分蘗相關(guān)基因在再生稻腋芽萌發(fā)期的表達(dá)分析

朱容 劉歆 吳建偉 劉念 梁大成 劉章勇

摘要：【目的】明確分蘗相關(guān)基因在再生稻腋芽萌發(fā)期的表達(dá)動(dòng)態(tài)變化，為闡明水稻再生季腋芽發(fā)育的調(diào)控機(jī)理提供理論依據(jù)?！痉椒ā恳栽偕痔Y能力強(qiáng)的材料i21和再生分蘗能力弱的材料i89為研究對(duì)象，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)8個(gè)分蘗相關(guān)基因在水稻頭季（分蘗始期和拔節(jié)孕穗期）和再生季不同時(shí)期（頭季去穗后1、24、48和72 h）的表達(dá)動(dòng)態(tài)變化，并分析分蘗相關(guān)基因間及其與最大再生分蘗的相關(guān)性，篩選出與腋芽生長(zhǎng)相關(guān)性高的基因?！窘Y(jié)果】自頭季稻稻穗收割后，材料i21和i89的再生分蘗數(shù)的變化趨勢(shì)基本一致，均隨著腋芽的生長(zhǎng)再生分蘗數(shù)逐漸增多，收割后20 d達(dá)最多并趨于穩(wěn)定，但材料i21再生季發(fā)苗多且快，再生分蘗發(fā)生速度明顯高于材料i89;材料i21和i89的最大再生分蘗數(shù)為33和10個(gè)。LAX1、LAX2和MOC1基因的相對(duì)表達(dá)量在不同材料不同時(shí)期間均存在明顯差異，其中自頭季去穗后，除MOC1基因在頭季去穗后72 h的相對(duì)表達(dá)量外，LAX1、LAX2和MOC1基因在水稻再生分蘗形成期均表現(xiàn)為材料i21中的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于材料i89（P<0.01，下同），MOC1基因在頭季去穗后1 h達(dá)峰值，LAX1和LAX2基因在頭季去穗后24 h達(dá)峰值，隨后顯著降低（P<0.05，下同）并趨于穩(wěn)定。頭季去穗后，除TAD1基因在頭季去穗后24 h時(shí)外，材料i89中D10、HTD1、OsTB1和TAD1基因的相對(duì)表達(dá)量均極顯著高于材料i21中的相對(duì)表達(dá)量，D10和HTD1基因在頭季去穗后1 h達(dá)峰值，OsTB1和TAD1基因在頭季去穗后24和48 h達(dá)峰值，D27基因在材料i21和i89中的相對(duì)表達(dá)量均先升高后降低，且頭季去穗后24～72 h，D27基因在材料i21中的表達(dá)量極顯著高于材料i89。最大再生分蘗數(shù)分別與LAX2和MOC1基因的表達(dá)水平呈極顯著和顯著正相關(guān)，與D10、HTD1、OsTB1和TAD1基因的表達(dá)量呈極顯著負(fù)相關(guān)。此外，不同基因的表達(dá)水平也存在不同相關(guān)性?！窘Y(jié)論】LAX1、LAX2和MOC1基因高表達(dá)有利于水稻再生季分蘗的形成，D10、HTD1、OsTB1和TAD1基因高表達(dá)會(huì)抑制水稻再生季分蘗的形成。不同分蘗相關(guān)基因間存在相互作用，共同調(diào)控水稻再生季分蘗的形成。

關(guān)鍵詞： 分蘗基因;再生稻;腋芽;表達(dá)分析

中圖分類號(hào)：S511.035.3? ?; ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2021）10-2632-09

