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    G蛋白偶聯(lián)受體的共同激活機制

    2021-02-07 03:56:26周慶同戴之卓趙素文
    自然雜志 2021年1期
    關(guān)鍵詞:殘基激動劑配體

    周慶同,戴之卓,趙素文?

    ①復旦大學 基礎(chǔ)醫(yī)學院,上海 200032;②上??萍即髮W iHuman研究所,上海 201210;③上??萍即髮W 生命科學與技術(shù)學院,上海 201210

    G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptor,GPCR)是人體內(nèi)最大的一類細胞信號轉(zhuǎn)導受體家族,幾乎參與所有生命活動,負責調(diào)控細胞對光線、氣味、激素、神經(jīng)遞質(zhì)、趨化因子等的應答,對維持生命健康具有非常重要的意義[1-2]。GPCR的重要性使其成為最重要的藥物靶標家族之一,在心血管疾病、代謝性疾病、神經(jīng)相關(guān)性疾病、免疫性疾病和癌癥等重大疾病的藥物研發(fā)中扮演著重要的角色。目前靶向GPCR的藥物約500個,占FDA已批準藥物的34%[3-4]。基于序列相似性,人類的800多個GPCR可被分為4個亞家族,分別是視紫紅質(zhì)受體(A家族)、分泌素受體和黏附受體(B家族)、代謝型谷氨酸受體(C家族)、卷曲受體(F家族)。其中,A家族的受體個數(shù)最多(超過700個),生理功能也最為多樣。目前GPCR研究已獲得10次諾貝爾獎,這也從側(cè)面說明它的重要性[5]。

    GPCR具有保守的結(jié)構(gòu)特征,即7個跨膜螺旋(seven transmembrane helices, 7TMs),這7個螺旋組成的跨膜結(jié)構(gòu)域?qū)⑹荏w分割為胞外N端(N-terminus)、胞內(nèi)C端(C-terminus)、3個胞外環(huán)(extracellular loops)和3個胞內(nèi)環(huán)(intracellular loops)。GPCR的胞外區(qū)域在結(jié)合激動性信號分子(如氣味、激素、神經(jīng)遞質(zhì)、趨化因子)后發(fā)生構(gòu)象變化,進而引發(fā)跨膜螺旋的運動,特別是第6跨膜螺旋靠近胞內(nèi)的那部分(intracellular half of TM6)往外翹起。此時激活受體的胞內(nèi)區(qū)域可招募并結(jié)合下游效應蛋白(如G蛋白、β-arrestin等),這些效應蛋白通過環(huán)腺苷酸(cAMP)信號通路、磷脂酰肌醇信號通路和鈣離子信號通路等調(diào)節(jié)體內(nèi)生理活動。

    GPCR的激活機制是理解其生理功能及相關(guān)疾病成因的必由之路,也是藥物精準研發(fā)的基礎(chǔ),并一直是該領(lǐng)域研究的核心內(nèi)容和前沿熱點[6-7]。對GPCR的激活機制研究多關(guān)注于單個受體或個別位點,所揭示的激活機制缺乏家族層面的系統(tǒng)總結(jié)。目前,伴隨著新的激活現(xiàn)象和特征的發(fā)現(xiàn),人們對受體激活機制的傳統(tǒng)認識正不斷被突破。

    1 GPCR激活機制研究中的方法與創(chuàng)新

    GPCR的激活是指激動劑結(jié)合引發(fā)的下游效應蛋白的招募。GPCR激活的本質(zhì)是胞外側(cè)激動劑結(jié)合和胞內(nèi)側(cè)下游效應蛋白招募的互相耦合、別構(gòu)通信的過程,即受體從非激活態(tài)到激活態(tài)的構(gòu)象轉(zhuǎn)變(圖1)。因此,研究GPCR激活機制不僅需要高精度的GPCR三維結(jié)構(gòu),而且需要精確描述GPCR構(gòu)象變化的分析工具??茖W家經(jīng)過堅持不懈地努力,對GPCR特別是代表性受體(如β2腎上腺素受體、視紫紅質(zhì)受體、A2A腺苷受體)的激活過程或方式的理解日益深入,但對家族層面的共同激活機制卻知之甚少。究其原因,一方面是結(jié)構(gòu)被解析的受體數(shù)量仍然有限,另一方面是缺乏可精確描述構(gòu)象變化的分析工具,顯然僅依靠肉眼觀察或位移測量等傳統(tǒng)方法無法做到準確和系統(tǒng)地研究。以下重點闡述GPCR激活機制研究中的主要方法(表1)與創(chuàng)新點。

