砷脅迫對濕地植物香蒲生長的影響及其耐受性分析

任 偉，楊桂英，劉云根,3，劉 雪，李夢瑩，趙 蓉，王 妍,3**

(1. 西南林業(yè)大學(xué) 生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，云南 昆明 650224；2. 長江三峽技術(shù)經(jīng)濟發(fā)展有限公司 北京 100038；3. 西南林業(yè)大學(xué) 水科學(xué)與工程中心，云南 昆明 650224)

砷和砷的化合物是具有危害性的環(huán)境污染物，嚴(yán)重威脅著人體健康[1]. 近年來，砷污染嚴(yán)重威脅著我國湖泊、河流和水庫等地表水環(huán)境安全[2]. 鑒于湖泊濕地面域遼闊、水文條件復(fù)雜，采用物理、化學(xué)方法進行大面積治理尚難以實現(xiàn)[3]，且易帶來其他次生環(huán)境風(fēng)險，使得植物修復(fù)成為目前備受關(guān)注的生態(tài)治理方法. 自Ma等[4]發(fā)現(xiàn)蜈蚣草（Pteris vittata）能超富集砷以來，已發(fā)現(xiàn)砷超富集植物20多種（包括變種）[5]，如大葉井口邊草（Pteris Cretica）[6]、傅氏鳳尾厥（Pteris fauriei）及裸子蕨科的粉葉厥（Pityrogramma calomelanos）[7]等. 由于超富集植物普遍存在生長緩慢、生物量低、經(jīng)濟效益低等缺陷，導(dǎo)致重金屬遷移總量相對不高[8]，限制了其在植物修復(fù)工程中的應(yīng)用推廣. 在自然環(huán)境中存在一些對重金屬耐性較強的植物，盡管其體內(nèi)重金屬含量不能達到超積累植物的量，但其重金屬遷移總量仍較可觀[9]，如王愛云等[10]發(fā)現(xiàn)白花三葉草和高羊茅在治理鉻污染土壤有一定的潛在應(yīng)用價值，董萌等[4]發(fā)現(xiàn)蔞蒿對鎘富集能力較強，這些植物對重金屬污染的修復(fù)作用不可忽視.

砷的超富集植物多為陸生植物，水生植物中砷超富集種鮮有報道. 香蒲是多年生水生或沼生草本植物，多生于湖泊、溝渠、沼澤及河流緩流帶，被公認(rèn)為濕地植物中的優(yōu)勢品種[11-12]，對環(huán)境脅迫耐性較強，但目前關(guān)于香蒲對砷脅迫的響應(yīng)機制及耐受性還鮮見報道. 本研究采用室內(nèi)模擬的方式，探析香蒲在不同濃度砷脅迫下的生長特性、生理反應(yīng)以及其對砷的耐受性，以期為砷污染的河湖濱濕地保護和生態(tài)恢復(fù)提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試植物與土壤供試植株取自昆明市海云綠化苗木有限公司苗木基地的當(dāng)年生香蒲萌發(fā)苗，篩選高度一致（株高約35 cm），長勢良好的植株作為供試植物. 供試土壤取自昆明市跑馬山海拔1 900 m處的低洼地段，將土壤樣品采回后自然陰干、錘碎、磨細后過4 mm篩備用，基本性質(zhì)如表1.

1.2 試驗設(shè)置本研究模擬濕地環(huán)境，通過添加Na2HAsO4·7H2O的方式設(shè)置土壤中As（以As5+計）質(zhì)量比分別為0（CK）、50、100、150、200、600 mg·kg?16個處理，每個處理3個重復(fù)，具體方法如下.

表 1 供試土壤的基本性質(zhì)Tab. 1 Physical and chemical properties of the tested soil

（1）使用黑色聚乙烯塑膠桶（高 32 cm，口徑48 cm，底徑 32 cm）作為濕地模擬裝置，每桶裝入10 kg干土和10 L純凈水，并按不同試驗處理加入Na2HAsO4·7H2O，使土壤成粘稠狀，充分混勻，自然放置平衡一周后用于試驗.