Abstract：【Objective】 The expression of tiller-related genes during axillary bud outgrowth in ratoon rice were profiled to provide insight into the molecular mechanisms underlying axillary bud development in the ratoon season. 【Method】 The rice varieties i21 and i89 with high and low ratooning abilities， respectively， were used as the study materials. Real-time fluorescence quantitatire PCR （qRFRCR） was used to characterize the expression dynamics of eight tiller-related genes at the stages of tiller initiation， elongation and booting of the first season and at 1， 24， 48 and 72 h after heading removal in the ratoon season. The correlation between tiller-related genes and maximum ratoon tillers was analyzed and the genes with high correlation with axillary bud growth were selected.【Result】The number of ratoon tillers in i21 and i89 increased gradually with the growth of axillary buds and reached a stable maximum 20 d after the first-season harvest. However， i21 ratoon tillers grew much faster than those of i89 and the maximum number of ratoon tillers of i21 and i89 were 33 and 10， respectively. The relative expression levels of LAX1， LAX2 and MOC1 genes differed significantly in the two varieties. The relative expression levels of LAX1， LAX2 and MOC1 genes in i21 were significantly higher than those in i89 during the ratooning period （P<0.01， the same below）. MOC1 reached peak levels at 1 h after beheading， whereas the expressions of LAX1 and LAX2? peaked at 24 h after beheading then decreased significantly （P<0.05， the same below） to stable levels thereafter. During ratooning， the relative expression levels of D10， HTD1， OsTB1 and TAD1 genes in i89 were significantly higher than those in i21， except for TAD1 at 24 h after beheading. D10 and HTD1 genes peaked at 1 h after beheading， while OsTB1 and TAD1 genes reached their peak values later at 24 and 48 h after beheading. The relative expression levels of D27 in i21 and i89 increased initially but decreased at 24-72 h after heading removal， although this decrease in i21 was significantly less than that in i89. The maximum tiller number was positively and significantly correlated with the expression levels of LAX2 and MOC1 and negatively correlated with those of D10， HTD1， OsTB1 and TAD1. In addition， different gene expression levels also had different correlations.【Conclusion】The high expression of LAX1， LAX2 and MOC1 genes was beneficial to the formation of ratoon tillers， while the high expression of D10， HTD1， OsTB1 and TAD1 genes inhibited ratoon till outgrowth. This work indicates that the different tiller-related genes interacted to jointly regulate ratoon tiller formation.