    圖1 大麻素受體CB1的構(gòu)象變化(左側(cè)為結(jié)合拮抗劑時處于非激活時的CB1結(jié)構(gòu)[8];右側(cè)為結(jié)合激動劑和G蛋白時處于完全激活態(tài)的CB1結(jié)構(gòu)[9])

    表1 GPCR激活機制的研究方法

    1.1 三維結(jié)構(gòu)測定

    由于GPCR的表達、純化和結(jié)晶都存在極大的困難,GPCR的三維結(jié)構(gòu)一直很難測定。伴隨著GPCR昆蟲表達系統(tǒng)的建立、融合蛋白和熱穩(wěn)定性突變等的引入、高親和力配體的篩選使用、脂立方相(lipidic cubic phase, LCP)膜蛋白結(jié)晶技術(shù)的發(fā)展[10],GPCR的X-射線晶體學研究已取得巨大成功。其中代表性的成就有2007年Brian Kobilka和Raymond Stevens等[11]合作解析的第一個人源GPCR-β2腎上腺素受體(β2adrenergic receptor, β2AR)晶體結(jié)構(gòu),2011年Brian Kobilka等[12]解析的第一個GPCR-G蛋白異源三聚體晶體結(jié)構(gòu)和2015年徐華強等[13]解析的第一個GPCR-βarrestin復合物晶體結(jié)構(gòu)。2017年冷凍電鏡技術(shù)被應用到GPCR的結(jié)構(gòu)解析中[14-15],使GPCR的三維結(jié)構(gòu)測定變得容易。值得欣喜的是,近年來多個GPCR的結(jié)構(gòu)首先被我國科學家解析[8,13,16-26]。

    截至2020年9月,GPCR已有超過80個受體的400余個結(jié)構(gòu)被解析,其中A家族有近60個受體的300多個結(jié)構(gòu)被解析。這些結(jié)構(gòu)揭示出各受體在配體結(jié)合模式、耦合的G蛋白亞型、激活方式等方面具有明顯差異。依據(jù)配體分子的藥理學特性和受體的整體狀態(tài),這些結(jié)構(gòu)可分為3類:①拮抗劑或反向激動劑結(jié)合的非激活態(tài)(inactive state);②同時結(jié)合激動劑和下游效應蛋白(如G蛋白、β-arrestin等)的激活態(tài)(active state);③只結(jié)合激動劑的中間態(tài)(intermediate state)。A家族有多個受體處于非激活態(tài)和激活態(tài)時的結(jié)構(gòu)都已被解析,如牛視紫紅質(zhì)受體(bRho)、β2腎上腺素受體(β2AR)、 M2毒蕈堿型乙酰膽堿受體(M2R)、μ阿片受體(μOR)、 A2A腺苷受體(adenosine A2Areceptor, A2AR)和κ阿片受體(κ-OR),為GPCR家族層面的共同激活機制研究提供了良好起點。

    1.2 核磁共振和分子動力學模擬

    與三維結(jié)構(gòu)測定的穩(wěn)定的靜態(tài)構(gòu)象不同,核磁共振(nuclear magnetic resonance, NMR)能夠在原子分辨率水平研究蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化,填補了晶體或電鏡結(jié)構(gòu)缺失的信息,為理解GPCR動態(tài)構(gòu)象變化和激活機制提供全新的視角。NMR在GPCR應用上的主要挑戰(zhàn)是信號弱且雜,設(shè)計新穎有效的標記位點頗為耗時耗力。由于GPCR分子較大,NMR只能使用15N選擇性標記一兩種出現(xiàn)頻率不高且結(jié)構(gòu)分布較廣的殘基(如Gly和Trp)[27],或者使用含有19F的分子來反應性地標記事先選定的與激活關(guān)系緊密的一兩個Cys位點[28-30]。隨著高場NMR、改進的低溫探針、穩(wěn)定同位素標記及橫向弛豫優(yōu)化譜(transverse relaxation-optimized spectroscopy, TROSY)等技術(shù)的應用,GPCR的NMR研究取得突破性發(fā)展,如鑒定出GPCR存在著多種與功能密切相關(guān)的構(gòu)象狀態(tài),且受激動劑、拮抗劑、別構(gòu)調(diào)節(jié)劑和下游效應蛋白等調(diào)控[27-28,31]。

