濃度的吸光度作為歸一化起點制作吸光度曲線。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 不同劑量奧沙利鉑處理后結腸癌細胞形態(tài)變化及β-gal染色

β-gal染色結果顯示經(jīng)不同劑量奧沙利鉑處理細胞后,細胞β-gal表達呈陽性。OXA 0,2.5,5,10 μmol/L處理后HCT-116細胞β-gal陽性率分別為21.21%±2.60%,83.33%±2.91%,60.33%±2.40%,51.33%±3.28%。OXA 0,2.5,5,10 μmol/L處理后HT-29細胞β-gal陽性率分別為20.67%±2.03%,76.67%±2.60%,61.67%±2.03%,49.00%±4.619%。其中經(jīng)2.5 μmol/L奧沙利鉑處理的HCT-116、HT-29細胞β-gal陽性率最高,與OXA 0 μmol/L組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001,見圖1)。

通過高倍鏡下觀察發(fā)現(xiàn),與未處理細胞比較,2.5 μmol/L奧沙利鉑誘導的細胞細胞核明顯增大、墨綠色深染、直徑增大,出現(xiàn)衰老細胞的表征,其直徑差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001,見圖2)。以上結果表明2.5 μmol/L奧沙利鉑導致結腸癌細胞高表達衰老相關β-gal并在形態(tài)學上出現(xiàn)衰老細胞表征。因此,我們將2.5μmol/L奧沙利鉑處理細胞作為誘導衰老模型,進行后續(xù)實驗。

墨綠色表示細胞β-gal陽性;與0 μmol/L OXA組相比,***P<0.001圖1 不同濃度奧沙利鉑處理的HCT-116、HT-29細胞β-gal染色Figure 1 β-gal staining of HCT-116 and HT-29 cells treated with different concentrations of OXA

2.2 奧沙利鉑誘導衰老細胞標志物表達鑒定

免疫熒光結果顯示,與未處理組(OXA 0 μmol/L)比較,衰老模型組(OXA 2.5 μmol/L)細胞衰老標志物p21、β-gal出現(xiàn)不同程度的高表達,HCT-116、HT-29雙陽性細胞比率分別為63.67%±2.03%和78.33%±1.33%,與未處理組相比有顯著差異(P<0.001,見圖3)。以上結果說明,低劑量奧沙利鉑處理的結腸癌細胞高表達衰老標志物p21,并與β-gal在衰老細胞上共定位,進一步說明低劑量奧沙利鉑能導致結腸癌細胞衰老。

墨綠色表示細胞β-gal陽性;與0 μmol/L OXA組相比,***P<0.001圖2 高倍鏡下0 μmol/L與2.5 μmol/L OXA處理后HCT-116和HT-29細胞β-gal染色及其直徑比較Figure 2 Comparison of β-Gal staining and diameter between 0 μmol/L OXA groupand 2.5 μmol/L OXA group at high magnification

2.3 奧沙利鉑誘導細胞衰老對細胞增殖的影響

流式細胞術結果顯示,衰老模型組HCT-116和HT-29細胞的Edu陽性率分別為13.82%±3.01%和78.33%±3.33%。與未處理組比較,衰老組的Edu陽性比例顯著下降(P<0.001,見圖4)。以上結果表明,衰老細胞增殖能力顯著降低。

p21陽性為綠色,β-gal陽性為紅色,DAPI藍色;與0 μmol/L OXA組相比,***P<0.001圖3 免疫熒光檢測奧沙利鉑誘導衰老細胞中p21、β-gal的表達情況Figure 3 Expression of senescent markers p21 and β-gal in OXA-induced senescent cells

圖4 流式細胞術檢測奧沙利鉑誘導衰老細胞中Edu陽性細胞比率Figure 4 Edu positive cells in OXA-induced senescent cells by flow cytometry

2.4 奧沙利鉑誘導細胞衰老對DNA損傷相關蛋白表達的影響

蛋白免疫印跡實驗顯示,與未處理組相比,2.5 μmol/L OXA奧沙利鉑誘導的衰老細胞表達DNA損傷標志物γ-H2AX、損傷修復標志物p53、衰老標志物p21及細胞周期依賴性激酶CDK2的水平顯著升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001,見圖5),但p38、p16蛋白水平?jīng)]有統(tǒng)計學差異。上述結果說明,奧沙利鉑是通過DNA損傷導致p21上調,引起細胞周期阻滯,從而導致細胞衰老。

與0 μmol/L OXA組相比,***P<0.001圖5 蛋白免疫印跡檢測奧沙利鉑誘導衰老細胞中相關蛋白表達情況Figure 5 Expression of related proteins in OXA-induced senescent cells by Western blot