Key words：tiller gene; ratoon rice; axillary bud; expression analysis

Foundation item：Key Scientific and Technological Project of Hubei （2020BBA044）

0 引言

【研究意義】水稻（Oryza sativa L.）是我國(guó)乃至全世界重要的糧食作物，其產(chǎn)量一直備受關(guān)注（劉貴富等，2018）。目前增加水稻播種面積和單產(chǎn)日益困難，增加復(fù)種指數(shù)成為提高稻谷產(chǎn)量的關(guān)鍵舉措（Ray Foley，2013;Dong et al.，2017）。再生稻作為一種土地高效利用、資源節(jié)約型的栽培模式，具有米質(zhì)優(yōu)、低污染、低能耗的特點(diǎn)，是提高復(fù)種指數(shù)、增加稻谷產(chǎn)量的有效途徑（朱永川等，2013;徐富賢，2015;Jiang et al.，2016;Tao et al.，2016;劉歆等，2020）。由于分蘗力是水稻的重要農(nóng)藝性狀，直接影響稻谷產(chǎn)量（李學(xué)勇等，2003;李經(jīng)勇等，2009;孫秀紅和胡波，2020），因此，腋芽萌發(fā)能力是再生稻產(chǎn)量的關(guān)鍵因素（李貴勇等，2015;習(xí)敏等，2017;胡香玉等，2019;汪浩等，2019）。對(duì)再生稻分蘗力進(jìn)行分子生物學(xué)方面的研究，以期解析再生稻分蘗產(chǎn)生和調(diào)控的分子機(jī)理，對(duì)選育強(qiáng)再生力的水稻品種具有重要的指導(dǎo)意義。【前人研究進(jìn)展】目前，已研究證實(shí)水稻分蘗相關(guān)基因MONOCULM1（MOC1）、LAX1、LAX2、D10、HTD1、D27、OsTB1和TAD1的表達(dá)影響水稻分蘗形成，其中MOC1基因是第一個(gè)發(fā)現(xiàn)的控制水稻分蘗的單蘗基因，其等位基因?yàn)镚NP6（Li et al.，2003;Shao et al.，2019;Zhang et al.，2021），編碼植物特有的GRAS家族蛋白（Bolle，2004），在腋生分生組織的發(fā)生、分蘗芽的形成過(guò)程中發(fā)揮促進(jìn)作用;LAX1基因在植株的側(cè)生分生組織的起始發(fā)育發(fā)揮重要作用，編碼非典型的bHLH（basic-Helix-Loop-Helix）型轉(zhuǎn)錄因子，在頂端分生組織與新形成的分生組織之間的邊界區(qū)域表達(dá)，主要調(diào)節(jié)水稻腋芽原基的形成（Maekawa et al.，2001;Komatsu et al.，2003;Oikawa and Kyozuka，2009）;LAX2基因編碼一個(gè)核蛋白，該蛋白含有植物特有的保守結(jié)構(gòu)域，能與LAX1發(fā)生蛋白互作，Gnp4為其等位基因，LAX2/Gnp4基因編碼一個(gè)功能未知的核蛋白，調(diào)控水稻腋生分生組織的形成（Tabuchi et al.，2011;Zhang et al.，2011）;D10、HTD1和D27基因參與獨(dú)腳金內(nèi)酯（Strigolactones，SLs）的生物合成，SLs是一種控制植物分枝的新激素，其可抑制植物分枝和側(cè)芽生長(zhǎng)（Gomez-Roldan et al.，2008;Umehara et al.，2008）;D10基因與擬南芥的MAX4、豌豆的RMS1和矮牽牛的DAD1是直系同源基因，編碼胡蘿卜素裂解雙加氧酶OsCCD8，該酶抑制側(cè)芽的向外生長(zhǎng)從而使水稻分蘗數(shù)減少（Arite et al.，2007）;HTD1基因編碼胡蘿卜素裂解雙加氧酶OsCCD7，該酶抑制水稻分枝的生長(zhǎng)從而減少水稻分蘗數(shù)（Zou et al.，2005，2006）;D27基因編碼定位于葉綠體上的α-β類胡蘿卜素異構(gòu)酶含鐵蛋白，主要在莖頂端和根部表達(dá)，在SLs生物合成中發(fā)揮關(guān)鍵作用，使水稻分蘗數(shù)減少（Lin et al.，2009;Adrian et al.，2012）;OsTB1/FC1位于同一基因位點(diǎn)，作用于SLs的下游，編碼含TCP結(jié)構(gòu)域的bHLH轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)分蘗發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用;OsTB1基因?qū)Ψ痔Y數(shù)的負(fù)調(diào)控作用是通過(guò)控制腋芽的生長(zhǎng)過(guò)程來(lái)實(shí)現(xiàn)，腋芽中OsTB1基因過(guò)量表達(dá)會(huì)阻礙其形成，最終導(dǎo)致水稻分蘗數(shù)顯著減少，而OsTB1基因功能喪失型突變體fc1分蘗數(shù)顯著增加（Takeda et al.，2003;Minakuchi et al.，2010）;TAD1基因編碼細(xì)胞分裂后期啟動(dòng)復(fù)合物（Anaphase-promoting complex，APC/C）的共激活子，與MOC1基因作用于同一途徑，通過(guò)細(xì)胞周期依賴的方式降低靶標(biāo)MOC1基因的表達(dá)水平，抑制腋生分生組織的起始和形成，從而抑制其分蘗（Lin et al.，2012;Xu et al.，2012）。以上研究表明MOC1、LAX1和LAX2基因促進(jìn)水稻分蘗的形成，而D10、HTD1、D27、OsTB1和TAD1基因抑制水稻分蘗的發(fā)生?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】雖然分蘗相關(guān)基因的功能及其對(duì)水稻分蘗形成影響已有大量研究報(bào)道，但目前鮮見(jiàn)有關(guān)分蘗相關(guān)基因在水稻再生季的表達(dá)特性的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以本課題組篩選出的再生力極端表型水稻品種為材料，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)水稻分蘗相關(guān)基因在極端表型材料中再生季腋芽發(fā)生不同時(shí)期的表達(dá)差異，以期為水稻再生季穗數(shù)形成的分子機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