（2）在濕地模擬裝置中等間距栽種6株香蒲幼苗，并統(tǒng)一添加等量基肥（m（N）∶m（P2O5）∶m（K2O）為 16∶16∶16），于 45 d 后進行取樣. 期間保持一致的水肥管理，土壤始終處于淹水狀態(tài). 選取植株第2～3層葉片（從上至下），每個處理采集6片葉磨碎混勻，進行各項生理指標(biāo)的測定. 將收獲的植株用 0.01 mol·L?1乙二胺四乙酸二鈉（DETA）與蒸餾水洗凈，用濾紙吸去外部水分，測定株高、根長、側(cè)芽數(shù). 分別采集植株地上部（新葉+枯葉）和地下部樣品，在 105 ℃ 下殺青 30 min，70 ℃ 烘干至恒重，粉碎后用于測定砷質(zhì)量比w（As）.

1.3 樣品分析與計算

1.3.1 植物生理指標(biāo)測定 利用 SPAD-502 便攜式葉綠素測定儀測定相對葉綠素含量（CCI）；丙二醛（MDA）、還原型谷胱甘肽（GSH）含量采用北京索萊寶科技有限公司的試劑盒及Multiskan FC酶標(biāo)儀測定，所有指標(biāo)測定為3次重復(fù).

1.3.2 樣品中w（As）的測定 植物、土壤樣品采用 HNO3-HClO4-H2SO4消解的方法（GB/T 5009.11—1996）. 所有樣品測定過程中均設(shè)置空白對照和重復(fù)，使用雙道氫化物原子熒光光度計（AFS-810，北京吉天）測定其中w（As）.

1.3.3 相關(guān)計算方法

（1）香蒲對土壤中砷的富集與轉(zhuǎn)運系數(shù)，其計算公式為：

式中，wo為香蒲地上部砷質(zhì)量比（mg·kg?1），wr為香蒲地下部砷質(zhì)量比（mg·kg?1），wi為香蒲不同部位砷質(zhì)量比（mg·kg?1），ws為試驗土壤中砷質(zhì)量比（mg·kg?1）；香蒲不同部位包括地上部與地下部，其中地上部包括枯葉和新葉.

（2）香蒲對砷脅迫的耐受性綜合評價方法，首先參考Metwally等[13]方法，將砷脅迫下香蒲各性狀指標(biāo)統(tǒng)一以耐性指數(shù)表示，耐性指數(shù)計算公式為：

式中，L為各處理組香蒲性狀指標(biāo)參數(shù)，Lck為對照組香蒲性狀指標(biāo)參數(shù).

對各單項指標(biāo)進行主成分分析，將原來多個彼此相關(guān)的指標(biāo)轉(zhuǎn)換成新的少數(shù)幾個彼此獨立的綜合指標(biāo)，主成分分析采用SPSS21. 0進行. 建立綜合指標(biāo)Zj方程[14]，其計算公式為：

式中，Zj表示某w(As)第j個綜合指標(biāo)值，bij表示第j個綜合指標(biāo)第i個指標(biāo)的載荷，xi表示w(As)第i個指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)化后的耐性指數(shù).

