乙醇浸提法提取紅葉李中總黃酮工藝優(yōu)化

程時勁，余 渤，毛 博，許星星，李安迪，劉曉霞

（武漢東湖學院生命科學與化學學院，武漢 430212）

紅葉李又名紫葉李，屬于薔薇科李，是一種落葉小喬木，樹體的高度最高達8 m 左右［1］。研究表明，紅葉李中含有豐富的黃酮成分［2-4］，具有重要的研究與開發(fā)價值。黃酮類化合物常作為一些中草藥的有效成分而被廣泛研究，其中作為中藥的活性成分大多存在于植物的葉片和花瓣中［5-7］。黃酮類化合物具有十分廣泛的應用［8，9］，近年來黃酮類化合物主要應用在醫(yī)藥和化妝品方面，其中在醫(yī)藥方面有治療腫瘤用藥、消炎藥、止疼藥、降低血糖用藥、胃藥和護肝藥等［10］；在護膚品方面主要應用這類化合物延緩老化和預防氧化的功能而開發(fā)高檔護膚品類［11］。本研究對紅葉李中總黃酮的提取工藝進行了優(yōu)化，通過改變提取溶劑的類別，采用不同濃度的提取溶劑，改變料液比，改變提取溫度和提取時間，分別在不同條件下測定總黃酮的提取率，得出最佳優(yōu)化工藝條件。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、石油醚、無水乙醇、丙酮、乙酸乙酯、蘆丁標準品（UV≥98%，上海金穗生物科技有限公司），以上試劑均為分析純。

101-2AB 型電熱鼓風干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司；天津市泰斯特儀器有限公司生產的FW135 型中草藥粉碎機；UV-4802H 型紫外可見分光光度計，尤尼柯（上海）儀器有限公司。

1.2 試驗方法

將采摘好的紅葉李葉片用自來水漂洗3 次，洗去表面的綠色蟲卵及灰塵等，再用去離子水浸泡漂洗3 次，將洗凈的葉片鋪于潔凈的紗布上置于烘箱中50℃10 h 烘至恒重，干燥后的葉片保存在密封袋中。用中草藥粉碎機將葉片粉碎并過篩，將粉末保存在密封袋中備用。

分別稱取5 份0.5 g 的紅葉李粉末，按順序倒入已編號的5 個250 mL 的燒杯中，往各個燒杯中分別加入去離子水、丙酮、石油醚、70%乙醇、乙酸乙酯30 mL。將所有樣品置于60 ℃恒溫水浴箱中浸提30 min。取出燒杯后過濾，用50 mL 的容量瓶收集濾液后70%乙醇定容得粗提液，將粗提液稀釋10 倍得樣品液。再取一個50 mL 容量瓶加入亞硝酸鈉溶液2 mL，搖勻后靜置6 min；再依次加入10%A（lNO3）3溶液2 mL 和4%NaOH 溶液20 mL，用70%乙醇將其定容后搖勻放置15 min，得到參比液。在最大吸收波長處測量吸光度，然后計算出總黃酮的提取率。

按照上述方法，改變提取溶劑乙醇的濃度分別為30%、40%、50%、60%、70%、80%；改變料液比分別為 1∶15、1∶30、1∶45、1∶60（g∶mL）；改變提取溫度分別為 40、50、60、70、80 ℃；改變浸提時間分別為10、30、50、70、90 min，再經過同樣的處理和測試。

2 結果與分析

2.1 最大吸收波長和工作曲線

蘆丁標準品與紅葉李樣品的最大吸收波峰所對應的波長相同，均為508 nm，因此確定測量的紅葉李樣品液吸光度的最大吸收波長為508 nm，并將其作為紅葉李總黃酮含量的測定波長，如圖1 所示。用紫外可見分光光度計在最大吸收波長處測定標準溶液的吸光度，繪制標準溶液的工作曲線，如圖2 所示，工作曲線回歸方程為Y=0.011 28X+0.034 77，R2=0.999 34。結果表明，標準溶液濃度在 8～48 mg∕mL范圍內，紅葉李的吸光度與濃度呈良好的線性關系。