192份核心水稻種質(zhì)材料，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所提供，用于篩選再生能力極端表型的材料。植物總RNA提取試劑盒E.Z.N.A.? Plant RNA Kit購(gòu)自上海北諾科技生物科技有限公司;2×EasyTaq PCR SuperMix（AS111-01）購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司;cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒Fast Quant RT Kit（with gDNA）和熒光定量試劑盒SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司;100 bp DNA Ladder、1 kb DNA Ladder、4S Green Plus染料和6×Loading Buffer均購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司;Tris堿、硼酸和EDTA購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。5×TBE貯存液是由54 g/L Tris堿、27.5 g/L硼酸、20 mL 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）配制而成，將其稀釋10倍成0.5×TBE;50×TAE貯存液用242 g/L Tris堿、37.2 g/L EDTA和57.1 mL醋酸加水定容至1 L配制。主要設(shè)備儀器：超速離心機(jī)（Eppendorf，德國(guó)）、PCR儀（Bio-Rad，美國(guó)）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Bio-Rad CFX96TM Real-Time System，美國(guó)）、凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad，美國(guó)）、Nanodrop ND-1000分光光度計(jì)（美國(guó)）和水平瓊脂糖凝膠電泳儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 材料篩選 192份核心水稻種質(zhì)材料于2018年分別在荊州、海南陵水和廣東英德共3個(gè)生態(tài)點(diǎn)種植，調(diào)查頭季和再生季最大分蘗數(shù)，篩選出再生能力極端表型的材料，編號(hào)為i21和i89，其中，i21為再生分蘗能力強(qiáng)的材料，i89為再生分蘗能力弱的材料。

1. 2. 2 田間種植 篩選出的材料于2019年夏季在長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗(yàn)基地采用盆栽方式種植，塑料盆上直徑36 cm、高31 cm，每盆裝18±0.3 kg干土，土表距離盆口約4 cm。3月31日播種，4月25日移栽，每盆種4穴，單穴單苗，每個(gè)品種3盆，3次重復(fù)，正常水肥管理。

1. 2. 3 再生季分蘗動(dòng)態(tài)調(diào)查 自頭季稻去穗后，每隔5 d調(diào)查5株水稻，掛牌記錄再生分蘗數(shù)，直至達(dá)到最大分蘗為止。

1. 2. 4 取樣方法 設(shè)6次取樣時(shí)期，分別為頭季分蘗始期（CK）、頭季拔節(jié)孕穗期（R1）、頭季去穗后1 h （R2）、頭季去穗后24 h（R3）、頭季去穗后48 h（R4）和頭季去穗后72 h（R5），取來(lái)自5個(gè)單株節(jié)間倒2節(jié)腋芽的混合樣品（CK為5個(gè)單株水稻基部2 cm左右的混合樣品，統(tǒng)一在水稻達(dá)到4個(gè)分蘗時(shí)取樣），取樣后立即經(jīng)液氮冷凍30 min并于-80 ℃冰箱保存。每個(gè)時(shí)期設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1. 2. 5 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 利用E.Z.N.A.? Plant RNA Kit植物總RNA提取試劑盒提取水稻樣品總RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性，取1 μL用Nanodrop ND-1000分光光度計(jì)測(cè)定其純度和濃度，結(jié)果顯示RNA提取效果好，且RNA無(wú)降解;OD260/OD280為1.8～2.0，純度較好，可滿足后續(xù)的試驗(yàn)要求。

利用Fast Quant RT Kit（with gDNA）試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以Actin為內(nèi)參基因，采用普通PCR檢測(cè)各材料cDNA質(zhì)量，結(jié)果證實(shí)cDNA無(wú)gDNA污染，質(zhì)量較好，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

1. 2. 6 引物設(shè)計(jì) 通過(guò)國(guó)家水稻數(shù)據(jù)中心（http：//www.ricedata.cn/）和已報(bào)道的分蘗基因的相關(guān)文獻(xiàn)資料（Komatsu et al.，2003;Li et al.，2003;Takeda et al.，2003;Arite et al.，2007;Hong et al.，2009），查找分蘗相關(guān)基因信息，然后通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取分蘗相關(guān)基因LAX1、LAX2、MOC1、D10、HTD1、D27、OsTB1和TAD1基因序列，最后通過(guò)BLAST比對(duì)確定其編碼蛋白的保守區(qū)域，然后利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)長(zhǎng)度合適、GC含量合理、無(wú)發(fā)卡結(jié)構(gòu)、無(wú)錯(cuò)配及無(wú)雜帶的引物（表1）。

