三七提取物大鼠體內3種皂苷成分測定方法建立及藥代動力學研究

代秋瓊，劉紅斌，崔佳麗，趙高瓊，周藝佳，梅 晶，王京昆

(1. 云南中醫(yī)藥大學，云南 昆明 650500；2. 云南省藥物研究所，云南 昆明 650111；3. 云南白藥集團創(chuàng)新研發(fā)中心，云南 昆明 650111；4. 云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點實驗室，云南 昆明 650111)

三七提取物為三七主根、三七剪口、三七大根、三七葉、三七花等多個藥用部位混合提取后的浸膏加藥用輔料而制成的擬申報臨床的新藥，其主藥為三七. 三七味甘、微苦、性溫、歸肝、胃經(jīng)，為五加 科 人 參 屬 植 物 (Panax notoginseng(Burk) F.H.Chenion)的干燥根及根莖[1]，又名參三七、田七、山漆、金不換等，是我國著名傳統(tǒng)中藥. 三七總皂苷是其主要成分，臨床應用于心腦血管疾病以及免疫、老年癡呆、腫瘤等疾病[2-9]. 迄今為止，已從三七總皂苷（total saponins ofPanax notoginseng）中分離并鑒別出多種單體皂苷成分，如人參皂苷(Ginsenoside) Rb1、Rd、Re、Rg1和 Rg2，三七皂苷(Notoginsenoaide) R1、R2、R3和 R4等[10]. 這些成分均屬于達瑪烷型（Dammarane type）四環(huán)三萜皂苷，其中 Rg1、Rb1、R1為《中國藥典（2015版）》第一部＜三七＞質量標準控制成分，故本研究選擇Rg1、Rb1、R1作為檢測指標成分，以血漿中Rg1、Rb1、R1的質量濃度表征三七提取物在大鼠體內的暴露量[1]. 因此，本試驗針對三七提取物中的Rg1、Rb1和R1建立高專屬性、高靈敏度的HPLC-MS/MS檢測方法并對方法進行驗證，同時研究了大鼠灌胃三七提取物后上述各活性成分的血漿藥代動力學特征.

1 試驗材料

1.1 儀器Agilent 1200SLHPLC（美國安捷倫科技有限公司）；API3200 Q-Trap質譜儀（美國 AB公司）；臺式高速冷凍離心機 (Allegra 64 R，美國Beckman公司)；XW-80A渦旋混合器（上海精科實業(yè)有限公司）；MD200氮氣吹掃儀（杭州奧盛儀器有限公司）；96孔板固相萃取裝置（美國Waters）；eppendorf移液器（德國eppendorf公司）；電子天平(DV215CD，上海OHAUS公司).

1.2 試藥三七提取物（云南省藥物研究所自制）；人參皂苷 Rg1對照品（w=92.4%，批號：110703?201832，中國食品藥品檢定研究院）；人參皂苷Rb1對照品（w=91.2%，批號：110704?201827,中國食品藥品檢定研究院）；人參皂苷R1對照品（w=93.1%，批號：110745?201820，中國食品藥品檢定研究院）；鹽酸普萘洛爾(Pro)對照品（按C16H21NO2·HCl計，w=100%；批號：100783?201202，中國食品藥品檢定研究院）；甲醇、甲酸為色譜純，水為超純水.

1.3 動物6 只 SPF 級 SD 大鼠，8～9 周齡，雌雄各半，(240±40) g，北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物生產許可證號：SCXK(京)2012?0001，研究通過云南省藥物研究所實驗動物福利倫理委員會（IACUC）審查通過.

2 方法

2.1 質譜及質譜條件

2.1.1 色 譜 條 件 色 譜 柱 ： XBridge BEH C18Column（75 mm×φ4.6 mm，2.5 μm），Waters，USA；流動相A：甲醇，B：0.01%甲酸?水；梯度洗脫方式見表 1. 流速 500 μL·min?1，柱溫 20 ℃；進樣量 10 μL.

表 1 流動相梯度洗脫表Tab. 1 The gradient elution table of mobile phase

2.1.2 質譜條件 電噴霧離子源（ESI），采用正離子多反應監(jiān)測（MRM）方式進行檢測. 對質譜參數(shù)進行優(yōu)化，優(yōu)化后的質譜參數(shù)：氣簾氣(CUR)172.38 kPa， 噴 霧 電 壓 (IS)5 500.00 V， 霧 化 溫 度(TEM)650.0 ℃ ， 霧 化 氣 (GS1)413.7 kPa， 輔 助 氣(GS2)413.7 kPa，碰撞氣 (CAD)medium. 人參皂苷Rg1[M + Na]+m/z：823.40，定量/定性碎片離子m/z：203.20/643.60；人參皂苷 Rb1[M + Na]+m/z：1 131.50，定量/定性碎片離子m/z：365.10/789.20；三七皂苷R1[M + Na]+m/z：955.60，定量/定性碎片離子m/z：775.50/335.30； 鹽 酸 普 萘 洛 爾 (Pro)[M + H]+m/z：260.20，定量/定性碎片離子m/z：155.10/183.10.