采用隸屬函數(shù)法對不同土壤w(As)脅迫下的香蒲進行綜合評價，利用公式（5）計算耐砷綜合評價D值，其計算公式為：

1.4 數(shù)據(jù)分析采用 Microsoft Office Excel 2010處理生長及生理指標(biāo)測定值；應(yīng)用SPSS 21. 0對數(shù)據(jù)進行相關(guān)分析（Pearson）和P=0.05水平下的方差分析（ANOVA）；統(tǒng)計數(shù)據(jù)采用Origin 2018軟件繪圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 砷脅迫對香蒲生長狀況的影響由表2可知，隨著供試土壤中w(As)的增加，香蒲的株高和根長在 0～ 150 mg·kg?1呈 上 升 趨 勢 ， 在 150 mg·kg?1附近達到峰值，分別達到106.57、38.42 cm，且與其它處理間差異顯著（P＜0.05）. 大于150 mg·kg?1的砷脅迫下呈下降趨勢，隨著供試土壤中w(As)的增加，香蒲的地上部和地下部干重可能由于植株的個體差異存在波動，但整體都呈現(xiàn)出先升后降趨勢，且150 mg·kg?1處理與其它處理間差異顯著（P＜0.05）.土壤中w(As)達到 200 mg·kg?1時香蒲植株矮小，側(cè)芽個數(shù)減少，根部生長受到抑制，須根明顯減少，出現(xiàn)斷根現(xiàn)象，枯葉隨外源砷含量增加而增加，表現(xiàn)為強毒性.

表 2 砷脅迫對香蒲生長特性的影響Tab. 2 Effect of arsenic stress on the growth of Typha angustifolia

2.2 砷脅迫對香蒲生理特征的影響葉綠素含量是表現(xiàn)植物光合作用強弱的一個重要生理指標(biāo)，直接標(biāo)志著植物生長的能力[15]. 從圖1（a）可以看出，隨著土壤中w(As)的增加香蒲葉尖相對綠葉素含量亦呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢. 葉尖、葉中的相對葉綠素含量均在 150 mg·kg?1砷處理下達到最高值，且與其它處理差異顯著（P＜0.05）.

從圖1（b）可以看出，隨著供試土壤中w(As)增加，香蒲地上部與地下部MDA含量均表現(xiàn)出先升后降的趨勢，且地上部MDA含量一直明顯高于地下部. 當(dāng)土壤中w(As)為 100 mg·kg?1時地下部 MDA含量最高，而地上部MDA含量在土壤中w(As)為200 mg·kg?1砷處理下最高. 地上與地下部 MDA 含量分別在土壤中w(As)達到 200、600 mg·kg?1時低于CK. 生物體的防御體系中，除了抗氧化酶參與酶性抗氧化系統(tǒng)外，還有谷胱甘肽（GSH）等非酶類抗氧化物質(zhì)[16]. 由圖 1（c）可知，隨著供試土壤中w(As)增加，植物體內(nèi)GSH 含量先升后降，地上部高于地下部；在土壤中w(As)大于 200 mg·kg?1砷脅迫下，GSH 含量開始下降. 如表 3 所示，通過 CCI、MDA含量和GSH含量相關(guān)性分析，表明葉尖相對葉綠素與地上部MDA含量之間呈顯著負相關(guān)，地下部GSH含量與MDA含量之間呈極顯著正相關(guān).

2.3 砷在香蒲體內(nèi)的積累與分布由圖 2（a）可見，砷脅迫下香蒲體內(nèi)不同部位砷的積累存在差異. 香蒲地上部與地下部砷含量隨著土壤中w(As)的升高而不斷增加，且各處理間差異顯著（P＜0.05）. 當(dāng)砷質(zhì)量比為 600 mg·kg?1時，地上與地下部砷的質(zhì)量比均達到最大，分別為 187.75、465.16 mg·kg?1.富集系數(shù)反映植物體對重金屬的富集能力，而轉(zhuǎn)運系數(shù)則反映重金屬在植物體內(nèi)的運輸和分配情況[10].香蒲地上部、地下部對砷富集系數(shù)均值分別為0.21、0.63（表4），地下部富集系數(shù)是地上部2.5～4.5倍，植物地下部對砷的富集能力高于地上部. 隨著土壤中w(As)的增加，香蒲的轉(zhuǎn)運系數(shù)呈波動式上升，轉(zhuǎn)運系數(shù)平均值為 0.26＜1，在 600 mg·kg?1砷處理下達到峰值（0.40）. 如圖 2（b）所示，從植物地上部的新葉與老葉分析可知，香蒲新葉與枯葉砷含量隨著土壤中w(As)的增加，總體呈增加趨勢，且各處理間差異顯著（P＜0.05）. 由表 4 可知，枯葉與新葉對砷的富集系數(shù)均值分別為0.60、0.05，枯葉富集系數(shù)達新葉38.7～4.1倍，兩者對砷的富集水平差異較大.