2.5 奧沙利鉑誘導衰老細胞相關分泌表型(SASP)的鑒定

通過qRT-PCR統(tǒng)計分析結果顯示,與未處理細胞相比,在衰老的HCT-116細胞中IL-6、IL-8、IL-10、CXCL10及MMP-3顯著升高;同時,與未處理細胞相比,在衰老的HT-29細胞中IL-6、IL-8、CXCL10、MMP-1及MMP-3也顯著升高(P<0.001,見圖6),而與未處理細胞相比,MMP-1在HCT-116細胞及IL-10在HT-29細胞中變化無統(tǒng)計學差異。以上結果說明,奧沙利鉑誘導結腸癌細胞衰老后,衰老細胞形成不同的衰老細胞分泌表型。

2.6 奧沙利鉑誘導衰老細胞對化療耐藥的影響

CCK-8結果顯示,在逐漸加大藥物劑量的情況下,與未處理結腸癌細胞相比,奧沙利鉑誘導衰老細胞的細胞活力(吸光度450 nm)在40,60,80 μmol/LOXA處理時顯著提高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001,見圖7),說明隨著化療藥劑量的增加,衰老細胞對藥物更加不敏感,并且產(chǎn)生奧沙利鉑藥物抵抗性。

3 討論

結直腸癌是僅次于乳腺癌和肺癌的第三大常見癌癥。根據(jù)最新統(tǒng)計,2020年全球約有190萬結直腸癌新發(fā)和93.5萬人死亡病例[8],并且初診時有21%的病人已是晚期。對于結腸癌晚期患者,化療是主要治療手段之一,但部分患者化療后仍出現(xiàn)腫瘤復發(fā)和轉移導致治療失敗。引起腫瘤惡性進展的可能潛在機制包括DNA損傷修復、細胞抗凋亡和表觀遺傳學的改變等原因[9]。許多研究表明,化療導致的細胞衰老是導致腫瘤復發(fā)轉移的重要“元兇”[10]。

與0 μmol/L OXA組相比,***P<0.001圖6 qRT-PCR檢測奧沙利鉑誘導衰老細胞中常見的SASP因子Figure 6 Levels of common SASP factors in OXA-induced senescent cells by qRT-PCR

與未處理結腸癌細胞相比,***P<0.001圖7 CCK-8檢測未處理及衰老細胞在不同藥物濃度下的細胞活力Figure 7 Cell viability of CRC and senescent cells under different drug concentrations by CCK-8 assay

衰老是一種細胞狀態(tài),表現(xiàn)為穩(wěn)定的細胞周期停滯[11],特點是β-半乳糖苷酶活性上升。傳統(tǒng)治療腫瘤的觀點認為,衰老通過阻止腫瘤細胞復制來抑制腫瘤[12],被認為是對癌癥治療有利的因素。然而,這種治療策略通常忽略了衰老腫瘤細胞在基因組和轉錄水平上的廣泛異質性[13,14],不同治療方法導致的衰老細胞會產(chǎn)生不同的表型及特性,導致不同的腫瘤微環(huán)境[15],此外,最新研究表明,來自衰老腫瘤群體的細胞通常比原始群體更具侵襲性[16,17]。因此,研究衰老腫瘤細胞特性,以及其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用是十分必要的。

奧沙利鉑是結腸癌患者最主要的一線化療藥物。我們研究發(fā)現(xiàn),低劑量的奧沙利鉑處理結腸癌細胞系HCT-116和HT-29能導致細胞衰老,其β-gal的酶活性上升、細胞體積增大及腫脹,而且衰老細胞不具備增殖能力。同時鑒定了衰老細胞主要是由DNA損傷引起p21上調而后細胞周期阻滯導致細胞衰老。衰老細胞的長期存在可能會通過SASP分泌因子及其特性影響腫瘤微環(huán)境導致化療的失敗[5],本研究發(fā)現(xiàn),雖然不同細胞系分泌的細胞因子、趨化因子及金屬蛋白酶略有不同,但與對照細胞相比都呈高表達,形成不同的衰老相關分泌表型。我們還發(fā)現(xiàn)衰老細胞對藥物敏感性顯著低于普通腫瘤細胞,可能是由于衰老細胞代謝能力降低、對外界刺激不敏感,或是特殊的機制引起的化療抵抗特性,這還有待進一步探究。

綜上所述,我們發(fā)現(xiàn)低劑量奧沙利鉑導致結腸癌細胞衰老并鑒定了其衰老特征和標志物,初步探索了衰老細胞分泌相關表型及耐藥特性。本研究建立的奧沙利鉑誘導衰老腫瘤細胞模型為研究衰老腫瘤細胞的微環(huán)境奠定了基礎,針對衰老腫瘤細胞特性,探索治療腫瘤的新策略提供了新的思路。