2.2 儲備液和工作液的配制分別精密稱取 Rg1、Rb1、R1化學對照品各2份，置于相應25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，得Rg1、Rb1、R1質量濃度分別為0.667 4、0.613 4 mg·mL?1，0.539 2、0.513 9 mg·mL?1， 0.584 1、 0.563 0 mg·mL?1的 高 、低質量濃度標準儲備液.

上述各化合物高質量濃度儲備液用甲醇逐級稀釋得Rg1、Rb1質量濃度范圍分別為2.625～231.8 ng·mL?1、10.32～421.2 ng·mL?1的混合校正標準工作液，R1質量濃度范圍為 6.500～265.5 ng·mL?1的校正標準工作液，備用. 各校正標準工作液用于制備標準曲線.

上述各化合物低質量濃度儲備液用甲醇逐級稀釋得 Rg1、Rb1質量濃度分別為 7.660、53.60、166.1 ng·mL?1，29.82、125.2、313.2 ng·mL?1的低、中、高質量濃度混合質控標準工作液，R1質量濃度為 19.02、79.85、199.6 ng·mL?1的低、中、高質量濃度質控標準工作液，備用. 質控標準工作液用于制備質控樣品.

用甲醇為溶劑配制質量濃度為 320.0 ng·mL?1的鹽酸普萘洛爾內標工作液，備用.

2.3 三七提取物給藥制劑配制精密稱定三七提取物 3.000 8 g 置于研缽中，將 20 mL 的 5% 羧甲基纖維素鈉溶液少量多次加入并不斷研磨，直至形成質量濃度為 0.15 g·mL?1均勻混懸液. 灌胃大鼠前，充分混勻以保證給藥量準確.

2.4 三七提取物藥代動力學實驗與血樣采集動物給藥前禁食12 h以上、禁食期間自由飲水，給藥后 4 h 統(tǒng)一喂飼. 每只動物按體重以 10 mL·kg?1的給藥容積經(jīng)口灌胃給予配制好的三七提取物給藥制劑，使給藥劑量為 1.5 g·kg?1. 分別于給藥前及給藥后 5、15、30 min，1、2、4、8、24、48 h眼底靜脈叢取血 0.5 mL，3 000 r·min?1離心 15 min，分離血漿，?20 ℃下凍存、待測定.

2.5 血漿樣品的處理方法Waters Oasis μElution HLB 固相萃取板以 300 μL甲醇、300 μL 超純水順序活化，備用.

檢測Rg1、Rb1血漿樣品時的處理方法：精密吸取 40 μL 大鼠含藥血漿，渦旋混合 2 min，加入50 μL 1% 甲酸水溶液，渦旋混合 2 min，后完全轉移至已活化固相萃取板中，依序分別加200 μL超純水、200 μL 25% 甲醇淋洗，200 μL 甲醇洗脫，精密移取洗脫液 160 μL，加入 10 μL 內標工作液，渦旋混勻，15 000 r·min?1室溫離心 10 min，取上清液進行HPLC-MS/MS分析檢測.

檢測R1血漿樣品時的處理方法：精密吸取200 μL 大鼠含藥血漿，其它同“檢測 Rg1、Rb1血漿樣品時的處理方法”（上一段）.

2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用 Analyst軟件采集檢測信號并擬合標準曲線，計算血漿樣品測定值. 采用DAS 3.3.0 藥代動力學程序計算AUC0?t、AUC0?∞、t1/2MRT、VZ/F、CLZ/F等主要藥代參數(shù)，ρmax、tmax采用實測值，其它采用統(tǒng)計矩參數(shù). 其中：AUC為藥物質量濃度?時間曲線下面積，MRT為平均滯留時間，VZ/F為表觀分布容積，CLZ/F為清除率，t1/2為半衰期，ρmax為達峰質量濃度，tmax為達峰時間. 采用Excel對方法學數(shù)據(jù)以及藥代動力學數(shù)據(jù)進行計算與統(tǒng)計分析.

3 方法學驗證與結果

3.1 特異性以2.1項下的檢測條件分別進樣空白血漿樣品、空白血漿加標樣品，測定，獲得提取測定離子流圖，見圖1. 結果顯示血漿中內源性物質不影響人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1和鹽酸普萘洛爾的檢測，方法特異性良好.

圖 1 特異性考察圖譜Fig. 1 Specificity MRM chromatograms

3.2 標準曲線及定量下限精密移取 10 μL 校正標準工作液至離心管中，常溫氮氣吹干，按血漿樣品處理方法精密加入相應體積的大鼠空白血漿，渦旋混合2 min，得到不同質量濃度標準曲線樣品，處理，測定. 以檢測目標物峰面積(As)和內標峰面積(Ai)的比值為縱坐標Y，血藥質量濃度為橫坐標X，采用加權最小二乘法擬合(權重1/X2)，標準曲線測定結果見表2.