圖 1 砷脅迫對香蒲 CCI，MDA 含量，GSH 含量的影響Fig. 1 Effect of arsenic stress on relative chlorophyll content,MDA and GSH contents in Typha angustifolia

2.4 香蒲對砷脅迫的耐受性分析按照公式（3）進行耐性指數(shù)計算得出表5，進一步分析香蒲對砷的耐受性. 側(cè)芽數(shù)在土壤中w(As)為 50 mg·kg?1處理下耐性指數(shù)最大，比對照增加了77.78%；但是香蒲株高、根長、地上部干重、地下部干重、葉尖CCI和葉中 CCI，在土壤中w(As)為 150 mg·kg?1砷脅迫下達到最大；而香蒲MDA與GSH耐受性指數(shù)大小卻呈現(xiàn)波動式變化. 綜合以上結(jié)果，不同土壤w(As)對各指標(biāo)的影響不同，用不同單項指標(biāo)的耐性指數(shù)來評價香蒲砷的耐受性，評價結(jié)果亦會不同. 這種現(xiàn)象說明香蒲對As的耐受性是一個復(fù)雜的綜合性狀，單個指標(biāo)難以真正反映出植物砷的耐性，采用多指標(biāo)綜合評價，才更具有客觀性和科學(xué)性. 如表6所示，研究采用主成分分析，將原11個單項指標(biāo)轉(zhuǎn)換為5個新的綜合指標(biāo)Z1、Z2、Z3、Z4和Z5，其積累貢獻效率達到了91.89%，反映11個指標(biāo)的信息.

利用隸屬函數(shù)加權(quán)平均法，依據(jù)Z1～Z5綜合指標(biāo)的方差貢獻率，根據(jù)公式（3）計算香蒲耐受性的綜合評價值D值，D值為[0～1]閉區(qū)間的純數(shù)，其反映了香蒲的綜合耐受能力的大小，數(shù)值越大，表明耐As的能力越強，并根據(jù)D值對香蒲的砷耐受性排序. 參考CK的綜合評價D值對其進行分級，如表 7 所示. 在土壤w(As)為 150 mg·kg?1時香蒲對砷的耐性綜合評價D值大于0.5，對砷的耐受程度最高；100、50、200 mg·kg?1的D值在 0.35～0.5之間，香蒲表現(xiàn)出較強的耐受性；只有 600 mg·kg?1砷處理低于CK的D值0.35，對砷的耐受性表現(xiàn)為較弱的程度. 整體而言土壤中w（As）為0 ～200 mg·kg?1時，砷對香蒲生長具有促進作用，隨著砷質(zhì)量比的升高，砷對香蒲生長出現(xiàn)抑制作用.