    借助于不斷優(yōu)化的分子力場和計算機軟硬件,分子動力學模擬已被廣泛應用于生物大分子的結(jié)構(gòu)和動態(tài)特性研究,在GPCR研究中正發(fā)揮著日益重要的作用[32-33]。分子動力學模擬使人們得以了解藥物分子如何進入結(jié)合口袋并激活受體,跨膜信號如何轉(zhuǎn)導,藥物的偏向性信號通路如何實現(xiàn),膽固醇等脂質(zhì)分子如何影響受體激活等重要問題,也為GPCR的藥物設(shè)計和激活機制研究提供重要的研究工具。GPCR嵌膜模擬體系通常含原子數(shù)較多,模擬時間一般在微秒水平,無法覆蓋GPCR的整個激活過程,且不同受體的激活過程也會略有差異,因此通過分子動力學模擬研究家族層面的GPCR激活機制仍有較大困難。

    1.3 殘基接觸

    GPCR激活的本質(zhì)是局部殘基間相互作用的改變誘發(fā)螺旋位置的變化,因此有必要開發(fā)計算方法來描述殘基間相互作用從非激活態(tài)到激活態(tài)的轉(zhuǎn)變,進而比較各受體在激活時的殘基作用改變的異同,最終建立家族層面的共同激活機制。2016年英國劍橋MRC-MLB的Madan Babu課題組,使用殘基接觸(residue contact, RC)來研究GPCR的激活機制。殘基接觸的定義是:若兩殘基有原子對間距離減去其范德華半徑之和小于0.5 ?,即認為兩殘基間存在接觸,否則兩殘基間沒有接觸[34]。對A家族GPCR中同時有激活和非激活態(tài)結(jié)構(gòu)的5個受體10個結(jié)構(gòu)進行殘基接觸分析,研究人員發(fā)現(xiàn)有6組殘基對在這5個受體激活過程中具有一致的殘基接觸變化,即同時消失或形成。其中,2組殘基對(3×46—7×53和5×55—6×41)在激活后新形成接觸,余下的4組殘基對(1×53—7×53,3×46—6×37,7×53—8×50和7×54—8×51)則在激活后接觸消失。這里殘基編號采用GPCRdb命名法[35]:將每個α螺旋上序列最保守的殘基定為×50,其他殘基依據(jù)與×50在序列上的相對位置依次命名,如3×49即為第3個α螺旋上、在序列上位于最保守位點3×50的前一位,而3×51則為第3個α螺旋上、在序列上位于最保守位點3×50的后一位。結(jié)合A家族其他結(jié)構(gòu)的驗證,他們發(fā)現(xiàn)靠近G蛋白結(jié)合區(qū)域的兩組殘基對(3×46—6×37和3×46—7×53)具有家族普遍性,即A家族GPCR激活時都有這樣的構(gòu)象接觸變化,因此A家族GPCR被認為具有多樣化的激活通路,且這些激活通路僅收斂于G蛋白結(jié)合區(qū)域。這一工作為GPCR激活機制研究提供了全新的計算思路,但其揭示的共同激活機制卻遺漏了一系列保守的特征基序(motif,序列中局部的保守區(qū)域),如CWxP[27,36]、PIF[37-38]、DRY[39-40]、鈉離子結(jié)合口袋等[27,41],也無法解釋TM6末端因何翹起,因此GPCR的共同激活機制仍有待于完善。

    受到配體-殘基相互作用定量描述的啟發(fā)[42],我們提出殘基接觸打分(residue-residue contact score, RRCS)用以精確描述殘基對間的接觸強度[43],將三維的、復雜的結(jié)構(gòu)信息轉(zhuǎn)化為二維的、量化的殘基接觸打分,同時殘基接觸分差(ΔRRCS = RRCSactive-RRCSinactive)可精確描述受體激活過程中的殘基構(gòu)象變化。殘基接觸打分完全從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)本身出發(fā),不依賴于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)比對(alignment),且可將整體和局部、顯著和微小的構(gòu)象變化系統(tǒng)地劃分為開關(guān)(switching)和重排(repacking)、螺旋間(inter-helical) 和螺旋內(nèi)(intra-helical)等兩個層面的4種類型。為遴選出A家族GPCR激活時都具有的保守的構(gòu)象變化,我們首先分析6個受體(bRho、β2AR、M2R、μOR、A2AR和κ-OR)在激活過程中的殘基接觸分差。一方面,檢查這些殘基對在6個受體中是否有統(tǒng)一的構(gòu)象變化,即殘基接觸分差皆為正或負;另一方面,研究這些殘基對的接觸打分,在家族層面的非激活與激活態(tài)間是否存在顯著性差異(142個非激活態(tài)結(jié)構(gòu)和27個激活態(tài)結(jié)構(gòu))。我們最終發(fā)現(xiàn)在A家族GPCR激活時,有34組殘基對具有保守的構(gòu)象變化。