表 2 混合對照品中 Rg1、Rb1、R1 的標準曲線、線性范圍及定量下限Tab. 2 Standard curves, linear ranges and lower quantitative limits of Rg1, Rb1, and R1 in mixed reference materials

3.3 精密度與準確度連續(xù) 3 d 處理 3 批定量下限、低、中、高4個質量濃度的血漿樣品，每個質量濃度平行5份，測定結果見表3. 結果顯示，精密度與準確度結果符合生物樣品分析檢測要求.

表 3 Rg1、Rb1、R1 在大鼠血漿中的精密度、準確度（n = 5）Tab. 3 Precision and accuracy of Rg1, Rb1 and R1 in beagle dogplasma (n = 5)

3.4 基質效應取來源于6個不同批次的大鼠空白血漿，提取空白基質，常溫氮氣吹干，低、中、高質量濃度質控標準工作液及內標溶液復溶、超聲后取上清測定；隨行測定復溶液，計算基質效應. 結果顯示：Rg1、Rb1、R1低、中、高質量濃度歸一化平均基質效應(91.58±15.59)%、(94.49±2.18)%、(82.75±4.74)%；說明基質對 Rg1、Rb1、R1的影響較小，且對各質量濃度影響程度一致，滿足生物樣品分析檢測要求.

3.5 殘留率以“線性最高質量濃度點樣品?空白血漿樣品”順序交叉進樣，計算空白血漿樣品中殘留峰面積與定量下限樣品中峰面積比值評價殘留率.結果顯示Rg1、Rb1、R1殘留率范圍分別為7.97%～15.20%、0.53%～1.04%、0.60%～1.20%，均小于20%；內標鹽酸普萘洛爾殘留率范圍0.04%～0.13%，小于5%；表明進樣殘留不影響樣品的分析檢測.

3.6 穩(wěn)定性

3.6.1 標準儲備液穩(wěn)定性考察 處理、測定得到Rg1、Rb1、R1、鹽酸普萘洛爾儲備液于 2～8 ℃ 放置125 d后的峰面積與新鮮制備的標準溶液峰面積，計算兩時間點相對偏差RE值分別為5.39%、2.87%、1.14%、0.59%，結果表明上述儲備液于2～8 ℃ 至少可以放置 125 d.

3.6.2 質控樣品穩(wěn)定性考察 分別考察低、中、高質量濃度血漿質控樣品于室溫放置1 d，?10～?35 ℃ 放置 72 d 及 72 d 內凍結—融化循環(huán) 5 次的穩(wěn)定性，結果顯示上述每一考察條件下，相對標準偏差RSD均小于15%. 表明血漿質控樣品在上述考察條件下存放穩(wěn)定.

3.7 藥代動力學實驗結果采用本文所建立的檢測方法，對血漿樣品進行檢測. 血漿中Rg1、Rb1和R1的平均藥時曲線見圖2，體內主要藥動學參數(shù)見表4.

圖 2 人參皂苷 Rg1、Rb1 和三七皂苷 R1 的平均藥時曲線圖Fig. 2 Average drug time curve of ginsenoside Rg1, Rb1 and notoginsenoside R1

表 4 SD大鼠單次經(jīng)口灌胃三七提取物后血漿中人參皂苷Rb1、Rg1和三七皂苷R1的藥代動力學參數(shù)Tab. 4 Pharmacokinetic parameters of ginsenoside Rg1, Rb1 and notoginsenoside R1 in plasma of SD rats after single oral administration of Notoginseng extract

4 討論

本實驗對血漿樣品前處理進行考察，首先采用了沉淀法、固相萃取法對血漿樣品進行考察[11-12]，結果表明沉淀法的基質效應強、回收率低不能滿足生物樣品檢測要求. 固相萃取法處理后所得血漿樣品，用HPLC-MS/MS方法檢測后結果可知，受血漿內源性物質的干擾較小，其殘留率、回收率及精密度、準確度，均能達到生物樣品檢測要求，可為三七提取物的藥代動力學研究以及臨床用藥和臨床評價提供可借鑒的方法工具.

大鼠經(jīng)口單次灌胃三七提取物1 500 mg/kg后，從獲得的藥代參數(shù)結果來看，平均AUC0-t、ρmax、t1/2、MRT0-t的數(shù)值大小，Rb1＞＞ Rg1＞ R1，平均Tmax的數(shù)值大小，Rb1＞＞ R1＞ Rg1；Rg1、R1 在大鼠體內具有相似的藥代特征，吸收快、消除快；Rb1具有與Rg1、R1完全不同的藥代特征，吸收慢、消除慢；在大鼠體內Rb1血漿暴露占絕對優(yōu)勢，血漿暴露量最大，AUC0-t分別為 Rg1、R1的 204、400倍，ρmax分別為 Rg1、R1的 16、24倍；從 Rg1、Rb1和R1的表觀分布容積來看，Rb1可能主要分布于血漿中，Rg1、R1可能主要分布于組織和體液中，需要后續(xù)更深入的組織分布研究來進一步驗證.