1. 2. 7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 以Actin作為內(nèi)參基因，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)8個(gè)水稻分蘗相關(guān)基因的表達(dá)情況。按照SuperReal PreMix Plus說(shuō)明配制反應(yīng)體系20.0 μL：10 μL 2×SuperReal PreMix Plus，cDNA模板2.0 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.6 μL，ddH20補(bǔ)足至20.0 μL。反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)檢測(cè)熔解曲線確定反應(yīng)產(chǎn)物特異性，采用比較CT值法（2-△△Ct）計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量（Gomez-Roldan et al.，2008）。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

使用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，用SPSS 21.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 再生分蘗特性比較結(jié)果

由圖1-A可知，自頭季稻稻穗收割后，材料i21和i89再生分蘗數(shù)的變化趨勢(shì)基本一致，均隨著腋芽的生長(zhǎng)再生分蘗數(shù)逐漸增多，收割后20 d達(dá)最多并趨于穩(wěn)定，但材料i21再生季發(fā)苗多且快，再生分蘗發(fā)生速度明顯高于材料i89。由圖1-B可知，這2個(gè)材料的最大再生分蘗數(shù)存在極顯著差異（P<0.01，下同），其中材料i21的最大再生分蘗數(shù)為33個(gè);材料i89的最大再生分蘗數(shù)為10個(gè)，且不同年限間2個(gè)材料的再生能力表現(xiàn)穩(wěn)定（圖1）。

2. 2 分蘗正調(diào)控基因在不同材料不同時(shí)期間的表達(dá)分析結(jié)果

由圖2可知，自頭季去穗后，LAX1基因在材料i21和i89的相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P<0.05，下同），至頭季去穗后24 h達(dá)峰值，隨后顯著降低并趨于穩(wěn)定;LAX2基因在材料i21的相對(duì)表達(dá)量變化趨勢(shì)與LAX1基因基本一致，均呈先升高再降低的變化趨勢(shì)，在頭季去穗后24 h達(dá)峰值，但LAX2基因在材料i89中的表達(dá)量自頭季去穗后呈降低─升高─降低的變化趨勢(shì)，最后逐漸趨于穩(wěn)定;MOC1基因在材料i21和i89的相對(duì)表達(dá)量的變化趨勢(shì)與LAX2基因基本一致。

由圖2還可知，自頭季去穗后，除MOC1基因在頭季去穗后72 h外，LAX1、LAX2和MOC1基因在水稻再生分蘗形成期（R2～R5）均表現(xiàn)為再生分蘗能力強(qiáng)的材料i21中的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于分蘗能力弱的材料i89?？梢?jiàn)，LAX1、LAX2和MOC1基因高表達(dá)可促進(jìn)水稻再生季分蘗形成，表明這3個(gè)基因是參與水稻分蘗芽形成的關(guān)鍵基因，對(duì)分蘗芽的形成發(fā)揮促進(jìn)作用，可提高水稻分蘗數(shù)。

2. 3 分蘗負(fù)調(diào)控基因在不同材料不同時(shí)期的表達(dá)分析結(jié)果

2. 3. 1 SLs合成基因的表達(dá)差異 由圖3可知，自頭季去穗后，D10和HTD1基因在材料i21中的相對(duì)表達(dá)量顯著降低并逐漸趨于穩(wěn)定;D10基因在材料i89的相對(duì)表達(dá)量顯著升高，頭季去穗后1 h達(dá)峰值，隨后顯著降低并趨于穩(wěn)定;材料i89中HTD1基因的相對(duì)表達(dá)量在去頭季穗后1 h顯著升高并達(dá)峰值，隨后先降低再升高并逐漸趨于穩(wěn)定，且其在材料i89的相對(duì)表達(dá)量均高于材料i21;D27基因在材料i21和i89中的相對(duì)表達(dá)量先升高后降低，且頭季去穗24 h后其在材料i21中的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于材料i89，說(shuō)明D10和HTD1基因高表達(dá)會(huì)抑制水稻再生季分蘗形成。