    2 GPCR的共同激活機制

    2.1 A家族GPCR的共同激活機制

    基于家族保守的、激活時具有統(tǒng)一構(gòu)象變化的34組殘基對,我們構(gòu)建起A家族GPCR的共同激活通路(圖2)。這34組殘基對由35個殘基構(gòu)成,有機連接和整合了人們熟知的、序列保守但空間疏離的特征基序,如CWxP[27,36]、PIF[37-38]、DRY[39-40]、鈉離子結(jié)合口袋等[27,41]和NPxxY[12,34]等,在殘基水平上回答GPCR如何被激活,TM6為什么會翹起,各基序如何協(xié)同作用實現(xiàn)GPCR的跨膜信號轉(zhuǎn)導。需要指出的是,這一通路是A家族不同受體在不同激動劑或不同下游效應蛋白時的共同部分,每個受體仍然具有獨特的、受體/配體/效應蛋白特殊的激活通路。

    依據(jù)這35個殘基的空間位置和功能,我們將GPCR的共同激活通路由胞外到胞內(nèi)共劃分為4層(圖2(a)):①信號啟動層;②疏水鎖層;③微型開關(guān)傳遞層;④胞內(nèi)效應蛋白結(jié)合層。激動劑的結(jié)合誘發(fā)配體結(jié)合口袋發(fā)生構(gòu)象變化,最終引起位于胞內(nèi)口袋底部的特征基序CWxP、PIF發(fā)生結(jié)構(gòu)重排,使得鈉離子結(jié)合口袋坍塌,最終實現(xiàn)信號啟動。第二層疏水鎖層殘基在接收到第一層的啟動信號后,幾個疏水殘基構(gòu)成的疏水鎖(6×41—3×43 和 6×40—3×43)被打開,分別通過TM6和TM7傳遞激活信號。第三層由2個微型開關(guān)殘基(6×37和7×53)控制,在接受到疏水鎖層的信號后發(fā)生劇烈的構(gòu)象變化,形成或破壞了一系列的殘基接觸使得信號得以放大。第四層則將上述構(gòu)象變化通過結(jié)合胞內(nèi)效應蛋白傳遞到胞內(nèi),最終通過第二信使cAMP、IP3和Ca2+等實現(xiàn)信號轉(zhuǎn)導。綜上,4層殘基互相配合,通過螺旋間/螺旋內(nèi)的殘基開關(guān)或重排實現(xiàn)GPCR的跨膜信號轉(zhuǎn)導。

    為表征跨膜螺旋的整體構(gòu)象變化,我們選擇TM3和TM6間的所有4組殘基對來計算2個螺旋間的接觸分,即RRCSTM3-TM6,類似地還有RRCSTM3-TM7和RRCSTM5-TM6。在將142個非激活態(tài)結(jié)構(gòu)和27個激活態(tài)結(jié)構(gòu)投影到由RRCSTM3-TM6和RRCSTM3-TM7組成的二維空間時,我們發(fā)現(xiàn)GPCR的激活態(tài)和非激活態(tài)具有迥然不同的結(jié)構(gòu)特征(圖2(b))。激活態(tài)的RRCSTM3-TM6為零,而RRCSTM3-TM7通常大于5;非激活態(tài)的RRCSTM3-TM7通常接近或等于零,而RRCSTM3-TM6分布廣泛但通常大于零。這充分說明GPCR激活時具有共同的整體構(gòu)象變化,即激動劑的結(jié)合觸發(fā)TM6胞內(nèi)段往外運動從而遠離TM3,這使得TM7可以往內(nèi)運動從而靠近TM3,最終在受體的胞內(nèi)側(cè)形成空隙以結(jié)合G蛋白等下游效應蛋白。值得注意的是,此前研究者在使用肉眼觀察受體結(jié)構(gòu)來判斷激活狀態(tài)時,常過分關(guān)注TM6翹起與否,圖2(b)告訴我們非激活態(tài)最保守的特征其實是TM3與TM7之間的遠離,而在激活態(tài)中,TM3與TM7的殘基之間具有廣泛的接觸。因此,我們認為,TM7的運動盡管不如TM6劇烈,同樣是GPCR激活所必需。