3 討論

砷不是植物的必需元素，但有研究發(fā)現(xiàn)，微量砷可以刺激植物的生長發(fā)育[17]，合理的施用Ca3（AsO4）2會使小麥、大豆等得到有效增產(chǎn)[18]. 過量的砷在土壤中可危害植物的生長，引起植物在生物性狀等方面的異常[19]. 本試驗表明，隨著土壤中w(As)增加，香蒲株高、根長、植株干重、側(cè)芽數(shù)等指標(biāo)均表現(xiàn)出先增后減的趨勢（表2），砷脅迫對香蒲生長起到低促高抑的作用，這與砷超富集植物蜈蚣草相類似[4-6]. 研究表明，低濃度重金屬會促進香蒲葉綠素形成，而高濃度則抑制其葉綠素的形成[15].本研究也表明在高濃度砷脅迫條件下，香蒲對光能的利用效率降低. 香蒲葉尖 CCI低于葉中（圖 2（a）），可能由于砷被葉片吸收后多富集于維管束鞘和柵欄組織[20]，通過葉脈轉(zhuǎn)移至葉尖，促使葉綠素酶活性增強，增加葉綠素分解[21]，光合作用下降，進而促使葉尖葉色變淡甚至出現(xiàn)黃化現(xiàn)象. MDA是反應(yīng)組織細胞膜損傷程度的重要指標(biāo)，脅迫環(huán)境中，植物細胞原生質(zhì)膜中的活性物質(zhì)可與不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化作用產(chǎn)生的丙二醛交聯(lián)[22]，形成脂褐素，進而促使質(zhì)膜系統(tǒng)受到傷害，干擾細胞的正?；顒? 在同一時期MDA積累量低，表示植物抵逆性強[23]；MDA積累量高，反之亦然. 本研究表明，一定濃度范圍內(nèi)香蒲MDA含量均隨土壤中w(As)增加而表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，但在高濃度砷脅迫下，MDA 含量卻低于 CK（圖 2（b）），表明高砷脅迫下細胞膜脂過氧化作用加劇，胞膜性系統(tǒng)難以維持平衡，香蒲地下先于地上部被打破平衡，可能是由于植物地下部最先受砷脅迫導(dǎo)致. GSH在維持機體氧化狀態(tài)的平衡中起重要作用，是組織細胞抗氧化損傷的主要抗氧化物質(zhì)，能夠敏感并綜合反應(yīng)組織的氧化應(yīng)激能力及受損程度. 本試驗說明，適量砷脅迫下促使香蒲自我保護機制的啟動，低砷刺激下GSH被誘導(dǎo)，促使GSH含量升高以減輕對植株的損傷，大于 200 mg·kg?1高砷脅迫下，形成過量的誘導(dǎo)已經(jīng)超出葉片GSH的清除能力，并造成了葉片中抗氧化酶系統(tǒng)的紊亂[24]，致使GSH含量開始下降，產(chǎn)生大量活性氧自由基植物細胞，使平衡遭到破壞，產(chǎn)生的活性氧自由基開始抑制抗氧化酶的活性，表現(xiàn)出酶活性下降[25]. 砷脅迫下香蒲體內(nèi)地上部GSH含量高于地下部，亦說明砷對植物生長的影響機制復(fù)雜，砷脅迫對植物的不同組織器官具有不同的生物學(xué)效應(yīng). 嚴(yán)明理等[26]對鈾對油菜幼苗生長和生理特征的影響研究發(fā)現(xiàn)植物組織

中MDA含量與綠素含量呈顯著負相關(guān). 在本研究中葉尖相對葉綠素含量與地上部MDA含量之間同樣呈顯著負相關(guān)（表3），主要原因是MDA為高活性的脂質(zhì)過氧化物，可與脂類、核酸、糖類及蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)作用[27]而影響質(zhì)膜和葉綠體片層膜的結(jié)構(gòu)和功能，影響膜的流動性及其與酶的結(jié)合力. MDA含量可影響位于片層上的葉綠素含量[28]，因此，在砷脅迫下，從植物葉綠素含量，即從香蒲葉尖顏色的變化，判斷植株受砷脅迫的強弱程度，與韓東英等[29]在老芒麥和香根草的研究相符. 地下部GSH含量與MDA含量之間呈極顯著正相關(guān)，可能是由于在AsA-GSH循環(huán)中，AsA是一種強抗氧化劑，在APX作用下氧化為MDA，GSH將MDA的歧化物還原成AsA，使H2O2分解為H2O[24]，最終GSH含量影響MDA含量的高低.

表 3 砷脅迫下香蒲生理特性相關(guān)性分析Tab. 3 Correlation analysis of physiological characteristics of Typha angustifolia under arsenic stress

圖 2 砷脅迫下香蒲不同部位的砷質(zhì)量比Fig. 2 The content of arsenic in different parts of Typha angustifolia under arsenic stress

表 4 砷脅迫下香蒲對 As 的轉(zhuǎn)運富集Tab. 4 The arsenic bioconcentration factor and transfer factor of Typha angustifolia under arsenic stress

表 5 砷脅迫下濕地植物香蒲各生物指標(biāo)的耐性指數(shù)Tab. 5 Tolerance index of various biological indicators of Typha angustifolia under arsenic stress