2. 3. 2 OsTB1和TAD1基因的表達(dá)差異 由圖4可知，自頭季去穗后，OsTB1基因在材料i21中的相對(duì)表達(dá)量出現(xiàn)2次先升高后降低，頭季去穗后48 h達(dá)最大值，OsTB1基因在材料i89中的相對(duì)表達(dá)量先升高后降低，頭季去穗后24 h達(dá)峰值，隨后顯著降低，且OsTB1基因在材料i21中的相對(duì)表達(dá)量均顯著低于材料i89;TAD1基因在材料i21和i89中的相對(duì)表達(dá)量均呈先升高后降低趨勢(shì)，但在材料i21中的相對(duì)表達(dá)量在頭季去穗后24 h達(dá)峰值，在材料i89中的相對(duì)表達(dá)量在頭季去穗后48 h達(dá)峰值，且其在材料i89中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于材料i21，說(shuō)明OsTB1和TAD1基因高表達(dá)可抑制水稻再生季分蘗形成。

2. 4 分蘗相關(guān)基因間及其與最大再生分蘗數(shù)間的相關(guān)分析結(jié)果

由表2可知，最大再生分蘗數(shù)分別與LAX2和MOC1基因的表達(dá)水平呈極顯著和顯著正相關(guān)，與TAD1、OsTB1、D10和HTD1基因的表達(dá)水平呈極顯著負(fù)相關(guān)。此外，不同基因的表達(dá)水平也存在不同相關(guān)性，D27基因與LAX1、LAX2和MOC1基因呈極顯著正相關(guān);LAX1基因與LAX2基因、LAX2基因與MOC1基因、D10基因與HTD1基因均呈極顯著正相關(guān);LAX2基因與HTD1基因、D27基因與OsTB1基因均呈極顯著負(fù)相關(guān);OsTB1基因與MOC1和LAX2基因均呈顯著負(fù)相關(guān);D27基因與TAD1基因也呈顯著負(fù)相關(guān)?？梢?jiàn)，分蘗相關(guān)基因的表達(dá)水平與水稻再生季分蘗形成密切相關(guān)，而且不同分蘗相關(guān)基因也存在相互作用，共同調(diào)控水稻再生季分蘗的形成。同時(shí)，進(jìn)一步證實(shí)LAX1、LAX2和MOC1基因的表達(dá)水平升高有利于水稻再生季分蘗形成，D10、HTD1、OsTB1和TAD1基因的表達(dá)水平升高會(huì)抑制水稻再生季分蘗形成。

3 討論

水稻分蘗是一個(gè)受遺傳基因和環(huán)境雙重影響的復(fù)雜數(shù)量性狀（譚震波等，1997;楊川航等，2012;李興星等，2016）。已有研究表明，LAX1、LAX2和MOC1基因均能促進(jìn)水稻腋芽的生長(zhǎng)萌發(fā)，正向調(diào)控水稻分蘗的形成（Maekawa et al.，2001;Li et al.，2003;Tabuchi et al.，2011）。本研究發(fā)現(xiàn)，除MOC1基因在頭季去穗后72 h的相對(duì)表達(dá)量外，LAX1、LAX2和MOC1基因在水稻再生分蘗形成期（R2～R5）均表現(xiàn)為再生分蘗能力強(qiáng)的材料i21中的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于分蘗能力弱的材料i89，說(shuō)明LAX1、LAX2和MOC1基因?qū)τ谒驹偕痔Y的形成發(fā)揮促進(jìn)作用，與其在水稻頭季的研究結(jié)果一致，均能正向調(diào)節(jié)水稻分蘗的形成。MOC1基因在頭季去穗后72 h的相對(duì)表達(dá)量表現(xiàn)為再生分蘗能力強(qiáng)的材料i21顯著低于分蘗能力弱的材料i89，與頭季去穗后其他時(shí)期（R2～R4）剛好相反，其原因可能是頭季去穗后72 h水稻再生腋芽已萌發(fā)，處于伸長(zhǎng)生長(zhǎng)階段，MOC1基因的相對(duì)表達(dá)量升高，與其他通路的基因存在關(guān)聯(lián)，抑制了分蘗，具體的機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步研究探索。