圖1 蘆丁標準品紫外可見光譜

圖2 標準溶液的工作曲線

2.2 總黃酮提取率的計算

將測出的樣品溶液吸光度代入標準回歸方程中算出樣品溶液中總黃酮的濃度，然后根據(jù)稀釋的倍數(shù)反算出提取的總黃酮質量，與所取的紅葉李粉末質量相比即可得出提取率，其計算公式為：Q=（C×V×10∕m）×100%

式中，Q為總黃酮提取率（%）；m為紅葉李葉片粉末質量（g）；C為總黃酮濃度（mg∕mL）；V為粗提液稀釋后的體積（mL）。

2.3 提取溶劑及其濃度優(yōu)化

選用不同提取溶劑將紅葉李粉末在60 ℃水浴鍋中浸提30 min，不同溶劑提取后紅葉李樣品溶液的提取率如圖3 所示。由圖3 可知，紅葉李總黃酮提取率高低依次為70%乙醇、丙酮、去離子水、石油醚、乙酸乙酯，所以選擇70%乙醇為提取溶劑。

圖3 不同提取溶劑下總黃酮提取率

選用不同濃度的乙醇將紅葉李粉末置于60 ℃恒溫水浴箱中浸提30 min，經不同濃度乙醇溶液提取后紅葉李樣品溶液的提取率如圖4 所示。由圖4可知，當乙醇濃度小于70%時，紅葉李中總黃酮的提取率隨著乙醇濃度增大而上升，當乙醇濃度超過70%時提取率反而下降，所以最佳的乙醇提取濃度為70%。

2.4 料液比的優(yōu)化

圖4 提取率隨乙醇濃度變化情況

選用幾種不同料液比的70%乙醇溶液與紅葉李粉末放入60℃的恒溫水浴箱中浸提30 min，料液比不同，總黃酮的提取率也不同，提取率與料液比的關系曲線見圖5。由圖5 可知，紅葉李中總黃酮的提取率隨著溶劑量的增加而呈上升趨勢，在料液比小于1∶45 時上升明顯，而在料液比超過1∶45 時上升幅度趨于平緩。考慮到溶劑量再繼續(xù)增大會消耗更多的提取試液和提取時間，提取效率增長甚微，所以選擇1∶45 為提取紅葉李中總黃酮的最佳料液比。

圖5 總黃酮提取率與料液比的關系曲線

2.5 提取溫度的優(yōu)化

將料液比為1∶45 的70%乙醇溶液浸提的紅葉李粉末置于溫度不同的恒溫水浴箱中浸提30 min，改變提取溫度，樣品的總黃酮提取率也隨之發(fā)生變化，提取率與溫度之間的關系見圖6。由圖6 可知，40～70 ℃，總黃酮提取率隨著溫度的增加而上升；70～80 ℃，提取率隨著溫度的增加而下降，所以選擇70 ℃為乙醇浸提法提取紅葉李中總黃酮的最佳提取溫度。

圖6 總黃酮提取率隨溫度上升的變化趨勢

2.6 提取時間的優(yōu)化

選用70%的乙醇溶液，料液比為1∶45，在溫度為70 ℃的恒溫水浴箱中浸提不同時間后紅葉李樣品溶液的總黃酮提取率如圖7 所示。由圖7 可知，乙醇浸提法提取紅葉李中總黃酮的提取率隨提取時間的增加而上升，但在提取時間超過70 min 之后提取率上升趨勢趨于平緩，故為了提高試驗效率，選擇70 min 為最佳提取時間，此時提取率為8.24%。

圖7 總黃酮提取率隨提取時間變化情況

3 小結

本試驗以新鮮紅葉李葉片低溫烘干研磨后的粉末為原料，研究探討了紅葉李葉片總黃酮提取工藝的優(yōu)化條件。采取了乙醇浸取法提取紅葉李中的總黃酮，通過改變提取溶劑的種類、采用不同提取溶劑的濃度，改變料液比，在不同的提取溫度和提取時間下測定提取率，最終確定了紅葉李總黃酮提取的最佳工藝條件為：乙醇濃度為70%，料液比為1∶45，在70℃的恒溫水浴箱中浸提70 min，此時紅葉李中的總黃酮提取率最高，可達8.24%。