    從序列角度看,A家族GPCR共同激活通路上的35個殘基具有較強的序列保守性,與之對應的是配體結(jié)合區(qū)域和G蛋白耦合區(qū)域的殘基組成非常多樣。我們認為,GPCR共同激活通路中的殘基構(gòu)成一個負責激活的模塊,解放出配體結(jié)合區(qū)域和G蛋白耦合區(qū)域來快速演化。這或許是GPCR可以使用一個簡單的折疊模式來實現(xiàn)如此多樣化功能的一個原因。

    圖2 A家族GPCR的共同激活機制[43]:(a)殘基水平的共同激活通路,由在激活時具有保守構(gòu)象變化的34組殘基對構(gòu)成;(b)激活時跨膜螺旋的構(gòu)象變化

    2.2 激活機制指導的組成性突變設(shè)計

    GPCR的激活需要共同激活通路上各殘基的參與,因此理論上可對這些關(guān)鍵殘基進行干擾以實現(xiàn)激活信號的關(guān)閉或開啟。為此,我們對共同激活通路上的殘基進行理性突變設(shè)計以便將受體鎖定激活構(gòu)象或非激活構(gòu)象,這樣受體將處于組成性激活(不需要激動劑即可產(chǎn)生激活信號)或失活(即使有激動劑也不產(chǎn)生激活信號)。A2A腺苷受體是研究較多的A家族GPCR,它耦合激活型G蛋白(G),在結(jié)合激動劑后激活cAMP通路使得胞內(nèi)cAMP含量增加。我們以A2A腺苷受體為例進行理性設(shè)計,最終證實15個設(shè)計的組成性激活突變中的6個、20個設(shè)計的失活突變中的15個都被cAMP功能實驗證實,且它們的配體結(jié)合能力基本不受突變影響,這充分說明這些位點在GPCR激活過程中扮演著重要角色。此外,我們還對耦合抑制型G蛋白(Gi)的5-羥色胺受體1B(5-HT1B)和耦合激活型G蛋白的5-羥色胺受體7(5-HT7)進行基于GPCR共同激活通路的突變設(shè)計,實驗證實這些突變體具有類似的組成性激活或失活效應。

    2.3 激活機制與致病突變

    GPCR的正常運作對于維持人體健康至關(guān)重要。GPCR的某些氨基酸突變可能會使GPCR功能紊亂并導致尿崩癥、甲狀腺功能亢進、性腺功能減退癥、糖皮質(zhì)激素缺乏癥等遺傳學疾病[44]。為了研究GPCR信號轉(zhuǎn)導與疾病的關(guān)聯(lián),我們從數(shù)據(jù)庫和文獻上共收集人類GPCR的435個疾病相關(guān)突變,發(fā)現(xiàn)其中有25%的突變發(fā)生在GPCR的共同激活通路上,這一比例顯著高于配體結(jié)合區(qū)域(20%)或G蛋白結(jié)合區(qū)域(7%)。從突變發(fā)生率看,致病突變明顯富集在共同激活通路上,比配體結(jié)合區(qū)域高2.5倍,比G蛋白結(jié)合區(qū)域高3.5倍。實際上,GPCR的共同激活通路也為我們理解致病突變機制提供思路,如血管加壓素V2受體(vasopressin V2 receptor,V2R)的I1303×43N突變會使得受體成為組成型激活,導致腎原性抗利尿激素分泌失調(diào)綜合征(N-SIAD)[45]。I1303×43F則使受體失活,產(chǎn)生腎原性尿崩癥(NDI)[46]。這可能是由于I130N/F會削弱/增加疏水鎖的穩(wěn)定性,削弱/增強TM3與TM6間的作用,使受體的TM6更易/難翹起,導致受體處于激活/失活狀態(tài),再經(jīng)過下游信號通路的放大和轉(zhuǎn)導,最終導致疾病的產(chǎn)生。

    3 展望

    GPCR激活機制是理解GPCR功能和理性藥物設(shè)計的鑰匙。伴隨著過去20年GPCR結(jié)構(gòu)解析的巨大發(fā)展,以及單分子、單殘基甚至單原子分析技術(shù)的不斷進步,我們對GPCR的認識日益深入,對配體激活受體、受體耦合G蛋白等關(guān)鍵問題也有了更豐富的認知,但距離全面理解GPCR的激活機制(家族共性和受體個性)仍有相當距離。從藥物研發(fā)角度看,如何設(shè)計藥物以精細調(diào)控GPCR的信號轉(zhuǎn)導輸出,如偏向性信號通路、亞型選擇性、藥物效率等重大問題,都繞不開GPCR的激活機制??傊?,GPCR的激活機制研究內(nèi)涵深刻,任重而道遠,需要科研工作者們的不懈努力。

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