D10、HTD1、D27、OsTB1和TAD1基因是從一系列水稻突變體材料定位克隆出的分蘗相關(guān)基因，均可抑制水稻側(cè)芽的生長(zhǎng)，從而負(fù)調(diào)節(jié)水稻分蘗的形成（Takeda et al.，2003;Zou et al.，2005;Arite et al.，2007;Lin et al.，2009;Xu et al.，2012）。本研究中，D10、HTD1、OsTB1和TAD1基因均在再生分蘗能力弱的材料i89中相對(duì)表達(dá)量較高，說(shuō)明這些基因可抑制水稻再生分蘗的形成，與其在水稻頭季的研究結(jié)果一致，均能負(fù)向調(diào)節(jié)水稻分蘗的形成。D27基因在頭季拔節(jié)孕穗期和頭季去穗后1 h的相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)出i89高于i21，在頭季去穗后24～72 h的相對(duì)表達(dá)量為i21高于i89，與前人研究結(jié)果不一致，導(dǎo)致無(wú)法判斷其對(duì)再生分蘗的形成是否存在影響，其原因可能是D27基因在無(wú)效分蘗的控制中起作用。造成再生季中基因表達(dá)差異的原因很多，其一，再生季的生長(zhǎng)過(guò)程本身是一個(gè)復(fù)雜過(guò)程，其生長(zhǎng)環(huán)境不同，基因表達(dá)調(diào)控也會(huì)存在很大差異;其二，材料本身的遺傳背景差異很大，造成最終分蘗結(jié)果存在差異;其三，頭季去穗后會(huì)產(chǎn)生基因表達(dá)量無(wú)變化或產(chǎn)生與基因功能不一致的結(jié)果，這可能是植株本身對(duì)外界變化的適應(yīng)能力體現(xiàn)（Cline and Oh，2006）或是再生季的調(diào)控過(guò)程本身的不同所導(dǎo)致，推測(cè)水稻再生季通過(guò)其他途徑調(diào)控再生苗的生長(zhǎng)。

水稻分蘗相關(guān)基因形成一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，且存在組織特異性、生長(zhǎng)時(shí)期特異性及特異性表達(dá)。Tabuchi等（2011）通過(guò)對(duì)稀穗突變體lax1與lax2的研究發(fā)現(xiàn)，LAX2是通過(guò)與LAX1相互作用從而調(diào)控水稻分蘗的形成;Xu等（2012）研究表明TAD1基因可通過(guò)細(xì)胞周期依賴的方式降低MOC1基因的表達(dá)水平從而抑制水稻分蘗的發(fā)生。本研究相關(guān)分析結(jié)果顯示，LAX1基因與LAX2基因的呈極顯著正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)為0.780**），MOC1基因與TAD1基因呈顯著負(fù)相關(guān)（相關(guān)系數(shù)為-0.490*），與前人的研究結(jié)果（Tabuchi et al.，2011;Xu et al.，2012）一致。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，不同分蘗相關(guān)基因間存在復(fù)雜的相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明水稻再生分蘗的形成可能與水稻頭季分蘗一樣，存在著復(fù)雜的分子調(diào)控機(jī)制，且不同基因之間存在相互作用，共同調(diào)控水稻再生季分蘗的形成，但其具體的分子遺傳機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

本研究分析了分蘗相關(guān)基因在再生稻腋芽萌發(fā)期的表達(dá)差異，后續(xù)的研究工作可從以下兩方面開(kāi)展：一方面可利用本課題已有的遺傳多樣性豐富的材料群體進(jìn)行重測(cè)序，鑒定其基因型，并結(jié)合再生稻分蘗能力的表型進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，獲得顯著性SNP位點(diǎn);另一方面，構(gòu)建F2群體，對(duì)其進(jìn)行重測(cè)序，鑒定基因型，結(jié)合表型進(jìn)行QTL分析，從而鑒定再生季分蘗發(fā)生的關(guān)鍵調(diào)控基因。借助分子手段深入研究水稻再生季分蘗的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，對(duì)于揭示再生稻的遺傳機(jī)理具有重要意義。

4 結(jié)論

LAX1、LAX2和MOC1基因高表達(dá)有利于水稻再生季分蘗的形成，D10、HTD1、OsTB1和TAD1基因高表達(dá)會(huì)抑制水稻再生季分蘗的形成。不同分蘗相關(guān)基因間存在相互作用，共同調(diào)控水稻再生季分蘗的形成。

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（責(zé)任編輯 陳 燕）