表 6 各綜合指標(biāo)的系數(shù)及貢獻效率Tab. 6 The coefficient and contribution efficiency of each integrated indicators

表 7 砷脅迫下香蒲耐受性綜合評價Tab. 7 Comprehensive evaluation of Typha angustifolia under arsenic stress

重金屬積累能力的大小是修復(fù)植物選擇的一個重要指標(biāo). 香蒲不同部位砷含量，隨土壤中w(As)增加呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)，香蒲地上部砷積累濃度最大值 187.75 mg·kg?1低于 Baker等[30]提出的參考值（砷超積累植株地上部砷質(zhì)量比必須在1 000 mg·kg?1以上），說明香蒲對砷具有一定的累積能力，并非超富集. 從整體來看無論土壤中w(As)增加低或高，香蒲不同部位對砷富集能力存在差異，其大小順序為地下部＞地上部，枯葉＞新葉. 由此可見，香蒲通過地下部的吸收富集進而把砷阻隔在地下部，降低對植物地上部的危害度，香蒲將砷轉(zhuǎn)移至枯老葉部以保護植株最具生命力的器官. 砷被植物根部吸收后不易向地上部分轉(zhuǎn)運，在Bragato等[31]、Jesteban等[32]的研究中也出現(xiàn)了類似現(xiàn)象. 這種現(xiàn)象可能是由于香蒲吸收的砷大部分以難溶態(tài)形式積累在根部[33]，與根部細胞壁中的配體發(fā)生包括離子交換、吸附、絡(luò)合、沉淀和結(jié)晶在內(nèi)的多種反應(yīng)[34-35]，形成重金屬螯合物固定在液泡中，致使其向地上部分的轉(zhuǎn)移不易發(fā)生，也可能是香蒲相對氧化的根際微環(huán)境，使其根表面形成鐵膜，進而砷被強烈吸附在根部鐵膜上的原因[36].

在砷污染的湖泊河流中，陽宗海和大屯海湖濱濕地底泥中砷的富集程度為 10～81 mg·kg?1[37]和160～780 mg·kg?1[38]. 有研究表明[39]，我國水體表層底泥中 As質(zhì)量比為 4.0～980.6 mg·kg?1. 從香蒲的綜合耐受性評價來看，香蒲可在含砷低于150 mg·kg?1土壤中健康生長；高于 600 mg·kg?1土壤中，砷對香蒲的毒害效應(yīng)顯現(xiàn)，處于生長抑制狀態(tài). 結(jié)合上述砷污染河湖濕地底泥的砷污染程度，香蒲可在大部分砷污染河湖濕地底泥中生長，具有較強的耐受性，表明在砷污染河湖濱濕地及土壤治理中，香蒲具有一定的潛在應(yīng)用價值.

4 結(jié)論

（1）砷脅迫對濕地植物香蒲表現(xiàn)出低促高抑的作用；香蒲體內(nèi)葉綠素、MDA和GSH含量均呈先增加后降低的規(guī)律；且不同植物組織器官具有不同的生物學(xué)效應(yīng)，地上部對砷脅迫相對敏感，地下部抗逆性強. 香蒲對砷的防御體系中，相關(guān)指標(biāo)存在耦合關(guān)聯(lián)性，通過香蒲葉尖顏色的變化，可以判斷植株受砷脅迫的強弱程度.

（2）不同砷濃度脅迫下，其不同部位對砷的積累濃度存在差異，均反映出劑量依賴效應(yīng)，高低順序為：地下部＞地上部，枯葉＞新葉；且表現(xiàn)出不同的轉(zhuǎn)運富集能力. 植株通過阻隔砷在地下部，以降低對地上部的毒害效應(yīng)，砷被轉(zhuǎn)移至老葉枯葉部以保護植株最具生命力的器官免受傷害.

（3）香蒲對不同濃度砷脅迫下的香蒲耐受性綜合評價表明，香蒲對砷具有較強的耐受性.